一种SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法
文献发布时间:2023-06-19 10:13:22
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及一种SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法。
背景技术
冠状病毒是一类可感染人及多种脊椎动物的单股正链RNA病毒,是引起人普通感冒以及上呼吸道感染的重要病原体,严重威胁人类健康。2019年底流行的SARS-CoV-2冠状病毒具有传播快、疫情重、进展迅速特点。在部分患者中导致呼吸功能进行性障碍并引起死亡。目前对SARS-CoV-2冠状病毒的药物研究包括疫苗、抗体等。1年多时间内,全球对抗体的研究越来越重视,然而最新发表的研究中对抗体的研发都是基于CDR3片段进行的,这也是抗体有效性弱、研发进展缓慢的一大原因。
因此,亟需一种简单高效的扩增方法能够快速扩增出SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简单、高效的SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法。
为实现上述目的,本发明提供一种SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法,包括以下步骤:
S1、提取总RNA:在SARS-CoV-2冠状病毒患者或康复患者血液中提取总RNA;
S2、反转录反应制备cDNA:在该反转录反应中,使用3’端恒定区特异性引物进行反转录,得到包含完整可变区的全长转录本cDNA,并且是抗SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长cDNA序列;
S3、SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增:使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cDNA进行PCR扩增,即获得全长轻链序列。
进一步地,在所述步骤S2中,反转录反应中3’端恒定区特异性引物设计模板SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地,在所述步骤S2中,反转录反应中SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链3’端恒定区特异性引物核苷酸序列P1为GGGTGAGGTGAAAGATGAGC。
进一步地,在所述步骤S3,SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增过程中,使用的5’端可变区特异性上游引物核苷酸序列P2为GTCAGGACACAGCATGGACA。
进一步地,在所述步骤S3,SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增过程中,使用的3’端恒定区特异性下游引物核苷酸序列P3为TCCCTCTAACACTCTCCCCT。
本发明在反转录过程中,使用3’端恒定区特异性引物进行反转录,获得包含完整可变区的全长转录本cDNA。然后,使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cDNA进行PCR扩增,即获得全长轻链序列。
本发明的有益效果: 提供了快速、简单、高效的SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法,为冠状病毒抗体的深入研究奠定了基础。
附图说明
图1为全长轻链PCR产物琼脂糖电泳图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案,下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1:
1、SARS-CoV-2冠状病毒患者或康复患者血液中总RNA提取。
取1.0ml全血加入红细胞裂解液,离心去除上清,加入1ml裂解液Trizol,室温放置5分钟。加入200µl氯仿震荡15秒,室温放置2分钟后4℃ 12000rpm离心5分钟。吸取上层澄清液体至一干净无RNA酶的离心管,加入等体积异丙醇混匀,室温放置5分钟,4 ℃ 12000rpm离心5分钟。丢弃上清加入1ml 75% 乙醇,上下颠倒lmin, 4℃ 12000rpm离心5分钟。丢弃上清室温干燥5分钟,加入40ul无RNA酶水充分溶解RNA, 获得RNA冻存于-80℃待用。
2、反转录反应制备cDNA。
在该反转录反应中,使用3’端恒定区特异性引物进行反转录,3’端恒定区特异性引物核苷酸序列P1为GGGTGAGGTGAAAGATGAGC,得到包含完整可变区的全长转录本cDNA,并且是抗SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长cDNA序列。反转录使用SMARTer PCR cDNASynthesis Kit(Clontech)试剂盒,反应体系按照试剂盒说明书配置,反应条件为42℃孵育90分钟,在70℃下10分钟终止反应,然后加入90μL Elution Buffer (EB)稀释。
3、SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增。
使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cDNA进行PCR扩增,即获得全长轻链序列。使用的5’端可变区特异性上游引物核苷酸序列P2为GTCAGGACACAGCATGGACA。使用的3’端恒定区特异性下游引物核苷酸序列P3为TCCCTCTAACACTCTCCCCT。
使用的PCR酶为PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Clontech),反应条件
●初始变性:
- 98°C 30秒
●在以下温度和时间下进行10次循环:
- 98°C 10秒
- 65°C,持续15秒
- 68°C,10分钟
●最终延期:
- 68°C,5分钟
如图1所示,PCR产物金1%琼脂糖电泳显示,成功扩增出全长轻链基因。
SEQ ID NO:1
ATGGGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCCGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCGACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCACAGCGTTGATACCTGGTTGGCCTGGTATCAACACAGACCAGGGAAGGCCCCTAAGCCCCTGATCTATAAGGCATCTAAATTAGAACCTGGGGTCCCACCGAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTACTTTTTGGACGTTCGGCCAAGGGACTAAAGTAGAAGTCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案,并非对本发明做任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下,还有其他的变体和改型。
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- SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物