一种复合脂质体及其制备方法和应用
文献发布时间:2023-06-19 10:11:51
技术领域
本发明涉及医药领域,具体是一种复合脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
癌症具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征,是全球第二大死亡原因。尽管在全球范围内进行了广泛的研究以抗击这种可怕和致命的疾病,但仍然存在着很多的挑战。
其中,乳腺癌是全球女性中最常被诊断出的恶性肿瘤,也是与癌症相关的死亡的主要原因。此外,妇女患乳腺癌的风险在增加,因此,八分之一的妇女染上了这种疾病。多西他赛(Docetaxel,DTX)也叫多烯紫杉醇,是一种源自欧洲紫杉针的人工半合成紫杉化合物,是治疗乳腺癌的一线药物,对晚期乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌有较好的疗效。但是,由于DTX的水溶性差,乳腺癌细胞中的多药耐药性(MDR)和不良反应,其临床应用受到限制。
目前,为了减少多药耐药性和不良反应,通常可以采用联合疗法,与单一疗法相比,越来越多地被用作主要癌症治疗方案的联合疗法可以避免不良反应和耐药性。但是,不同活性药物之间的各种药代动力学特征和膜转运特性,复杂的剂量和时间表优化可能会阻止联合疗法获得所需的治疗效果,这是联合药物疗法面临的挑战。此外,自由形式的高效药物的共同给药会带来严重的意想不到的副作用。这些障碍可以通过纳米药物载体的应用来克服,特别是在联合药物输送中。因此,设计一种基于多西他赛的复合脂质体,来逆转多西他赛的多药耐药性现象,从而提高多西他赛的疗效,成为目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合脂质体,以解决上述背景技术中提出的现有技术中多西他赛在单独用于治疗癌症时存在多药耐药性现象的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种复合脂质体,包括以下的原料:姜黄素(Curcumin,CUR)、多西他赛、胆固醇、大豆磷脂;其中,所述复合脂质体是采用乙醇注入法制备得到。
在本发明实施例中,通过运用现代化技术,采用乙醇注入法以姜黄素、多西他赛、胆固醇、大豆磷脂为原料,制备了所述复合脂质体,即姜黄素-多西他赛-脂质体,在用于治疗乳腺癌中,可以提高多西他赛的抗癌效果,同时可以逆转多西他赛的多药耐药性现象,解决了多西他赛在单独用于治疗癌症时存在多药耐药性现象的问题。
需要说明的是,姜黄素是从姜黄的根茎中提取的生物活性成分,已被FDA(Foodand Drug Administration,食品药品监督管理局)视为安全食品添加剂,还被广泛用于预防和治疗多种癌症,包括乳腺癌,结直肠癌癌症,胃癌,肝癌,食道癌,肺癌,脑癌和白血病的临床前研究。CUR还是多药抗性蛋白的抑制剂,可能有助于逆转癌症化疗中的多药抗性。本发明通过CUR与DTX并用可提高两种药物的抗癌效力。通过将CUR和DTX一起包装在脂质体中,一方面,脂质体可以帮助DTX到达肿瘤部位,另一方面,CUR可以逆转DTX的MDR现象,从而提高DTX的疗效。
作为本发明进一步的方案:所述复合脂质体包括以下按照重量份的原料:姜黄素1-5份、多西他赛2-8份、胆固醇20-40份、大豆磷脂100-150份。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述复合脂质体的制备方法,具体包括以下步骤:
按照比例称取姜黄素、多西他赛、胆固醇与大豆磷脂并共同溶于乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,再将有机溶液快速注入搅拌的水中,然后在50-60℃下搅拌2-4h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述的复合脂质体的制备方法制备得到的复合脂质体。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的复合脂质体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明提供的复合脂质体可以逆转多西他赛的多药耐药性现象,通过采用乙醇注入法以姜黄素、多西他赛、胆固醇、大豆磷脂为原料,制备了所述复合脂质体,在用于治疗乳腺癌中,可以提高多西他赛的抗癌效果,同时可以逆转多西他赛的多药耐药性现象,解决了多西他赛在单独用于治疗癌症时存在多药耐药性现象的问题。而且,本发明实施例提供的制备方法简单,制备的复合脂质体通过包封改变了姜黄素和多西他赛的体外释放速率,可用于制备体内持续释放制剂,不会在体内循环期间释放药物,因此大多数嵌入的药物都可以直接传递到肿瘤部位,可以用于治疗乳腺癌,具有广阔是市场前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细地说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护苑围。
本发明实施例提供的一种复合脂质体,包括以下的原料:姜黄素、多西他赛、胆固醇、大豆磷脂;其中,所述复合脂质体是采用乙醇注入法制备得到。
在本发明实施例中,通过运用现代化技术,采用乙醇注入法以姜黄素、多西他赛、胆固醇、大豆磷脂为原料,制备了所述复合脂质体,在用于治疗乳腺癌中,可以提高多西他赛的抗癌效果,同时可以逆转多西他赛的多药耐药性现象,解决了多西他赛在单独用于治疗癌症时存在多药耐药性现象的问题。所述复合脂质体的表征结果表明,DTX在CUR-DTX-L中的平均粒径、多分散指数、zeta电位、包封率分别为208.53±6.82nm、0.055±0.001、-23.1±2.1mv和98.32±2.37%。
作为本发明的另一优选实施例,所述复合脂质体包括以下按照重量份的原料:姜黄素1-5份、多西他赛2-8份、胆固醇20-40份、大豆磷脂100-150份。
作为本发明的另一优选实施例,所述复合脂质体包括以下按照重量份的原料:姜黄素1-3份、多西他赛3-5份、胆固醇28-32份、大豆磷脂110-130份。以上原料均可以采用市售产品,这里并不作赘述。
作为本发明的另一优选实施例,所述复合脂质体包括以下按照重量份的原料:姜黄素2份、多西他赛4份、胆固醇30份、大豆磷脂120份。
本发明实施例还提供一种所述复合脂质体的制备方法,具体包括以下步骤:
按照比例称取姜黄素、多西他赛、胆固醇与大豆磷脂并共同溶于乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,再将有机溶液快速注入搅拌的水中,然后在50-60℃下搅拌2-4h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体。
作为本发明的另一优选实施例,所述复合脂质体的制备方法还包括将有机溶液置于50-60℃的环境中进行保存的步骤,优选的,可以是在水浴中进行保存,所述水浴的温度是55℃,即将有机溶液置于55℃水浴中保存。
作为本发明的另一优选实施例,在所述复合脂质体的制备方法中,所述乙醇的用量是所述姜黄素重量的800-2800倍。
优选的,当所述复合脂质体的原料包括:姜黄素2mg、多西他赛4mg、胆固醇30mg、大豆磷脂120mg时,所述乙醇的用量是3mL。
作为本发明的另一优选实施例,在所述复合脂质体的制备方法中,所述水的用量是所述姜黄素重量的800-30000倍。
优选的,当所述复合脂质体的原料包括:姜黄素2mg、多西他赛4mg、胆固醇30mg、大豆磷脂120mg时,所述水的用量是20mL。
作为本发明的另一优选实施例,所述水可以是选自纯净水、蒸馏水、去离子水或双蒸馏水中的任意一种,这里并不作限定,可以根据需要进行选择。
优选的,所述水是双蒸馏水,所述双蒸馏水就是用纯净水二次蒸馏得到的产品。具体的,当所述复合脂质体的原料包括:姜黄素2mg、多西他赛4mg、胆固醇30mg、大豆磷脂120mg时,所述水采用双蒸馏水,用量是20mL。
作为本发明的另一优选实施例,在所述复合脂质体的制备方法中,所述搅拌的转速是600-1000rpm。
优选的,本发明实施例采用乙醇注入法制备了所述复合脂质体,通过单因素试验对工艺进行优化,确定了最佳工艺条件,对应的所述复合脂质体的制备方法具体包括以下步骤:
按照比例称取姜黄素2mg、多西他赛4mg、胆固醇30mg、大豆磷脂120mg,并共同溶于3mL乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,将有机溶液置于55℃水浴中保存,使用时再将有机溶液快速注入搅拌(800 rpm)的水(20mL双蒸馏水)中,然后在55℃下用磁力搅拌器(型号DF-1 Electric Stirred,金坛市,中国)搅拌3h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体。
本发明实施例还提供一种采用上述的复合脂质体的制备方法制备得到的复合脂质体。
本发明实施例还提供一种上述的复合脂质体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
作为本发明的另一优选实施例,所述复合脂质体可以用于预防和治疗多种癌症,包括乳腺癌,结直肠癌癌症,胃癌,肝癌,食道癌,肺癌,脑癌和白血病等。
以下通过列举具体实施例对本发明的复合脂质体的技术效果做进一步的说明。
实施例1
一种复合脂质体的制备方法,具体包括以下步骤:
称取姜黄素2mg、多西他赛4mg、胆固醇30mg、大豆磷脂120mg,并共同溶于3mL乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,将有机溶液置于55℃水浴中保存,使用时再将有机溶液快速注入搅拌(800 rpm)的水(20mL双蒸馏水)中,然后在55℃下用磁力搅拌器(型号DF-1 Electric Stirred,金坛市,中国)搅拌3h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体,即姜黄素-多西他赛-脂质体(记作CUR-DTX-L)。
实施例2
一种复合脂质体,包括以下的原料:姜黄素1mg、多西他赛2mg、胆固醇20mg、大豆磷脂100mg。
在本发明实施例中,所述复合脂质体的制备方法,具体包括以下步骤:
称取上述的姜黄素、多西他赛、胆固醇与大豆磷脂并共同溶于乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,将有机溶液置于50℃水浴中保存,使用时再将有机溶液快速注入搅拌(转速是600rpm)的水中,然后在50℃下搅拌2h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体。其中,所述乙醇的用量是所述姜黄素重量的800倍;所述水是选自双蒸馏水,用量是所述姜黄素重量的800倍。
实施例3
一种复合脂质体,包括以下的原料:姜黄素5mg、多西他赛8mg、胆固醇40mg、大豆磷脂150mg。
在本发明实施例中,所述复合脂质体的制备方法,具体包括以下步骤:
称取上述的姜黄素、多西他赛、胆固醇与大豆磷脂并共同溶于乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,将有机溶液置于60℃水浴中保存,使用时再将有机溶液快速注入搅拌(转速是1000rpm)的水中,然后在60℃下搅拌4h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体。其中,所述乙醇的用量是所述姜黄素重量的2800倍;所述水是选自双蒸馏水,用量是所述姜黄素重量的30000倍。
实施例4
一种复合脂质体,包括以下的原料:姜黄素1mg、多西他赛3mg、胆固醇28mg、大豆磷脂110mg。
在本发明实施例中,所述复合脂质体的制备方法,具体包括以下步骤:
称取上述的姜黄素、多西他赛、胆固醇与大豆磷脂并共同溶于乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,将有机溶液置于52℃水浴中保存,使用时再将有机溶液快速注入搅拌(转速是700rpm)的水中,然后在52℃下搅拌3h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体。其中,所述乙醇的用量是所述姜黄素重量的1200倍;所述水是选自双蒸馏水,用量是所述姜黄素重量的2000倍。
实施例5
一种复合脂质体,包括以下的原料:姜黄素3mg、多西他赛5mg、胆固醇32mg、大豆磷脂130mg。
在本发明实施例中,所述复合脂质体的制备方法,具体包括以下步骤:
称取上述的姜黄素、多西他赛、胆固醇与大豆磷脂并共同溶于乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,将有机溶液置于58℃水浴中保存,使用时再将有机溶液快速注入搅拌(转速是900rpm)的水中,然后在58℃下搅拌4h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体。其中,所述乙醇的用量是所述姜黄素重量的2200倍;所述水是选自双蒸馏水,用量是所述姜黄素重量的20000倍。
实施例6
一种复合脂质体,包括以下的原料:姜黄素2mg、多西他赛4mg、胆固醇30mg、大豆磷脂120mg。
在本发明实施例中,所述复合脂质体的制备方法,具体包括以下步骤:
称取上述的姜黄素、多西他赛、胆固醇与大豆磷脂并共同溶于乙醇中形成有机相,然后进行均质混合均匀,得到有机溶液,将有机溶液置于55℃水浴中保存,使用时再将有机溶液快速注入搅拌(转速是800rpm)的水中,然后在55℃下搅拌3h以形成均相乳液,得到所述复合脂质体。其中,所述乙醇的用量是所述姜黄素重量的1600倍;所述水是选自双蒸馏水,用量是所述姜黄素重量的18000倍。
实施例7
与实施例6相比,除了所述乙醇的用量是所述姜黄素重量的2200倍;所述水的用量是所述姜黄素重量的26000倍外,其他与实施例6相同。
实施例8
与实施例1相比,除了所述水是选自纯净水外,其他与实施例1相同。
实施例9
与实施例1相比,除了所述水是选自蒸馏水外,其他与实施例1相同。
实施例10
与实施例1相比,除了所述水是选自去离子水外,其他与实施例1相同。
实施例11
与实施例1相比,除了原料中不包括多西他赛,以及大豆磷脂和胆固醇的量分别调整为130mg和20mg外,其他与实施例1相同,制备得到的是单个CUR负载脂质体(记作CUR-L)。
实施例12
与实施例1相比,除了原料中不包括姜黄素,以及大豆磷脂和胆固醇的量分别调整为120mg和18mg外,其他与实施例1相同,制备得到的是单个DTX负载脂质体(记作DTX-L)。
实施例13
在本实施例中,通过使用高效液相色谱(HPLC)方法测量水相中的游离药物浓度和总药物量来确定包封率(EE%)。使用Sephadex G-50色谱柱(1.5 cm×20.0 cm)通过尺寸排阻色谱法将未封装的DTX和CUR与脂质体分离,洗脱液为蒸馏水。简要地,是将实施例1、实施例11以及实施例12制备的制剂CUR-DTX-L,CUR-L和DTX-L分别采用凝胶渗透色谱分离,将从凝胶渗透色谱分离的CUR-DTX-L,DTX-L和CUR-L用甲醇溶解并通过HPLC测定含量。EE%可以按照下式计算:
EE(%)= WE/WT×100%
其中,WE是制剂中截留的CUR/DTX的重量,WT是制剂中总CUR/DTX的重量。
在这项研究中,使用DTX和CUR制备了纳米药物递送系统,其中水溶性较差的CUR被用作模型药物。通过注射法制备的脂质体,EE%高,粒径小,分布均匀,稳定性好,满足制备脂质体的要求。通过该方法制备的CUR-DTX-L,DTX-L和CUR-L具有高的EE值,分别为98.32±2.37%,95.63±3.65%和92.78±3.07%。
实施例14
在本实施例中,通过测试实施例1、实施例11以及实施例12制备的制剂CUR-DTX-L,CUR-L和DTX-L的平均粒径,来分析将CUR和DTX一起包装在脂质体中得到CUR-DTX-L相比于CUR-L和DTX-L产生的协同增效作用。
具体的,使用Zetasizer Nano ZS90 Malvern粒度分析仪(Malvern,UK)在25℃下通过动态光散射(DLS)测定聚乙二醇化脂质体(分别是CUR-DTX-L,CUR-L和DTX-L)的平均粒径,多分散指数(PDI)和Zeta电位。仪器用标准乳胶脂质体校准。检测样品在双蒸馏水中稀释20倍后进行所有粒径测量,制备的脂质体的Zeta电势的测量无需稀释。CUR-DTX-L,CUR-L和DTX-L的测量的实验值均是分别测量三个不同结果取平均值。
在本实施例中,具体的结果如下:DTX-CUR-L,DTX-L和CUR-L的平均粒径分别为208.53±6.82nm,239.32±4.95nm和212.95±4.57nm。彼此组合时,DTX-L或CUR-L的大小没有太大变化。此外,DTX-CUR-L,DTX-L和CUR-L的PDI值分别约为0.055±0.001、0.134±0.005和0.200±0.012,这表明这三种制剂中的粒度分布窄且粒度相当均匀。
所有脂质体均带负电荷(对于CUR-DTX-L为-23.1±2.1 mV,对于DTX-L为-20.5±1.8 mV,对于CUR-L为-19.4±1.8 mV),表明排斥力防止颗粒聚集并具有更好的稳定性。
实施例15
在本实施例中,结合以上实施例中的初步的实验结果,结合DTX和CUR的化学性质,最终选择PBS(phosphate buffer saline,磷酸缓冲盐溶液)(pH = 7.4)作为释放介质,并加入0.5%的吐温80以提高DTX和CUR的溶解度,然后观察脂质体在体外的释放特性。简而言之,将等效于0.5 mg药物的脂质体分散液(分别是实施例1、实施例11以及实施例12制备的制剂CUR-DTX-L,CUR-L和DTX-L,均是加入0.5%的吐温80制备得到对应的脂质体分散液)装入透析膜袋(21 mm,MVCO 8000-14400 Da)中,两端绑在一起,并浸入装有100 mL释放介质(PBS(pH = 7.4))的烧杯中,温度为(37±1)℃。以100 rpm搅拌。以预定的时间间隔分别采集样品,并同时添加等体积的释放介质以确保沉降条件。样品通过0.22μm滤膜后,通过HPLC分析DTX和CUR的量。每个释放实验以一式三份进行。具体的结果如下:
与游离的DTX溶液和游离的CUR溶液相比,结果表明脂质体制剂可以在一定程度上延迟DTX和CUR的体外释放,并在更长的时间内保持较高的浓度。在最初的24小时内测得了大约100%的游离的DTX,但在48小时内DTX-L的累积释放仅达到59.27%,而CUR-DTX-L也仅为68.74 %。几乎所有的游离的CUR均在最初的12小时内测量,并且制剂中的CUR直到48小时才完全释放。
此外,与游离药物组的快速释放相比,体外释放研究表明脂质体制剂表现出缓慢的药物释放特性,而没有最初的爆发,这可能是由于脂质体膜脂质小片段所持药物的亲和力所致。其性质以及包封在脂质膜中的药物主要是通过脂质双层的溶解和扩散来释放的。另外,脂质体的包封改变了DTX和CUR的体外释放速率,提示了在体内持续释放制剂的可能性,并且这种缓慢释放模式可能是有益的。因为通过这种方式,脂质体不会在体内循环期间释放药物,因此大多数嵌入的药物都可以直接传递到肿瘤部位。
实施例16
在本实施例中,通过测试实施例1、实施例11以及实施例12制备的制剂CUR-DTX-L,CUR-L和DTX-L对细胞的体外细胞毒性,来分析将CUR和DTX一起包装在脂质体中得到CUR-DTX-L相比于CUR-L和DTX-L产生的协同增效作用。
具体的,选择Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法研究细胞生存能力。将MCF-7乳腺癌细胞与MCF-7/PTX乳腺癌细胞(MCF-7/PTX即人乳腺癌细胞紫杉醇耐药株)分别接种于96孔板中,每孔的接种密度为5000细胞,并在在37℃,5%CO
通过CCK-8分析评估了CUR-DTX-L,DTX-L,CUR-L和游离药物(游离的DTX和游离的CUR)对MCF-7乳腺癌细胞与MCF-7/PTX乳腺癌细胞的体外细胞毒性。细胞活力曲线可以得到游离的DTX和载药制剂(分别是CUR-DTX-L,DTX-L,CUR-L)在这两种细胞中表现出剂量依赖性的细胞增殖抑制行为。载药制剂中MCF-7和MCF-7 / PTX细胞的细胞活力均显着低于游离的DTX。在7种不同的药物浓度下(DTX:25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、150μg/mL、200μg/mL;CUR:12.5μg/mL、25μg/mL、37.5μg/mL、50μg/mL,孵育24小时后,加入60μg/mL、75μg/mL、100μg/mL)。此外,结果表明,CUR-DTX-L比DTX-L具有更强的抑制MCF-7和MCF-7/PTX细胞生长的能力。
而且,CUR-DTX-L的IC50值较低(对于DTX:MCF-7中为45.71±3.15μg/mL,相比于DTX-L(MCF-7中为57.81±4.06μg/mL));
MCF-7/PTX中的CUR:MCF-7中为22.86±1.58μg/mL,MCF-7/PTX中为22.86±1.58μg/mL;
对于CUR-L(MCF-7中为36.24±3.16μg/mL,MCF-7/PTX中为38.19±2.08μg/mL),游离药物(对于DTX:MCF-7中为125.03±5.27μg/mL,MCF-7/PTX中为133.14±6.24μg/mL;对于CUR:MCF-7中为53.26±4.22μg/mL,MCF-7/PTX为79.26±5.35μg/mL)。这些结果表明CUR增强了DTX介导的MCF-7和MCF-7/PTX细胞的凋亡。
本发明有益效果是:本发明采用乙醇注入法以姜黄素、多西他赛、胆固醇、大豆磷脂为原料,制备了所述复合脂质体,在用于治疗乳腺癌中,可以提高多西他赛的抗癌效果,同时可以逆转多西他赛的多药耐药性现象,解决了多西他赛在单独用于治疗癌症时存在多药耐药性现象的问题。而且,本发明实施例提供的制备方法简单,制备的复合脂质体中的DTX的平均粒径、多分散指数、zeta电位、包封率分别为208.53±6.82nm、0.055±0.001、-23.1±2.1mv和98.32±2.37%,所述复合脂质体通过包封改变了DTX和CUR的体外释放速率,可用于制备在体内持续释放制剂,并且这种缓慢释放模式可能是有益的,不会在体内循环期间释放药物,因此大多数嵌入的药物都可以直接传递到肿瘤部位,可以用于治疗乳腺癌,具有广阔是市场前景。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施方式,在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
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