具有包含有机磷酸酯单元的主链的聚合的染料

背景

技术领域

本发明通常涉及聚合的荧光或着色染料，及其制备方法和在各种分析方法中的用途。

已知荧光和/或着色染料特别适用于其中需要高灵敏度的检测试剂的应用。能够优先标记样品中的特定成分或组分的染料使得研究人员能够测定该特定成分或组分的存在、量和/或位置。此外，可以针对不同环境中的空间和时间分布来监控特定体系。

荧光和比色法在化学和生物学方面非常普遍。这些方法对于生物分子的存在、结构、距离、取向、络合和/或位置给出了有用的信息。此外，时间分辨的方法越来越多地用于动力学(dynamics)和动力学(kinetics)的测量。因此，已经开发了用于生物分子例如核酸和蛋白质的荧光或颜色标记的许多策略。由于生物分子的分析通常发生在水性环境中，重点是开发和使用水溶性染料。

高度荧光或着色的染料是希望的，因为这种染料的使用增加了信噪比并提供了其它相关的益处。因此，已经尝试增加来自已知荧光和/或着色基团的信号。例如，已经制备了包含两个或更多个荧光和/或着色基团的二聚和聚合物化合物，预期这样的化合物将获得更亮的染料。然而，作为分子内荧光猝灭的结果，二聚和聚合的染料没有达到期望的亮度增加。

因此，本领域需要具有增加的摩尔亮度的染料。理想地，这样的染料和生物标记物应该是强烈着色或荧光的，并且应当以各种颜色和荧光波长获得。本发明满足了这一需要并提供了进一步的相关优点。

发明概述

简而言之，本发明通常涉及可用作水溶性，荧光和/或着色的染料和/或探针的化合物，其使得能够目视检测分析物分子例如生物分子，以及其制备用试剂。还描述了使用该染料目视检测分析物分子的方法。

当前公开的染料的实施方案包括通过连接体共价连接的两个或更多个荧光和/或着色部分(例如L

本发明实施方案的水溶性，荧光或着色染料是强烈着色和/或荧光的，并且可以通过目视检查或其他方式容易地观察到。在一些实施方案中，可以在没有事先照射或者化学或酶促活化的情况下观察到化合物。如本文所述，通过适当地选择染料，可以获得各种颜色的视觉上可检测的分析物分子。

在一个实施方案中，提供了具有下式(I)的化合物

或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R

在另一个实施方案中，提供了染色样品的方法，该方法包括以当所述样品在适当的波长下照射时足以产生光学响应的量向所述样品添加结构(I)的化合物。

仍在其他实施方案中，本公开提供用于目视检测分析物分子的方法，包括：

(a)提供了结构(I)的化合物；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

所公开的其他方法包括用于目视检测生物分子的方法，所述方法包括：

(a)将结构(I)的化合物与一种或多种生物分子混合；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

其它实施方案提供了用于视觉检测分析物的方法，该方法包括：

(a)提供如本文中公开的化合物，其中R

(b)将该化合物和分析物混合，从而使靶向部分和分析物结合；和

(c)通过其可视特性检测化合物。

其他实施方案涉及包含结构(I)的化合物和一种或多种分析物分子例如生物分子的组合物。还提供了这种组合物在用于检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。

本发明的这些和其它方面将在参考以下详细的描述而显而易见。

附图简要说明

在附图中，相同的参考数字表示相似的要素。在图中要素的尺寸和相对位置不必要按照比例绘制并且这些要素的一些可以被扩大并且放置以改善附图的可读性。进一步地，所绘制的要素的特定形状不旨在传达关于特定要素的实际形状的任何信息，并且为了便于在图中的识别而被单独选择。

图1显示了包含Alexa Fluor 488部分的聚合物化合物的荧光强度(分别3×、5×和10×)。

图2A-B示出了Alexa Fluor 350部分(分别3×、5×和10×)的光谱强度和PAGE读数。

图3A-B描绘了Pacific Orange部分(分别为3×，5×和10×)的光谱强度和PAGE读数，PAGE读数可与荧光素进行比较。

图4阐明了分别使用254nm、365nm和白光的包含荧光素和Alexa Fluor 700(分别为3x，5x和10x)的聚合物化合物之间的比较。

图5显示了用UCHT-1与Pacific Orange或标记度(“DOL”)为3.3至4.76的化合物I-4的共轭物制备的样品的代表性流式细胞术读数。

图6为使用Pacific Orange对照和DOL为3.3至4.76的化合物I-4制备的样品的染色指数相对于每次测试微克的图。

图7显示了粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的种群以及信噪比的代表性图。

图8阐明了使用化合物I-4制备的样品的染色指数与信噪比的相关性(根据图5中的读数计算得出)。

图9显示了与使用Pacific Orange制备的样品相比，使用DOL为3.3-4.76的化合物I-4制备的样品的平均值染色指数。

图10是与DOL为3.3-4.76的化合物I-4相比使用Pacific Orange制备的样品的噪声图。

图11为与DOL为3.3-4.76的化合物I-4相比使用Pacific Orange制备的样品的信号图。

图12显示了使用UCHT-1与Alexa Fluor 488和具有3.46-4.40的DOL的化合物I-5的共轭物制备的样品的流式细胞术读数。

图13为使用单独Alexa Fluor 488制备的和具有3.46-4.40的DOL的化合物I-5制备的样品的染色指数相对于每次测试微克的图。

图14阐明了使用化合物I-5制备的样品的染色指数与信噪比的相关性(根据图5所示的读数计算)。

图15为使用单独Alexa Fluor 488对比具有3.46-4.40的DOL的化合物I-5制备的样品的染色指数相对于每次测试微克的图。

图16为与DOL为3.3-4.76的化合物I-5相比使用Alexa Fluor 488制备的样品的噪声图。

图17为与DOL为3.3-4.76的化合物I-5相比使用Alexa Fluor 488制备的样品的信号图。

图18描绘了使用UCHT-1与DOL为3.54-4.6的化合物I-6的共轭物制备的样品获得的流式细胞术数据。

图19显示了分别使用UCHT-1和Alexa Fluor 350、化合物I-1、化合物I-2和DOL为3.54的化合物I-6的共轭物制备的样品的流式细胞术读数。

图20显示了使用Alexa Fluor 350对照和DOL为3.54-4.6的化合物I-6制备的样品的染色指数相对于每次测试微克的图。

图21显示了使用DOL为3.54-4.6的化合物I-6，DOL为3.05-3.31的化合物I-2，DOL为3.28-3.57的化合物I-1和单独Alexa Fluor 350的对照样品制备的样品的平均值染色指数相对于每次测试微克的图。

图22显示了与用化合物I-6制备的样品的信噪比读数相关的染色指数图(由图18所示的读数计算)。

图23显示了分别使用化合物I-6、化合物I-2、化合物I-1和Alexa Fluor 350制备的样品的噪音。

图24显示了分别使用化合物I-6、化合物I-2、化合物I-1和Alexa Fluor 350制备的样品的信号。

图25显示了用UCHT-1与Pacific Orange或DOL为3.3-4.76的化合物I-4的共轭物制备的样品的额外的代表性流式细胞术读数。

图26为Pacific Orange对照和DOL为3.3-4.76的化合物I-4的染色指数相对于每次测试微克的额外的代表性图。

图27阐明了化合物I-4的染色指数与信噪比的相关性读数(由图25所示的读数计算的)。

发明详述

在以下描述中，阐述某些具体细节旨在提供对本发明多种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解本发明可以在没有这些细节的情况下实施。

除非上下文另有要求，否则在本说明书和权利要求通篇范围内，词“包含”及其变体，如，“包括”和“含有”将解释成是开放、包括性意义，即，解释为“包括但不限于”。

本说明书通篇范围内对“一个实施方案“或“某个实施方案”的谈及意指在本发明的至少一个实施方案中包括与某实施方案联系所描述的具体特点、结构或特征。因此，短语“在一个实施方案中”或“在某个实施方案中”在本说明书通篇范围内多个位置的出现并不必然地全都指相同的实施方案。另外，具体特点、结构或特征可以在一个或多个实施方案中按任何适合的方式组合。

“氨基”指-NH

“羧基”指–CO

“氰基”指-CN基团。

“甲酰基”指-C(＝O)H基团。

“羟”或“羟基”指-OH基团。

“亚胺基”指＝NH基团。

“硝基”指-NO

“氧代”指＝O取代基团。

“硫氢基”指–SH基团。

“硫代”指＝S基团。

“烷基”指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链基团，不含有不饱和度，具有1个至12个碳原子(C

“亚烷基”或“亚烷基链”指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与基团连接的直链或支链二价烃链，其不含不饱和度并且具有1个至12个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。亚烷基链通过单键与分子的其余部分连接并通过单键与残基连接。亚烷基链与分子其余部分及与残基的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中另外声明，否则亚烷基是任选取代的。

“亚烯基”或“亚烯基链”是指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与残基连接的直链或支链二价烃链，其含有至少一个碳-碳双键并且具有2个至12个碳原子，例如亚乙烯基、亚丙烯基和正亚丁烯基等。亚烯基链通过单键与分子的其余部分连接并通过双键或单键与残基连接。亚烯基链与分子其余部分及与残基的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中另外声明，否则亚烯基是任选取代的。

“亚炔基”或“亚炔基链”是指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与基团连接的直链或支链二价烃链，其含有至少一个碳-碳三键并且具有2个至12个碳原子，例如亚乙炔基、亚丙炔基和正亚丁炔基等。亚炔基链通过单键与分子的其余部分连接并通过双键或单键与残基连接。亚炔基链与分子其余部分及与残基的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中另外声明，否则亚炔基是任选取代的。

“烷基醚”指如上文定义的任何烷基，其中至少一个碳-碳键用碳-氧-碳键替换。碳-氧-碳键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以是内部的(即，C-O-C)。烷基醚包含至少一个碳氧碳键，但是可以包括多于一个碳氧碳键。例如，在烷基醚的含义内包括聚乙二醇(PEG)。除非在本说明书中另外声明，否则烷基醚基是任选取代的。例如，在一些实施方案中，烷基醚用醇或-OP(＝R

“烷氧基”指式-OR

"烷氧基烷基醚"是指式-OR

"杂烷基"是指如上所定义的烷基，其在烷基内或在烷基的终端包含至少一个杂原子(例如，N、O、P或S)。在一些实施方案中，杂原子在烷基基团内(即杂烷基包含至少一个碳-[杂原子]

"杂烷氧基"是指式-OR

“杂亚烷基”是指在亚烷基链内或在亚烷基的终端包含至少一个杂原子(例如Si、N、O、P或S)的如上所述的亚烷基。在一些实施方案中，杂原子在亚烷基链内(即，杂亚烷基包含至少一个碳-杂原子-碳键，其中x为1、2或3)。在其它实施方案中，杂原子是亚烷基的终端并且因此起到将亚烷基与分子的剩余部分连接的作用(例如，M1-H-A-M2，其中M1和M2是分子的一部分，H是杂原子和A是亚烷基)。除非在说明书中另有特别说明，杂亚烷基是任选取代的。示例性的杂亚烷基基团包括以下阐明的氧化乙烯(例如聚氧化乙烯)和“C”、“HEG”和“PEG 1K”连接基团。

以上C-连接基、HEG连接基和/或PEG 1K连接基的多聚体包括在杂亚烷基连接基的多种实施方案中。在PEG 1K连接基的一些实施方案中，n为19-25，例如n为19、20、21、22、23、24或25。多聚物可以包括例如以下结构：

其中x为0或大于0的整数，例如x为0-100(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。

“杂亚烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的如上所述的杂亚烷基。除非在说明书中另有特别说明，杂亚烯基是任选取代的。

“杂亚炔基”是指包含至少一个碳-碳三键的杂亚烷基。除非在说明书中另有特别说明，杂亚炔基是任选取代的。

“杂原子”的“杂原子连接基”是指由一个或多个杂原子组成的连接基。示例性的杂原子连接基包括选自O、N、P和S的单个原子，和多个杂原子例如具有式-P(O

“磷酸盐/酯”是指-OP(＝O)(R

“磷酸基烷基”是指–OP(＝O)(R

“磷酸基烷基醚”是指–OP(＝O)(R

“硫代磷酸盐/酯”是指-OP(＝R

“硫代磷酸基烷基”是指–OP(＝R

“硫代磷酸基烷基醚”是指–OP(＝R

“碳环”是指包含3-18个碳原子的稳定的3-至18-元芳族环或非芳族环。除非在说明书中另有特别说明，碳环可以是单环、双环、三环或四环体系，其可以包括稠合或桥连的环体系，并且可以是部分或完全饱和的。非芳族碳环基包括环烷基，而芳族碳环基包括芳基。除非在说明书中另有特别说明，碳环基是任选取代的。

“环烷基”是指具有3-15个碳原子，优选具有3-10个碳原子的稳定的非芳族单环或多环碳环，其可以包括稠合或桥连的环体系，并且其是饱和的或不饱和的，并且通过单键连接分子的剩余部分。单环环烷基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基，7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非在说明书中另有特别说明，环烷基是任选取代的。

“芳基”是指包含至少一个碳环芳环的环体系。在一些实施方案中，芳基包含6-18个碳原子。芳基环可以是单环、双环、三环或四环的环体系，其可以包括稠合或桥连的环体系。芳基包括但不限于衍生自以下的芳基：醋蒽，苊，醋菲烯，蒽，薁，苯，

“杂环”是指包含1至12个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定3-至18元芳族或非芳族环。除非在说明书中另外特别说明，杂环基可以是单环、双环、三环或四环的环体系，其可以包括稠合或桥连的环体系；和杂环中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化；氮原子可以任选地季铵化；并且杂环可以是部分或完全饱和的。芳族杂环的实例以下列于杂芳基的定义中(即杂芳基是杂环的下位组)。非芳族杂环的实例包括但不限于二氧杂环戊烷基，噻吩基[1,3]二噻烷基，十氢异喹啉基，咪唑啉基，咪唑烷基，异噻唑烷基，异噁唑烷基，吗啉基，八氢吲哚基，八氢异吲哚基，2-氧代哌嗪基，2-氧代哌啶基，2-氧代吡咯烷基，噁唑烷基，哌啶基，哌嗪基，4-哌啶酮基，吡咯烷基，吡唑烷基，吡唑并嘧啶基，奎宁环基，噻唑烷基，四氢呋喃基，三噁烷基，三硫杂环己烷基，三嗪烷基，四氢吡喃基，硫吗啉基，硫杂吗啉基，1-氧代-硫吗啉基和1,1-二氧代-硫吗啉基。除非在说明书中另外特别说明，杂环基是任选取代的。

“杂芳基”指包含1个至13碳原子、1个至6个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳环的5-至14元环体系。出于本发明某些实施方案的目的，杂芳基可以单环、双环、三环或四环的环体系，所述环体系可以包括稠合或桥连的环体系；并且杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化；氮原子可以任选地季铵化。实例包括但不限于氮杂

后缀“-亚基”是指通过单键连接至分子其余部分并通过单键连接至基团的特定结构特征(例如，烷基、芳基、杂烷基、杂芳基)。换句话说，后缀“-亚基”是指具有连接基团的结构特征的连接基。“-亚基”链与分子的其余部分和与残基的连接点可以经过链的一个原子或链中任意两个原子。例如，杂亚芳基是指包含如本文定义的杂芳基基团的连接基。

“稠合的”是指包含至少两个环的环体系，其中两个环分享至少一个共同的环原子，例如两个共同的环原子。当稠合环是杂环基环或杂芳基环时，共同的环原子可以是碳或氮。稠合环包括双环、三环、四环等。

本文所用的术语“取代的”意指上述任一基团(例如烷基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基、烷氧基、烷基醚、磷酸基烷基、磷酸基烷基醚、硫代磷酸基烷基、硫代磷酸基烷基醚、碳环、环烷基、芳基、杂环和/或杂芳基)，其中至少一个氢原子(例如1、2、3或所有氢原子)由与非氢原子形成的键替换，所述非氢原子例如但不限于：卤素原子如F、Cl、Br和I；多种基团如羟基、烷氧基和酯基中的氧原子；多种基团如硫醇基、硫代烷基、砜基团、磺酰基和亚砜基团中的硫原子；多种基团如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、二酰亚胺和烯胺中的氮原子；多种基团如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和多种其他基团中的其他杂原子。“取代的”还意指上述任一基团，其中一个或多个氢原子由与杂原子(如氧代、羰基、羧基和酯基中的氧；和多种基团如亚胺、肟、腙和腈中的氮)形成的更高级键替换(例如，双键或叁键)。例如，“取代的”包括其中一个或多个氢原子由-NR

“共轭”指一个p-轨道与另一个p-轨道跨居间的键σ键重叠。共轭可以出现在环状或非环化合物中。“共轭度”指至少一个p-轨道与另一个p-轨道跨居间的双键重叠。例如，1,3-丁二烯具有一个共轭度，而苯和其他芳族化合物一般具有多个共轭度。荧光和着色化合物一般包含至少一个共轭度。

“荧光的”指能够吸收特定频率的光并发射不同频率的光的分子。荧光是本领域普通技术人员熟知的。

“着色”指吸收有色光谱(即，红色、黄色、蓝色等)内光的分子。

“连接基”指至少一个原子(如碳、氧、氮、硫、磷及其组合)的连续链，所述连续链将分子的一部分连接至相同分子的另一个部分或连接至不同分子、部分或固体载体(例如，微粒)。连接基可以经共价键或其他方式如离子键相互作用或氢键相互作用连接分子。

术语“生物分子”指多种生物材料的任一者，所述生物材料包括核酸、碳水化合物、氨基酸、多肽、糖蛋白、激素、适配体及其混合物。更具体地，该术语意在包括而不限于RNA、DNA、寡核苷酸、修饰或衍生化的核苷酸、酶、受体、朊病毒、受体配体(包括激素)、抗体、抗原和毒素，以及细菌、病毒、血细胞和组织细胞。在本公开的一些实施方案中，如本文进一步描述，通过以下方式制备示例性的共轭物(例如，与生物分子连接的结构(I)的化合物)：使生物分子与具有反应基团的化合物接触，所述反应基团能够借助生物分子上的任何可用原子或官能团如氨基、羟基、羧基或硫氢基，使该生物分子与化合物连接。

“反应性基团”是例如能够通过置换、氧化、还原、加成或环加成反应与第二反应性基团(例如“互补反应性基团”)反应形成一个或多个共价键的基团。示例性的反应性基团在表1中提供，并且例如包括亲核试剂、亲电试剂，双烯，亲双烯体，醛，肟，腙，炔，胺，叠氮化物，酰基叠氮化物，酰卤，腈，硝酮，氢硫基，二硫化物，磺酰卤，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，活化酯，酮，α,β-不饱和羰基，烯烃，马来酰亚胺，α-卤代酰亚胺，环氧化物，氮丙啶，四嗪，四唑，膦，生物素，硫杂环丙烷等。

“生物共轭”或“生物共轭物”和相关的变体是指用于在两个分子之间形成稳定的共价键的化学反应策略。当分子之一是生物分子(例如，抗体)时，通常使用术语“生物共轭”，但是可以用于描述与非生物分子(例如，聚合物树脂)形成共价键。由这种反应策略得到的产物或化合物是“共轭物”、“生物共轭物”或等同物。

术语“可视的”和“目视可检测的”在本文中用来指没有事先照射后或化学活化或酶促活化情况下通过视检可观察的物质。这类目视可检测的物质在范围从约300nm至约900nm的光谱区吸收并发光。优选地，这类物质强烈着色，优选地具有至少约40,000、更优选地至少约50,000、仍然更优选地至少约60,000、仍更优选地至少约70,000和最优选地至少约80,000M

为了本发明的目的，术语“光稳定的可视染料”指如上文所定义那样目视可检测并且当暴露于光时没有显著改变或分解的化学部分。优选地，在暴露于光至少1小时后，光稳定的可视染料不显示明显的漂白作用或分解。更优选地，在暴露于光至少12小时、仍然更优选地至少24小时、然而仍更优选地至少1周和最优选地至少1个月后，可视染料稳定。适用于本发明化合物和方法中的光稳定可视染料的非限制性例子包含偶氮染料、硫靛染料、喹吖啶酮颜料、二

如本文所用，术语“二萘嵌苯衍生物”意在包括目视可检测的任何取代的二萘嵌苯。但是，该术语不意在包括二萘嵌苯本身。类似地使用术语“蒽衍生物”、“萘衍生物”和“芘衍生物”。在一些优选的实施方案中，衍生物(例如，二萘嵌苯衍生物、芘衍生物、蒽衍生物或萘衍生物)是二萘嵌苯、蒽、萘或芘的酰亚胺、双酰亚胺或肼酰亚胺的衍生物。

本发明的各个实施方案的目视可检测生物分子可用于广泛类型的分析应用，例如生物化学和生物医学应用，其中需要确定特定分析物(例如生物分子)的存在、位置或量。在另一个方面，因此，本发明提供用于目视检测生物分子的方法，包括：(a)向生物体系提供包含与生物分子连接的结构(I)的化合物的目视可检测生物分子；并且(b)通过其可视特性检测生物分子。出于本发明的目的，短语“通过其可视特性检测生物分子”意指在没有照射或酶促活化的情况下用肉眼或借助基于光学的检测装置观察生物分子，所述检测装置包括而不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪。光密度计可以用来对存在的目视可检测生物分子的量定量。例如，可以通过测量相对光学密度确定两份样品中生物分子的相对量。如果已知染料分子/生物分子的化学计量并已知染料分子的消光系数，则也可以从光学密度的量值确定生物分子的绝对浓度。如本文所用的，术语“生物体系”是用来指除目视可检测生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。这类生物体系的非限制性例子包括细胞、细胞提取物、组织样品、电泳凝胶、分析混合物和杂交反应混合物。

“固体载体”或“固体载体残基”是指在本领域已知的用于分子固相负载的任何固体基材，例如“微粒”是指可用于与本发明化合物连接的众多小颗粒的任一个，包括但不限于玻璃珠、磁珠、聚合物珠、非聚合物珠等。在某些实施方案中，微粒包含聚苯乙烯珠。

“靶向部分”是与特定靶标例如分析物分子选择性结合或缔合的基团。“选择性地”结合或缔合是指靶向部分相对于其他靶标优先与所需靶标缔合或结合。在一些实施方案中，本文公开的化合物包括与靶向部分的连接，以选择性地使化合物与感兴趣的分析物(即，靶向部分的靶标)结合或缔合，从而允许检测分析物。示例性的靶向部分包括但不限于抗体、抗原、核酸序列、酶、蛋白质、细胞表面受体拮抗剂等。在一些实施方案中，靶向部分是诸如抗体的基团，其选择性地结合或缔合细胞上或细胞内的靶标特征，例如细胞膜或其他细胞结构上的靶标特征，从而允许检测感兴趣的细胞。在某些实施方案中，与期望的分析物选择性结合或缔合的小分子也被认为是靶向部分。本领域技术人员将理解其它分析物，和相应的靶向部分，其在多种实施方案中将是有用的。

“碱基配对部分”指能够借助氢键与互补性杂环部分杂交的杂环部分(例如，Watson-Crick碱基配对)。碱基配对部分包括天然碱基和非天然碱基。碱基配对部分的非限制性例子是RNA和DNA碱基，如腺苷、鸟苷、胸苷、胞嘧啶和尿苷及其类似物。

本文公开的发明的实施方案还意在涵盖通过一种或多种原子由具有不同原子质量或质量数的原子替换而进行同位素标记的所有化合物。可以掺入所公开化合物的同位素的例子分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，如

同位素标记的结构(I)的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文和以下实施例中所述的那些相似的方法，使用适宜的同位素标记试剂而非先前所用的非标记试剂来制备。

“稳定化合物”和“稳定结构”意指这样的化合物，所述化合物充分稳健以承受从反应混合物分离至有用纯度和配制成有效治疗剂。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或环境可能出现或可能不出现，并且这种描述包括其中所述事件或环境出现的情况及其中它不出现的情况。例如，“任选取代的烷基”意指烷基可以是取代的或可以是未取代的并且该描述包括取代的烷基和没有取代的烷基。

“盐”包括酸加成盐和碱加成盐。

“酸加成盐”指与无机酸和与有机酸形成的那些盐，所述无机酸例如是但不限于氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如是但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、粘酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、酒石酸、硫氰酸、对-甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等。

“碱加成盐”指从添加无机碱或有机碱至游离酸所制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺和碱性离子交换树脂，如氨、异丙胺、氨丁三醇、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、地阿诺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、苯那明、苄星、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、氨丁三醇、二环己胺、胆碱和咖啡因。

结晶可以产生本文描述的化合物的溶剂化物。本发明的实施方案包括所描述化合物的全部溶剂化物。如本文所用，术语“溶剂化物”指包含一种或多种分子的本发明化合物与一种或多种分子的溶剂的聚集体。溶剂可以是水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。可选地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式。本发明的化合物可以是真溶剂化物，而在其他情况下，本发明的化合物可以仅保留外来水或其他溶剂或者是水和一些外来溶剂的混合物。

本发明化合物(例如结构I的化合物)或其盐、互变异构体或溶剂化物的实施方案可以含有一个或多个立构中心和可以从而产生对映体、非对映体和其它立体异构形式，其在绝对立体化学方面可以定义为(R)-或(S)-或者对于氨基酸的(D)-或(L)-。本发明的实施方案意在包括全部所述可能异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以用手性合成子或手性试剂制备，或用常规技术例如色谱法和分步结晶拆分。用来制备/分离单独对映体的常规技术包括从适宜的光学纯前体手性合成或者用例如手性高压液体色谱法(HPLC)拆分外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)。在本文描述的化合物含有烯式双键或其它几何不对称中心的情况下，并且除非另有指定，期望的是化合物包括E和Z几何异构体。类似地，也期望包括全部互变异构体形式。

“立体异构体”指由通过相同键键合的相同原子构成的化合物，但是具有不可互换的不同三维结构。本发明预期各种立体异构体及其混合物和包括"对映体"，其是指两个立体异构体，其分子是彼此不可重叠的镜像。

“互变异构体”指质子从分子的一个原子移动至同一分子的另一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。化合物的多种互变异构形式可由本领域普通技术人员容易地衍生。

使用ACD/命名9.07版软件程序和/或ChemDraw第11.0版软件命名程序(CambridgeSoft)，本文所用的化学命名方案和结构简图是I.U.P.A.C.命名系统的修饰形式。还使用本领域普通技术人员熟悉的通用名。

如上文所示，在本发明的一个实施方案中，提供了在多种分析方法中可用作荧光和/或着色染料的化合物。在其它实施方案中，提供了用于制备可用作荧光和/或着色染料的化合物的用作合成中间体的化合物。一般来说，本发明的实施方案涉及荧光和/或着色部分的二聚体和更高级的聚合物。荧光和/或着色部分通过连接基连接。不希望被理论束缚，据信连接基帮助维持荧光和/或着色基团之间足够的空间距离使得分子内淬灭降低或消除，因此产生了具有高摩尔“亮度”的染料化合物(例如高荧光发射)。

因此，在一些实施方案中，化合物具有以下结构(A)：

其中L是足以维持一个或多个(例如，每一个)M

在不同的实施方案中，该化合物具有以下结构(B)：

其中L是足以维持一个或多个(例如，每一个)M

在其它实施方案中，提供给了具有以下结构(I)的化合物：

或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：

M

L

L

L

R

R

R

R

R

R

R

R

Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团或其保护形式的部分；

L'在每次出现时独立地为包含连接至Q的共价键的连接基，包含连接至靶向部分的共价键的连接基，包含连接至分析物分子的共价键的连接基，包含连接至固体载体的共价键的连接基，包含连接至固体载体残基的共价键的连接基，包含连接至核苷的共价键的连接基或包含连接至结构(I)的其它化合物的共价键的连接基；

m在每次出现时为1或更大的整数，

n为1或更大的整数；

q和w在每次出现时独立地为0或1，条件是q和w在每次出现时均不为0；和

M

在结构(I)的化合物中各种连接基和取代基(例如，M

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在其它实施方案中，L

任选的连接基L

因此，在一些实施方案中，L

在其它实施方案中，对于L

在更多实施方案中，对于L

仍然在其它实施方案中，对于L

其中L

在不同的实施方案中，对于L

其中L

在前述各种实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在仍然其它实施方案中，对于L

其中L

在不同的实施方案中，对于L

其中L

在前述多种实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在仍然其它不同的结构(I)的实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在仍然其它不同的结构(I)的实施方案中，L

在一些相关的实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在一些相关的实施方案中，L

在一些实施方案中，L

其中

a、b和c各自独立地为1-6的整数。

在一些实施方案中，L

其中

a、b和c各自独立地为1-6的整数。

在一些实施方案中，L

在仍然其它不同的结构(I)的实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在某些实施方案中，L

在某些实施方案中，L

在某些实施方案中，L

在某些实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，L

在前述实施方案的一些中，杂亚烷基(例如L

其中

z为20-30的整数。在某些实施方案中，平均值z为23。在某些实施方案中，平均值z为24。在某些实施方案中，平均值z为25。在某些实施方案中，平均值z为26。在某些实施方案中，平均值z为27。在一些实施方案中，平均值z为21、22、23、24或25。在一些实施方案中，z为24或25。在一些实施方案中，平均值z为21、22、23、24、25、26或27。

在一些实施方案中，L

其中

q'为1-20的整数；和

z为1-100的整数。

在前述实施方案的一些中，z为3-6的整数。在一些实施方案中，z为22-26的整数，例如22、23、24、25或26。在一些更具体的实施方案中，平均值z为23或24。在一些实施方案中，z为24或25。在一些实施方案中，平均值z为21、22、23、24、25、26或27。

在前述实施方案的一些中，q'为1。在其它实施方案中，q'为2至9。

在一些实施方案中，R

在一些结构(I)的实施方案中，q至少一次出现时为0。在一些结构(I)的实施方案中，q在每次出现时为0。在一些相关的实施方案中，该化合物具有以下结构(Ia)：

在一些其它实施方案中，该化合物具有以下结构(Ib)或(Ic)之一：

其中:

L

在一些实施方案中，该化合物具有以下结构(Id)或(Ie)之一：

其中：

z为1-100的整数。

在一些实施方案中，z为24或25。在一些实施方案中，平均值z为21、22、23、24、25、26或27。

在一些实施方案中，L

在一些结构(I)的实施方案中，m至少一次出现时为0。在一些结构(I)的实施方案中，m在每次出现时为0。在一些相关的实施方案中，该化合物具有以下结构(If)之一：

在一些更具体的实施方案中，该化合物具有以下结构(Ig)或(Ih)之一：

在一些更具体的实施方案中，该化合物具有以下结构(Ij)或(Ik)之一：

其中，

z在每次出现时独立地为1-100的整数；和

p在每次出现时独立地为0或更大的整数。

在一些结构(Ij)或(Ik)的实施方案中，z至少一次出现时为3-6。在一些结构(Ij)或(Ik)更具体的实施方案中，z在每次出现时为3-6。例如，在前述实施方案的一些中，z为3或z为6。在一些实施方案中，z为24或25。在一些实施方案中，平均值z为21、22、23、24、25、26或27。

在一些结构(Ij)或(Ik)的实施方案中，p至少一次出现时为1-20。在一些结构(Ij)或(Ik)的更具体的实施方案中，p在每次出现时为1-20。例如，在前述实施方案的一些中，p为2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些结构(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)或(Ik)的前述实施方案中，L

在一些结构(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)或(Ik)的更具体的实施方案中，L

在结构(I)的一些实施方案中，w至少一次出现时为0。在结构(I)的一些实施方案中，w在每次出现时为0。在一些相关的实施方案中，该化合物具有以下结构(Im)之一：

在一些更具体的实施方案中，该化合物具有以下结构(In)：

其中:

s在每次出现时独立地为0或更大的整数；

z在每次出现时独立地为1-100的整数；

p在每次出现时独立地为0或更大的整数；和

L

在一些实施方案中，z为6和p为3。在一些实施方案中，平均值z为21-25，例如21、22、23、24或25。在一些实施方案中，z为3。在一些实施方案中，z为24或25。在一些实施方案中，平均值z为21、22、23、24、25、26或27。在一些实施方案中，z为25和s为4。在一些实施方案中，z为25，s为4和n为1。

在前述实施方案的一些中，L

在一些结构(Im)或(In)的更具体的实施方案中，L

在结构(Im)或(In)的不同的实施方案中，L

在结构(In)或(Io)的一些实施方案中，L

在结构(Im)或(In)的前述实施方案的一些中，L

在结构(Im)或(In)的一些更具体的实施方案中，L

在结构(Im)或(In)的不同的实施方案中，L

在结构(In)或(Io)的一些实施方案中，L

在前述实施方案的一些中，L

在前述结构(In)或(Io)的实施方案的一些中，杂亚烷基(例如L

其中

z为20-30的整数。在某些实施方案中，平均值z为24或25。在一些实施方案中，平均值z为21、22、23、24、25、26或27。

在结构(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)或(Io)的任一化合物的仍然其它实施方案中，R

其中R

在结构(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)或(Io)的任一化合物的其它实施方案中，R

在其它多种实施方案中，R

在结构(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)或(Io)的任一前述化合物的仍然更不同的实施方案中，R

在其它实施方案中，R

连接基L'可以是任何适于将Q、靶向部分、分析物(例如分析物分子)、固体载体、固体载体残基、核苷或结构(I)的另外的化合物连接至结构(I)的化合物的连接基。有利地，某些实施方案包括使用所选的L'部分以增加或优化化合物的水溶解性。在某些实施方案中，L'为杂亚烷基基团。在一些其它某些实施方案中，L'包含环氧烷或磷二酯基团，或其组合。

在某些实施方案中，L'具有以下结构：

其中：

m”和n”独立地为1-10的整数；

R

L”为R

在一些实施方案中，m”为4-10的整数，例如4、6或10。在其它实施方案中，n”为3-6的整数，例如3、4、5或6。在一些实施方案中，n”为18-28的整数，例如21-23。

在一些其它实施方案中，L”为亚烷基、亚烷基杂亚环基、亚烷基杂亚环基亚烷基、亚烷基亚环基、亚烷基亚环基亚烷基、杂亚烷基、杂亚烷基杂亚环基、杂亚烷基杂亚环基杂亚烷基、杂亚烷基亚环基或杂亚烷基亚环基杂亚烷基部分。在一些其它某些实施方案中，L”包含环氧烷、磷二酯部分、氢硫基、二硫化物或马来酰亚胺部分或其组合。

在前述实施方案的某些中，靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。

在结构(I)的任一前述化合物的其它更具体的实施方案中，R

在任一前述结构(I)的化合物的其它更具体的实施方案中，R

结构(I)的化合物的某些实施方案可以根据类似于制备寡核苷酸的本领域已知的固相合成方法来制备。因此，在一些实施方案中，L'是与固体载体、固体载体残基或核苷的连接基。包含活化的脱氧胸苷(dT)基团的固体载体是容易获得的，并且在一些实施方案中可以用作制备结构(I)的化合物的原料。因此，在一些实施方案中，R

本领域的技术人员将理解，仅出于易于合成和经济效率的目的而包括上述dT基团，而不是必需的。可以使用其他固体载体，并且会导致L'上存在不同的核苷或固体载体残基，或者可以在合成后去除或修饰核苷或固体载体残基。

仍然在其它实施方案中，Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团的部分。在其它实施方案中，Q在每次出现时独立地为包含能够与互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团的部分。例如，在一些实施方案中，Q′存在于结构(I)的另外的化合物上(例如在R

不限制Q基团的类型和Q基团与结构(I)的化合物的剩余部分的连接，条件是Q包含对于形成所需键具有适当反应性的部分。

在某些实施方案中，Q是在水性条件下不易水解的部分，但是具有足够的反应性以与分析物分子或固体载体上的相应基团(例如胺、叠氮化物或炔)形成键。

结构(I)的化合物的某些实施方案包含通常在生物共轭领域采用的Q基团。例如，在一些实施方案中，Q为包含亲核反应性基团，亲电子反应性基团或环加成反应性基团。在一些更具体的实施方案中，Q为或包含氢硫基、二硫化物、活化酯、异硫氰酸酯、叠氮化物、炔、烯、二烯、亲二烯体、酰卤、磺酰卤、膦、α-卤代酰亚胺、生物素、氨基或马来酰亚胺的基团。在一些实施方案中，活化酯为N-琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯或多氟苯基酯。在其它实施方案中，炔是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。

可以方便地以保护的形式提供Q基团以增加储存稳定性或其他所需的性质，然后在适当的时间去除保护基团以与例如靶向部分或分析物结合。因此，Q基团包括反应性基团的“保护形式”，包括上述和下表1中的任何反应性基团。Q的“保护形式”是指在预定反应条件下相对于Q具有较低反应性的部分，但在优选不降解或不与结构(I)化合物的其他部分反应的条件下可以转化为Q。本领域的技术人员可以基于特定的Q以及所需的最终使用和存储条件来得出适当的Q的受保护形式。例如，当Q为SH时，Q的保护形式包括二硫键，可以使用公知的技术和试剂将其还原以揭示SH部分。

在下表1中提供了示例性的Q基团。

应当注意到，在一些实施方案中，其中Q为SH，SH部分将旨在与例如在另一个结构(I)的化合物上的另一个氢硫基形成二硫键。因此，一些实施方案包括结构(I)的化合物，其是以二硫二聚体的形式，二硫键衍生自SH Q基团。

在某些实施方案的范围内还包括结构(I)的化合物，其中R

其中:

R

L”为包含由Q部分与相应的Q'部分的反应得到的官能团的连接基；和

α为大于1的整数，例如1-100，或1-10。

结构(I')的化合物可通过本领域技术人员例如通过二聚或聚合本文提供的结构(I)的化合物导出。

在其它实施方案中，Q部分方便地被掩蔽(例如被保护)为二硫化物部分，其随后可被还原以提供活化的Q部分用以结合至所需的分析物分子或靶向部分。例如，Q部分可以被掩蔽为具有以下结构的二硫化物：

其中R为任选取代的烷基。例如，在一些实施方案中，提供Q作为具有以下结构的二硫化物部分：

其中n为1-10的整数。

在一些其它实施方案中，R

荧光强度也可以通过选择变量n、m、q、p、s和w的不同的值调节。在某些实施方案中，n为1-100的整数。在其它实施方案中，n为1-10的整数。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，n为5。在一些实施方案中，n为6。在一些实施方案中，n为7。在一些实施方案中，n为8。在一些实施方案中，n为9。在一些实施方案中，n为10。

在某些实施方案中，m为1-100的整数。在其它实施方案中，m为7-12的整数。在一些实施方案中，m为20-26的整数。在一些实施方案中，m为3-6的整数。在一些实施方案中，m为3。在一些实施方案中，m为4。在一些实施方案中，m为5。在一些实施方案中，m为6。在一些实施方案中，m为7。在一些实施方案中，m为8。在一些实施方案中，m为9。在一些实施方案中，m为10。在一些实施方案中，m为11。

在某些实施方案中，w为1-100的整数。在其它实施方案中，w为7-12的整数。在一些实施方案中，w为20-26的整数。在一些实施方案中，w为3-6的整数。在一些实施方案中，w为3。在一些实施方案中，w为4。在一些实施方案中，w为5。在一些实施方案中，w为6。在一些实施方案中，w为7。在一些实施方案中，w为8。在一些实施方案中，w为9。在一些实施方案中，w为10。在一些实施方案中，w为11。

在某些实施方案中，p为1-100的整数。在其它实施方案中，p为7-12的整数。在一些实施方案中，p为20-26的整数。在一些实施方案中，p为3-6的整数。在一些实施方案中，p为3。在一些实施方案中，p为4。在一些实施方案中，p为5。在一些实施方案中，p为6。在一些实施方案中，p为7。在一些实施方案中，p为8。在一些实施方案中，p为9。在一些实施方案中，p为10。在一些实施方案中，p为11。

在某些实施方案中，s为1-100的整数。在其它实施方案中，s为7-12的整数。在一些实施方案中，s为20-26的整数。在一些实施方案中，s为3-6的整数。在一些实施方案中，s为3。在一些实施方案中，s为4。在一些实施方案中，s为5。在一些实施方案中，s为6。在一些实施方案中，s为7。在一些实施方案中，s为8。在一些实施方案中，s为9。在一些实施方案中，s为10。在一些实施方案中，s为11。

在某些实施方案中，q为1-100的整数。在其它实施方案中，q为7-12的整数。在一些实施方案中，q为20-26的整数。在一些实施方案中，q为3-6的整数。在一些实施方案中，q为3。在一些实施方案中，q为4。在一些实施方案中，q为5。在一些实施方案中，q为6。在一些实施方案中，q为7。在一些实施方案中，q为8。在一些实施方案中，q为9。在一些实施方案中，q为10。在一些实施方案中，q为11。

M

M

在一些实施方案中，M

仍然在其它任何前述实施方案中，M

在一些实施方案中，M

在任意前述结构(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ih)、(Ij)、(Ik)、(Im)、(In)或(I')的化合物的其它实施方案中，M

仍然在前述任何更多的实施方案中，M

在前述一些甚至更具体的实施方案中，M

仍然在任何前述更多的实施方案中，M

在一些实施方案中，M

虽然包含羧酸基团的M

在一些其它实施方案中，M

在一些实施方案中，M

在一些实施方案中，M

为了便于阐明，分别以阴离子或质子化状态描述了包含羧基/羧酸根和/或硫酸根/磺酸部分的各种化合物(例如-CO

在某些实施方案中，-L

在一些实施方案中，-L

在一些具体的实施方案中，该化合物为选自表2的化合物。表2中的化合物是根据实施例中所述的步骤并使用本领域已知的技术(例如自动DNA合成)制备的，并且通过质谱法确认了它们的身份。

如贯穿本申请使用的，F、F′和F″分别是指具有以下结构的荧光素部分：

在一些实施方案中，M

如贯穿本公开内容所使用的，dT是指以下结构：

其中:

R为H或直接键。在一些实施方案中，R

如贯穿本公开内容所使用的，B和B'分别是指以下结构：

在一些实施方案中，M

如贯穿本公开内容所使用的，T是指以下结构：

在具体的实施方案中，M

如贯穿本公开内容所使用的，C是指以下结构：

在一些实施方案中，M

如贯穿本公开内容所使用的，Y是指以下结构：

在一些实施方案中，M

如贯穿本公开内容所使用的，A是指以下结构：

在一些实施方案中，M

如贯穿本公开内容所使用的，P

在一些实施方案中，M

如贯穿本公开内容所使用的，P

在一些实施方案中，M

如贯穿本公开内容所使用的，A

在一些实施方案中，M

一些实施方案包括任何前述化合物，包括表2中提供的具体化合物，其共轭至靶向部分，例如抗体。

本公开总体上提供相对于较早的已知化合物具有增加的荧光发射的化合物。因此，某些实施方案涉及包含n'个荧光部分M

在一些实施方案中，该荧光化合物的至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的峰值荧光发射相比于单个M

在一些实施方案中，n'为2-100的整数，例如2-10。

在一些实施方案中，n'个M

在其它实施方案中，单个M

在一些其它实施方案中，n'个M

其中

在其它实施方案中，单个M

在其它实施方案中，峰值荧光发射在约500至约550nm的波长范围内。

在仍然更多的实施方案中，荧光化合物包含至少一个环氧乙烷基团。还提供了包含权利要求的任一项的荧光化合物和分析物的组合物。

目前公开的化合物是“可调的”，是指通过在任何前述化合物中适当选择变量，本领域技术人员可以得到具有所需和/或预先确定的摩尔荧光(摩尔亮度)的化合物。化合物的可调性允许用户容易地获得用于特定实验或用于识别特定关注的分析物的具有所需荧光和/或颜色的化合物。虽然所有的变量可以对于化合物的摩尔荧光具有影响，据信合当选择L

在某些实施方案中，摩尔荧光可以相对于亲本荧光团(例如单体)的荧光发射倍数增加或降低来表示。在一些实施方案中，本发明化合物的摩尔荧光相对于亲本荧光团为1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或甚至更高。各种实施方案包括通过适当选择M

为了便于阐明，包含磷部分的多种化合物(例如磷酸盐/酯等)以阴离子状态描述(例如-OPO(OH)O

在各种其他实施方案中，提供了包含任何前述化合物(例如结构(I)的化合物)和一种或多种分析物分子(例如生物分子)的组合物。在一些实施方案中，还提供了这类组合物在用于检测一种或多种分析物分子的分析方法中的用途。

仍然在其它实施方案中，化合物可用于多种分析方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了染色样品的方法，所述方法包括：以当所述样品在适当的波长下照射时足以产生光学响应的量向所述样品添加结构(I)的化合物，例如其中R

在前述方法的一些实施方案中，R

在前述方法的另外其他实施方案中，R

在甚至更多的实施方案中，所述光学响应是荧光响应。

在其他实施方案中，所述样品包括细胞，并且一些实施方案进一步包括通过流式细胞术观察所述细胞。

在仍然更多的实施方案中，该方法进一步包括区分所述荧光响应与具有可检出不同光学特性的第二荧光团的荧光响应。

在其他实施方案中，本公开提供用于目视检测分析物分子例如生物分子的方法，包括：

(a)提供结构(I)的化合物，例如其中R

(b)通过其可视特性检测化合物。

在一些实施方案中，分析物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在仍然更多的实施方案中，分析物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在其他实施方案中，提供用于目视检测分析物分子例如生物分子的方法，所述方法包括：

(a)将任一种前述化合物与一种或多种分析物分子混合；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

在其它实施方案中，提供了用于目视检测分析物分子的方法，该方法包括：

(a)将结构(I)的化合物与分析物分子混合，其中R

(b)形成该化合物和分析物分子的共轭物；和

(c)通过其可视特性检测该共轭物。

其它示例性的方法包括用于检测分析物的方法，该方法包括：

(a)提供结构(I)的化合物，其中R

(b)将该化合物和分析物混合，从而将靶向部分和分析物结合；和

(c)通过其可视的或荧光特性检测该化合物。

在前述方法的某些实施方案中，该分析物是颗粒，例如细胞，并且该方法包括使用流式细胞术。例如，可以为化合物提供靶向部分，例如抗体，以选择性地与所需细胞结合，从而使细胞可以通过多种技术检测，例如可见光或荧光检测。取决于所需的最终用途，本领域普通技术人员可以选择适当的抗体。在某些实施方案中使用的示例性抗体包括UCHT-1和MOPC-21。

因此，本发明化合物的实施方案可用于许多方法中，包括但不限于：细胞计数；细胞分类；生物标记物检测；量化细胞凋亡；确定细胞活力；鉴定细胞表面抗原；确定总DNA和/或RNA含量；鉴定特定的核酸序列(例如作为核酸探针)；以及诊断疾病，例如血液癌。

除了以上方法以外，结构(I)的化合物的实施方案在多种学科和方法中找到实用性，包括但不限于：在内窥镜检查步骤中成像以识别生癌的组织和其他组织；单细胞和/或单分子分析方法，例如使用少量放大或不放大检测多核苷酸；癌症成像，例如在结构(I)的化合物中包括优先与癌细胞结合的靶向部分，例如抗体或糖或其它部分；在外科手术步骤中成像；结合组蛋白以识别多种疾病；药物递送，例如通过使活性药物部分替换结构(I)化合物中的M

可以理解，如上述的结构(I)化合物的任何实施方案和本文对结构(I)化合物中变量R

可以理解，在本说明书中，允许所述式的取代基和/或变量的组合，只要这类组合产生稳定的化合物。

本领域技术人员还将领会，在本文所述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要通过合适的保护基保护。这类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的合适保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。氨基、脒基和胍基的合适保护基包括叔丁氧羰基、苄氧基羰基等。巯基的合适保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧苄基、三苯甲基等。羧酸的合适保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据本领域技术人员已知和如本文所述的标准技术添加或去除保护基。保护基的用途是在Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),3rdEd.,Wiley中详述。如本领域技术人员将理解的是，保护基也可以是聚合物树脂如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。

另外，可以借助本领域技术人员已知方法通过用适宜的无机或有机碱或酸处理，将本发明的以游离碱或酸形式存在的所有化合物转化成它们的盐。可以通过标准技术，将本发明化合物的盐转化成它们的游离碱或酸形式。

以下反应方案阐明了制备本发明化合物的示例性方法。可以理解，本领域技术人员可以能够通过相似的方法或通过组合本领域技术人员已知其他方法制备这些化合物。还应当理解，通过使用适宜的起始组分并根据需要修改合成的参数，本领域技术人员将能够以如下文描述的相似方式制备下文没有具体描述的其他的结构(I)化合物。通常而言，起始组分可以从多种来源如SigmaAldrich、LancasterSynthesis,Inc.、Maybridge、MatrixScientific、TCI和FluorochemUSA等获得或根据本领域技术人员已知的来源(参见，例如Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第5版(Wiley,December 2000))合成或如本发明中所述那样制备。

反应方案I

反应方案I阐明了用于制备可用于制备结构(I)化合物的中间体的示例性方法。参考反应方案I，其中L

额外地，本公开内容的化合物可以根据PCT Pub.Nos.WO 2016/183185；WO 2017/173355和WO 2017/177065中描述的方法制备，其每一个通过引用并入本文。

结构(I)的化合物可由结构b通过在熟知的自动的DNA合成条件下与具有以下结构(c)的亚磷酰胺化合物反应制备：

其中L独立地为任选的连接基。DNA合成方法是本领域熟知的。简言之，两个醇基团，例如以上中间体b中的R

例如，在(c)的一些实施方案中，连接基L具有以下结构之一：

其中:

L

用于低聚方法中的亚磷酰胺的制备也是本领域熟知的。例如，伯醇(例如以上反应方案1中的R

结构(I)的化合物根据上述熟知的亚磷酰胺化学通过中间体b和c的低聚制备。将所需数目的n重复单元通过重复亚磷酸铵偶联所需数目的次数并入到分子中。应当理解，如以下所描述的结构(II)的化合物可以通过类似的方法制备。

在多种其它实施方案中，提供了可用于制备结构(I)化合物的化合物。这样的化合物可以以单体、二聚体和/或低聚体的形式如上制备并且随后M

或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：

G

L

L

L

R

R

R

R

R

R

R

R

Q在每次出现时独立地为包含反应性基团的部分，或其被保护的形式，其能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补性反应性基团Q′形成共价键；

L'在每次出现时独立地为包含连接至Q的共价键的连接基，包含连接至靶向部分的共价键的连接基，包含连接至分析物分子的共价键的连接基，包含连接至固体载体的共价键的连接基，包含连接至固体载体残基的共价键的连接基，包含连接至核苷的共价键的连接基或包含连接至结构(I)的另外化合物的共价键的连接基；

m在每次出现时为1或更大的整数；

n为1或更大的整数；

q和w在每次出现时独立地为0或1，条件是q和w二者在每次出现时均不为0。

在结构(II)的其它实施方案中，G

在结构(II)的化合物中的G

例如，在一个实施方案中提供了结构II的化合物，例如其中该化合物具有以下结构II-1：

在一些实施方案中，平均值n为约24。在一些实施方案中，平均值n为约25。在一些实施方案中，平均值n为约23。

在前述实施方案中，结构II的化合物可以与一种或多种以下化合物反应以得到结构I的化合物(例如结构I的化合物，如表2中所示)：

提供以下实施例用于解释说明的目的，而不是限制。

实施例

一般方法

使用MassLynx4.1采集软件，在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS(仅以MS模式)系统上进行质谱分析。在染料上用于LC/MS的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)，8.6mM三乙胺(TEA)，pH8。还使用具有保持在45℃的2.1mmx50mm Acquity BEH-C

除非另有说明，所有反应均在氮气气氛下在烘箱干燥的玻璃器皿中进行。可商购的DNA合成试剂购自Glen Research(Sterling，VA)。无水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二异丙基乙胺、三乙胺、乙酸、吡啶和THF购自Aldrich。所有其他化学药品均购自Aldrich或TCI，无需进一步纯化即可直接使用。

实施例1

化合物II-1的合成

起始材料

固相合成

使用标准DNA合成技术(即DMT保护的2-氰基乙基亚磷酰胺)，通过固相载体在DNA合成仪(AKTA OligoPilot 100)上制备化合物II-1，规模为14-200μmol。用氢氧化铵(例如28-30％，在55℃下3小时)从固体载体上去除聚合物，并冻干成糊剂。合成的结果概述在下表中：

实施例2

结构I化合物的合成

将实施例1的化合物与所需的染料分子偶联，得到结构I的化合物。从胺连接基上除去Fmoc保护基(例如，在DMF中使用哌啶)，然后使化合物II-1与适当活化染料分子(即NHS-酯)反应。用于合成的试剂根据以下步骤制备。

原液制备

硼酸盐缓冲液在250mM，pH 10下制备

染料-NHS溶液在350mM下制备(300mg，1.35mL，25:75的DMSO：乙腈)

染料偶联反应

在装有磁力搅拌棒的50mL离心管中放入水、硼酸盐缓冲液、化合物II-1聚合物溶液、乙腈、三乙胺和染料-NHS溶液。将管包裹在铝箔中，并将混合物在室温下搅拌过夜。根据下表4，使用染料-NHS化合物提供所需的产物：

尺寸排除过滤

向Amicon Ultra-15离心过滤器(Millipore UFC900324，截留MW＝3000)中加入1mL水。将来自染料偶联反应的粗制反应物(4.5mL)添加到过滤装置中。将反应容器用4mL100mM NaOH冲洗2次，并将冲洗液转移到过滤装置中。过滤装置以最大速度(3220g，旋转桶，30分钟)离心。除去滤液，并用另外的10mL的100mM NaOH处理渗余物。如前所述将过滤装置离心。再次，除去滤液，并将第三份10mL 100mM NaOH等分试样加入到渗余物中。如前所述将装置离心并除去滤液。将第四份10mL 100mM NaOH等分试样添加到渗余物中，并如前所述进行离心。除去滤液，将10mL水加入到过滤装置中。如前所述将混合物离心。除去渗余物，用水洗涤过滤容器，并将渗余物加至最终体积(3.5mL)。通过LC-MS确认所需产物，并使用吸光度确定浓度。

实施例3

结构I的活化和抗体共轭

根据实施例2制备结构I的代表性化合物(即化合物I-1、I-2、I-3、I-4、I-5和I-6)。

随后还原二硫化物(即，表2中所示的R

实施例4

使用抗体/化合物I的流式细胞术

根据实施例3，针对化合物I-1、I-2、I-4、I-5和I-6制备抗体共轭物。随后将这些抗体共轭物添加到培养缓冲液中并稀释。将血细胞混合物(具有CD3+T细胞)添加到稀释的抗体/染料溶液中，并将所得溶液培养45分钟。培养后，添加溶解固定液，并将所得混合物在室温下培养15分钟。培养后，将样品离心并洗涤(×2)并重新悬浮。固定后，样品中所含试剂过多，但被人血浆Ig和其他蛋白质封闭。血细胞混合物含有阳离子，但使用EDTA螯合。随后将重悬浮的混合物任选地储存过夜(在4-8℃)。随后将样品搅拌约45分钟，然后进行数据采集。

标记度可根据以下公式计算：

亮度＝ε×λ×Q×N

其中ε是染料(或染料部分)的摩尔吸收率，λ是激发波长，Q是量子产率，N

图5-27显示了流式细胞术实验的读数和代表性数据。如数据所示，对于本发明的染料代表性化合物(例如，化合物I-1、化合物I-2、化合物I-4、化合物I-5和化合物I-6)，染色指数显著改善。染色指数与信噪比之间也存在很强的相关性(参见图8、22和27)。

化合物I-4

使用405nm的光和570nm的带通滤光片(发射最大值为551nm)获取来自图5的数据。染色指数与信噪比的线性回归显示R

还使用405nm和605nm的带通测试了化合物I-4(图25)。绘制每个测试的微克染色指数数据如图26所示。染色指数与信噪比相关性的线性回归显示R

化合物I-5

使用488nm的光和525nm的带通滤光片获取了图12中所示的数据。这些化合物的荧光团具有与荧光素类型的化合物相似的噪声特征。信号数据(图17)表明标记CD3抗原的准确性类似于用作参考的Alexa Fluor 488共轭物。

化合物I-1、I-2和I-6

使用355nm的光和395nm的带通滤光片(发射最大值为442nm)获取图18中所示的数据。分别为比较目的制备了Alexa Fluor 350参考样品、化合物I-1和化合物I-2。在图20中可以找到以每个测试的微克数为变量绘制的染色指数的比较。如数据所示，对于用化合物I-6制备的每个样品，染色指数显著更高。额外地，与具有较短长度的PEG组分(即，化合物I-1和化合物I-2)的化合物相比，化合物I-6显示出更好的染色指数值。染色指数与信噪比的线性回归显示R

实施例5

流式细胞术方法及应用

一般的流式细胞术工作流程包括以下步骤：

1.培养并目测观察细胞是否存在代谢应激迹象，和/或使用新鲜的，诱导的或模拟的细胞。

2.稀释染料化合物至工作量。

3.收获并准备细胞而不会杀死或诱导细胞凋亡。

4.离心并用适当的缓冲液洗涤细胞。

5.使用血细胞计数器和台盼蓝排除法进行细胞计数。

6.离心并且洗涤细胞。

7.调整细胞密度至测试尺寸。

8.施加感兴趣的染料(预稀释)或其他共同染色剂。

9.培养细胞/染色/染料混合物。

10.离心并且用适当的缓冲液洗涤细胞。

11.将细胞重新悬浮在采集缓冲液中。

12.通过流式细胞术获取细胞数据。

上述一般工作流程可以根据特定应用进行修改。下面描述了针对特定应用的一些修改。

生/死辨别

通过对坏死细胞进行阳性染色以比较受损细胞与完整细胞，测试细胞的生存能力。该方法可用于靶向具有正电荷部分的非完整(固定和未固定)的细胞、细胞碎片、凋亡小体、去极化的细胞膜和通透性膜。随后使用常规细胞制备(新鲜或固定)将细胞用染料(例如结构I的化合物)染色，并使用流式细胞术进行分析。

细胞的健康

在死细胞(即坏死细胞)、早期凋亡、晚期凋亡和活细胞之间进行比较。死细胞被阳性染色，非质子体被中间染色，活细胞被阴性染色。该策略导致非常亮的坏死细胞，并且还可以评估细胞的通透性。该方法可用于靶向具有正电荷部分的非完整(固定和未固定)的细胞、细胞碎片、凋亡小体、去极化的细胞膜和通透性膜。染料染色是在体外培养基、原代细胞和经过异种生物处理的样品上进行的，并使用流式细胞术进行分析。

细胞周期

通过染色来追踪细胞周期中的细胞倍性和有丝分裂，该染色与在含有核酸和细胞周期相关蛋白的所有细胞和细胞体中的DNA嵌入剂的阳性染色相关。该方法用于靶向具有正电荷部分的非完整(仅非固定)的细胞、细胞碎片、凋亡小体、去极化的细胞膜和通透性膜。在保存细胞固定并透化用于细胞内染色后，通过染色带正电荷的部分，该方法用于靶向完整(固定和透化)的细胞。在体外培养基、原代细胞和经异种生物处理的样品上进行染料染色(与其他染料组合)，并使用流式细胞术进行分析。

增殖

通过在与所有含有核酸和细胞周期相关蛋白的细胞和细胞体中的DNA嵌入剂上进行阳性染色相关的染色来监测细胞增殖。该方法用于靶向具有正电荷基团的非完整(仅非固定)的细胞、细胞碎片、凋亡小体、去极化的细胞膜和通透性膜。在保存细胞固定并透化用于细胞内染色后，通过染色带正电荷的部分，该方法用于靶向完整(固定和透化)的细胞。在体外培养基、原代细胞和用异源生物处理过的样品上进行染料染色(结合细胞增殖监测标记物，例如Ki67、BRDU)，并使用流式细胞术进行分析。

本说明书提及的全部U.S.专利、U.S.专利申请公开、U.S.专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开，包括2018年7月13日提交的U.S.临时专利申请No.62/697,716，都通过引用整体并入本文且不与本文矛盾。

由前文可以理解，虽然本发明的具体实施方案已经在本文描述用于阐明的目的，在不脱离本发明的精神和范围可以作出多种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。