用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置及方法

技术领域

本公开涉及微生物采油技术领域，尤其涉及一种用于微生物分布和迁移可视化研究的实验装置及方法。

背景技术

在各类岩石地层中的微生物活动对地球元素循环等科学研究和油气资源开发等工程应用都具有重要价值。微生物活动可以分为两个方面，一个是细胞本身的代谢和生长活动，另一个是细胞自发或随着流体在岩石孔隙中的迁移运动。其中，微生物的扩散和迁移问题主要利用传统的渗流力学研究手段，包括宏观的岩心实验和微观可视的孔隙模型实验。

微观可视实验能够直观观察到微生物的形态、运动和界面分布特征，是不可或缺的研究手段。但是，目前相关技术中的微观实验模型主要是利用玻璃或树脂材料制成，受制于材料和方法本身的局限性，只能制成二维平面孔隙网络，与实际地层的三维结构有显著差异。而目前三维结构的模型则主要以石英砂或玻璃珠组成，其材料不透明或存在复杂的折光，无法实现直观的光学观察。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本公开的一些实施例提供一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置及方法。

一方面，提供一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置，包括夹持器和填充于夹持器内的多孔介质模型；其中，夹持器包括：透明的筒体，连接于筒体上端的透明的上盖，连接于筒体下端的透明的底盖，以及，分别设置于筒体的相对的两侧壁的进液管道和出液管道；形成多孔介质模型的材料包括聚合物凝胶。

在本公开的至少一个实施例中，夹持器还包括：设置于进液管道的第一阀门，以及，设置于出液管道的第二阀门。

在本公开的至少一个实施例中，用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置还包括：与进液管道连接的蠕动泵；以及，激光扫描共聚焦显微镜；夹持器设置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上。

在本公开的至少一个实施例中，上盖与筒体通过卡扣连接，或者，上盖与筒体通过螺纹相配合。

另一方面，提供一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法，应用于如上任一实施例所述的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置，该实验方法包括S1～S4。

S1，采用聚合物凝胶配制多孔介质模型。

S2，选择能够表达荧光蛋白的基因工程菌种，形成微生物培养液。

S3，将多孔介质模型和微生物培养液注入微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置的夹持器中。

S4，对夹持器中的微生物进行观察和记录。

在本公开的至少一个实施例中，S1包括S11～S13。

S11，将随机交联的丙烯酸聚合物颗粒按照质量浓度0.2％～3％混入液体培养基中，形成混合液。

S12，在转速为20-80rpm的条件下搅拌混合液4～30小时，使丙烯酸聚合物颗粒与液体培养基混合均匀。

S13，根据微生物的介质电性，用氢氧化钠溶液将混合液的pH值调节到7.0～7.8，得到多孔介质模型。

在本公开的至少一个实施例中，S2包括S21～S22。

S21，选择能够表达荧光蛋白的基因工程菌种，在培养基中进行扩培，使其达到对数增长期。

S22，稀释培养液，使培养基的浓度控制在10

在本公开的至少一个实施例中，能够表达荧光蛋白的基因工程菌种包括大肠杆菌、乳酸杆菌或芽孢杆菌。

在本公开的至少一个实施例中，S3包括S31～S35，S4包括S41。

S31，将夹持器水平放置，打开用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置的第一阀门和第二阀门，并打开上盖，将配制好的多孔介质模型注入夹持器中。

S32，当进液管道和出液管道流出液体后，关闭第一阀门和第二阀门。

S33，当多孔介质模型注满夹持器后，关闭上盖使夹持器封闭，并静置稳定2小时。

S34，将蠕动泵与进液管道连接，并确保用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置中的各管路均已充满微生物培养液。

S35，打开第一阀门和第二阀门，采用蠕动泵向夹持器中注入微生物培养液，待注入0.1～0.5倍孔隙体积后，停止泵入，并关闭第一阀门和第二阀门。

S41，采用激光扫描共聚焦显微镜对单个细胞在孔隙介质中的三维迁移过程进行观察和记录。

在本公开的至少一个实施例中，S3包括S31、S32和S36，S4包括S42。

S31，将夹持器水平放置，打开用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置的第一阀门和第二阀门，并打开上盖，将配制好的多孔介质模型注入夹持器中

S32，当进液管道和出液管道流出液体后，关闭第一阀门和第二阀门S36，用微量移液器取0.5mL微生物培养液，滴入夹持器中的多孔介质模型中央，并继续向夹持器中注入多孔介质模型，当多孔介质模型注满夹持器后，关闭上盖使夹持器封闭，并静置稳定2小时

S42，采用激光扫描共聚焦显微镜对微生物群体在生长和增殖过程中向周边扩散的规律和定量结果进行观察和记录。

附图说明

附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。

图1为根据一些实施例的一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置的夹持器的结构示意图；

图2为根据一些实施例的一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置的夹持器中填充的多孔介质模型的示意图；

图3为根据一些实施例的一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法的单个细胞在多孔介质模型中运移轨迹图；

图4为根据一些实施例的一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法的微生物群落在多孔介质模型中的扩散示意图。

附图标记：

1-夹持器，11-筒体，12-上盖，13-底盖，14-进液管道，15-出液管道，16-第一阀门，17-第二阀门，2-多孔介质模型。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。

如图1～2所示，本公开的一些实施例提供一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置，包括夹持器1和填充于夹持器1内的多孔介质模型2；其中，夹持器1包括：透明的筒体11，连接于筒体11上端的透明的上盖12，连接于筒体11下端的透明的底盖13，以及，分别设置于筒体11的相对的两侧壁的进液管道14和出液管道15；形成多孔介质模型2的材料包括聚合物凝胶。

可选地，筒体11可以为圆柱形筒体、方形筒体或棱柱形筒体，只要保证筒体11与上盖12和底盖13之间能够实现密封即可，本公开对此不做限定。示例性地，筒体11为中空的圆柱型筒体，筒体11的直径为3～6cm，高度2～10cm，壁厚0.2～0.5cm。

可选地，上盖12、底盖13、筒体11采用的透明材质包括普通玻璃、石英玻璃或亚格力板。

可选地，上盖12与筒体11通过卡扣连接，或者，上盖12与筒体11通过螺纹相配合，以实现上盖12相对于筒体11的开启和密闭，从而能够在实验开始前注入多孔介质模型2，并在实验结束后实现清除多孔介质模型2。可以理解的是，实验时上盖12为密闭状态，以避免夹持器1中的填充物质蒸发和漏失。

现有的三维多孔介质实验的模型制作技术包括了填砂、填玻璃珠(以及其他颗粒)、3D打印等，其中，填砂模型透光率低，显然无法实现微观观察；而玻璃珠填充后折光复杂也无法实现光学直观观察；3D打印技术的打印精度还在数十微米以上，尚无法达到真实孔隙的微米级精度，并且孔隙内壁面不光滑、难以准确观察内容物。因此，目前对微生物多孔介质的微观观察大多还停留在二维多孔介质(刻蚀玻璃或硅片模型)阶段。综合来看，本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置中，聚合物凝胶形成的多孔介质模型2的折光现象较弱，能够实现清晰的光学成像，真正实现了三维孔隙结构的微观直观观察。从二维到三维的进步将为该领域研究提供突破性的研究成果。

本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置，具有结构以及制备工艺简单、成本低的特点，利用该装置能够观察微生物在三维孔隙中运动和增殖的过程。并且，本公开中多孔介质模型2并不同于常规的由沙子填充形成的多孔介质，而是由一些交联的聚合物溶液构成，也即聚合物网状结构构成的多孔介质，这种多孔介质的孔大部分是纳米级，符合较低渗透率多孔介质的实际孔喉尺寸。这种较为致密的尺寸在颗粒填充和3D打印模型中尚无法实现。

在本公开的至少一个实施例中，夹持器1还包括：设置于进液管道14的第一阀门16，以及，设置于出液管道15的第二阀门17。

在本公开的至少一个实施例中，用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置还包括：与进液管道14连接的蠕动泵；以及，激光扫描共聚焦显微镜；夹持器1设置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上。

受目前三维模型的制作问题的限制，现存三维多孔介质流体运动观察的手段主要是CT、核磁共振等手段，但其精度远低于光学显微镜，无法实现对单个细胞的运动观察。而本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置中，使用激光扫描共聚焦显微镜，其光学分辨率足以实现对单个微生物的观察。既可以观察微生物群落的分布，又可以揭示单个微生物细胞的生命活动特征。

本公开的一些实施例还提供一种用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法，应用于如上任一实施例所述的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置。

需要说明的是，文中的步骤编号，仅为了方便具体实施例的解释，不作为限定步骤执行先后顺序的作用。

该用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法包括S1～S4。

S1，采用聚合物凝胶配制多孔介质模型2。

S2，选择能够表达荧光蛋白的基因工程菌种，形成微生物培养液。

示例性地，能够表达荧光蛋白的基因工程菌种例如为经过改造的大肠杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌等任何能够表达荧光蛋白的菌株。

S3，将多孔介质模型2和微生物培养液注入微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置的夹持器1中。

S4，对夹持器1中的微生物进行观察和记录。

示例性地，将夹持器1置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，打开显微镜开关，直接观察微生物的荧光蛋白在激光激发下产生的荧光。在观察过程中，例如可以控制激光扫描共聚焦显微镜的焦距，在多孔介质模型2的厚度方向上所在的各层焦平面中连续反复拍摄图像，也即，在各层焦平面依次拍摄图像，所有焦平面拍完一遍后又重新在各个焦平面依次拍摄图像。记录每次拍摄的焦距、景深和时间，作为后期数据处理的基本参数。其中，在同一焦平面、不同时间拍摄的图像可以作为微生物细胞空间分布的时间曲线；对在同一时间段、不同焦平面拍摄的图像进行拼接，可以反映该时段内微生物的空间分布特征。

与相关技术相比，本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法具有如下优点：

现有的三维多孔介质实验的模型制作技术包括了填砂、填玻璃珠(以及其他颗粒)、3D打印等，其中，填砂模型透光率低，显然无法实现微观观察；而玻璃珠填充后折光复杂也无法实现光学直观观察；3D打印技术的打印精度还在数十微米以上，尚无法达到真实孔隙的微米级精度，并且孔隙内壁面不光滑、难以准确观察内容物。因此，目前对微生物多孔介质的微观观察大多还停留在二维多孔介质(刻蚀玻璃或硅片模型)阶段。综合来看，本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法中，聚合物凝胶形成的多孔介质模型2的折光现象较弱，能够实现清晰的光学成像，真正实现了三维孔隙结构的微观直观观察。从二维到三维的进步将为该领域研究提供突破性的研究成果。

受目前三维模型的制作问题的限制，现存三维多孔介质流体运动观察的手段主要是CT、核磁共振等手段，但其精度远低于光学显微镜，无法实现对单个细胞的运动观察。而本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法中，使用激光扫描共聚焦显微镜，其光学分辨率足以实现对单个微生物的观察。既可以观察微生物群落的分布，又可以揭示单个微生物细胞的生命活动特征。

另外，本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法可以通过调节聚合物凝胶的密度，将孔隙尺寸控制在1～20微米，符合较低渗透率多孔介质的实际孔喉尺寸，这种较为致密的尺寸在颗粒填充和3D打印模型中尚无法实现。例如，随机交联的丙烯酸聚合物颗粒按质量分数为0.2％的凝胶密度配制，形成的多孔介质模型2的平均孔隙尺寸为10um；又例如，随机交联的丙烯酸聚合物颗粒按质量分数为3％的凝胶密度配制，形成的多孔介质模型2的平均孔隙尺寸为100nm。

在本公开的至少一个实施例中，S1包括S11～S13。

S11，将随机交联的丙烯酸聚合物颗粒按照质量浓度0.2％～3％混入液体培养基中，形成混合液。

其中，液体培养基为适合微生物生长的液体培养基，液体培养基的成分与微生物类型有关，本领域技术人员可以根据需要选择，本公开对此不做限定。

S12，在转速为20-80rpm的条件下搅拌混合液4～30小时，使丙烯酸聚合物颗粒与液体培养基混合均匀。

示例性地，可以在转速为40rpm的条件下缓慢机械搅拌混合液6小时。

S13，根据微生物的介质电性，用氢氧化钠溶液将混合液的pH值调节到7.0～7.8，得到多孔介质模型2。

其中，混合液调节的PH值的数值与微生物适宜生长的环境PH有关，本领域技术人员可以根据需要选择，本公开对此不做限定。

在本公开的至少一个实施例中，S2包括S21～S22。

S21，选择能够表达荧光蛋白的基因工程菌种，在培养基中进行扩培，使其达到对数增长期。

示例性地，在常规培养基中按照所选菌种的最优培养条件扩培，使其达到对数增长期；本领域技术人员可以根据实际菌种和需求要选择该最优培养条件，本公开对此不做限定。

S22，稀释培养液，使培养基的浓度控制在10

在本公开的至少一个实施例中，S3包括S31～S35，S4包括S41。

S31，将夹持器1水平放置，打开用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置的第一阀门16和第二阀门17，并打开上盖12，将配制好的多孔介质模型2注入夹持器1中。

S32，当进液管道14和出液管道15流出液体后，关闭第一阀门16和第二阀门17。

S33，当多孔介质模型2注满夹持器1后，关闭上盖12使夹持器1封闭，并静置稳定2小时，观察是否有液体泄露，以确保夹持器1密闭完好。

S34，将蠕动泵与进液管道14连接，并确保用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置中的各管路均已充满微生物培养液。

S35，打开第一阀门16和第二阀门17，采用蠕动泵向夹持器1中注入微生物培养液，待注入0.1～0.5倍孔隙体积后，停止泵入，并关闭第一阀门16和第二阀门17。

S41，采用激光扫描共聚焦显微镜对单个细胞在孔隙介质中的三维迁移过程进行观察和记录。

下面详细介绍一下利用本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法观察单个细胞在孔隙介质中的三维迁移过程，并揭示其迁移模式和定量迁移速率过程。

选择能够表达荧光蛋白的大肠杆菌基因工程菌种。

在常规LB培养基中按照该菌种的最优培养条件扩培，使其达到对数增长期。

稀释培养液，使培养基的浓度控制在2～8×10

将夹持器1水平放置，打开第一阀门16和第二阀门17，并打开上盖12，将配制好的多孔介质模型2注入夹持器1中。

当进液管道14和出液管道15流出液体后，关闭第一阀门16和第二阀门17。

当多孔介质模型2注满夹持器1后，关闭上盖12使夹持器1封闭，并静置稳定2小时，观察是否有液体泄露，以确保夹持器1密闭完好。

将蠕动泵与进液管道14连接，并确保用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置中的各管路均已充满微生物培养液。

打开第一阀门16和第二阀门17，采用蠕动泵以0.2mL/min的流速注入准备好的微生物培养液，待注入0.2倍孔隙体积后，停止泵入，并关闭第一阀门16和第二阀门17。

确保夹持器1密闭完好之后即可开展观察实验。

将夹持器1置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，打开激光扫描共聚焦显微镜的开关，直接观察微生物的荧光蛋白在激光激发下产生的荧光。

控制激光扫描共聚焦显微镜的焦距，在多孔介质模型2的厚度方向上所在的各层焦平面中连续反复拍摄图像，也即，在各层焦平面依次拍摄图像，所有焦平面拍完一遍后又重新在各个焦平面依次拍摄图像，以此定位其中一个细胞。由于微生物被荧光标记，利用激光扫描共聚焦显微镜可以直接捕捉定位到被荧光标记的微生物细胞。将该细胞位置置于景深中央，以确保其运动后短期内仍在清晰画面范围内。

每隔50毫秒拍摄一张图片，持续2分钟。全部图片在时间序列上将可以反映该细胞在多孔介质中的运动。

如图3所示，图3示出了单细胞在多孔介质模型2中的运移轨迹图(标尺10微米)。

图3中的荧光照片可以显示出微生物在三维孔隙中的运动轨迹以及迁移速率。由此可以揭示微生物细胞在多孔介质模型2中的迁移模式，包括在孔隙中的转向和移动两个部分，与单一液相中的布朗运动有显著的区别。微生物细胞单次移动可达2.1～4.6μm，瞬时速度可达15～39μm/s。单细胞要在孔隙中转向寻找出口，平均运动速率大幅减低：孔隙平均直径4微米时平均迁移速率12μm/min；孔隙平均直径2微米时平均迁移速率8μm/min。

在本公开的至少一个实施例中，S3包括S31、S32和S36，S4包括S42。

S31，将夹持器1水平放置，打开用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验装置的第一阀门16和第二阀门17，并打开上盖12，将配制好的多孔介质模型2注入夹持器1中

S32，当进液管道14和出液管道15流出液体后，关闭第一阀门16和第二阀门17

S36，用微量移液器取0.5mL微生物培养液，滴入夹持器1中的多孔介质模型2中央，并继续向夹持器1中注入多孔介质模型2，当多孔介质模型2注满夹持器1后，关闭上盖12使夹持器1封闭，并静置稳定2小时。

S42，采用激光扫描共聚焦显微镜对微生物群体在生长和增殖过程中向周边扩散的规律和定量结果进行观察和记录。

下面详细介绍一下利用本公开一些实施例提供的用于微生物扩散和迁移可视化研究的实验方法观察微生物群体在生长和增殖过程中向周边扩散的规律和定量结果的过程。

选择能够表达荧光蛋白的芽孢杆菌基因工程菌。

在常规LB培养基中按照该菌种的最优培养条件扩培，使其达到对数增长期。

稀释培养液，使培养基的浓度控制在10

将夹持器1水平放置，打开第一阀门16和第二阀门17，并打开上盖12，将配制好的多孔介质模型2注入夹持器1中。

当进液管道14和出液管道15流出液体后，关闭第一阀门16和第二阀门17。

用微量移液器取0.5mL准备好的微生物培养液，滴入夹持器1中的多孔介质模型2中央，并继续向夹持器1中注入多孔介质模型2，当多孔介质模型2注满夹持器1后，关闭上盖12使夹持器1封闭，并静置稳定2小时，确保密闭完好，之后即可开展观察实验。

将夹持器1置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，打开激光扫描共聚焦显微镜的开关，直接观察微生物的荧光蛋白在激光激发下产生的荧光。之后不再移动载物台。

控制激光扫描共聚焦显微镜的焦距，在多孔介质模型2的厚度方向上所在的各层焦平面中连续反复拍摄图像。

不断调节焦平面，逐层拍摄各景深范围，在1分钟内完成整个多孔介质模型2的厚度方向上的扫描；拼接各焦平面图像，实现对多孔介质模型2微生物三维分布特征的观察。之后每隔5分钟做一次本步骤中的扫描。

在10小时后停止实验，全部三维分布特征在时间序列上将可以反映该微生物群落在多孔介质模型2中的扩散过程。

如图4所示，图4示出了微生物细胞的分布，其中，左图为0min、直径50微米的图像，右图为120min、直径0.5mm的图像。

由图4可以看出，随着时间推移，可见多孔介质模型2中微生物增殖和运动造成的扩散，依据该结果可以推算微生物在三维多孔介质中的扩散模式、速率动态及其相关影响因素。

从扩散模式上来看，微生物向周边的迁移出现很早，但在原位增殖的效果更为明显，提高局部浓度(微生物自身繁殖后导致浓度提高)之后，周边迁移部分的浓度才依次提升。从扩散速率来看，孔隙平均直径4微米时，扩散球的界面扩展速率达到了1.5μm

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本公开的限制。同时，在本公开的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电性连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本公开中的具体含义。

本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。