CD226激动剂抗体

本发明属于医药领域。更具体地，本发明涉及针对人CD226(hCD226)的激动剂抗体、包含这类激动剂抗人CD226抗体的组合物和使用这类激动剂抗人CD226抗体治疗癌症的方法。

免疫检查点途径涉及抑制或激活免疫应答(Isakov N,J.Autoimmune Disorders2016；2(2):17)。在自身免疫疾病疗法中，可能需要促进，即，激动，免疫抑制性途径的作用，从而抑制免疫应答。反过来，在癌疗法中，可能需要促进，即，激动，免疫刺激性途径的作用，从而激活免疫应答。

CD226作为免疫共刺激受体发挥作用(Dougall WC等人,Immunol.Rev.2017；276:112-120(2017))。因此，CD226途径是免疫刺激性途径，即，它激活/刺激免疫应答(Manaka,I,A,J.Exp.Med.；2008；205(13):2959-2964；Van Vo,A,Molecular Immunology；2016；69:70-76；Shengke,H,J Biol Chem.；2014；289(10):6969–6977)。CD226途径的免疫刺激性作用促进(激动)可能是有益的，例如，在治疗癌症中有益，并且促进CD226途径的免疫刺激性作用的治疗性分子是CD226途径激动剂。

CD226表达在天然杀伤(NK)细胞、血小板、单核细胞、CD8

CD226与CD112(PVRL2)和CD155(PVR)相互作用，后两者广泛表达在人类和小鼠的许多组织中的造血细胞、上皮细胞和内皮细胞上(Van Vo,A,Molecular Immunology；2016；69:70-76；Shengke,H,The J.of Biol.Chem.,2014；289(10):6969-6977)。CD112(PVLR2)在乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃(胃的)癌、睾丸癌、甲状腺癌和尿道上皮癌中表达(Human Protein Atlasproteinatlas.org/ENSG00000130202-NECTIN2/pathology)。CD155(PVR)在肺癌、肝癌、胰腺癌、类癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、肾癌、尿道上皮癌、睾丸癌、前列腺癌、皮肤癌和黑素瘤中表达(Human Protein Atlas，proteinatlas.org/ENSG00000073008-PVR/pathology)。CD155还在软组织肉瘤中表达(Atsumi S等人,Oncol.Lett.2013；5:1771-1776)。

NK细胞和T细胞上的CD226与肿瘤细胞和抗原呈递细胞上的CD112和CD155之间的相互作用增进细胞介导的细胞毒性和细胞因子产生(Iguchi-Manaka,A,J.Exp.Med.2008；205(13):2959-2964和本文中的参考文献)。CD226是CD226/TIGIT途径的部分，其中CD226充当免疫刺激性受体，而TIGIT充当免疫抑制性受体，并且CD226与TIGIT竞争与CD155和CD112的结合(Dougall WC等人,Immunol.Rev.2017；276:112-120(2017)；Blake,S,Clin CancerRes；2016；22(21):5182-5188)。TIGIT还抑制CD226同型二聚化，这是CD226/CD155相互作用必需的(Dougall WC等人,Immunol.Rev.2017；276:112-120(2017))。

已经提出，激动CD226的免疫刺激性作用可能在治疗癌症中有益(Pauken,KE和EJWherry,Cancer Cell 2014:26:785-787)。因此，增进抗肿瘤免疫应答可以是有效的癌症治疗手段。CD226可以用于控制NK细胞和T细胞功能，并且它已经参与NK细胞和CD8

在缺少CD226的小鼠中，显示当识别非专职抗原呈递细胞呈递的抗原时，CD8

已经报导了某些抗CD226抗体，如小鼠IgG1 KRA236(Bottino,C,FrontImmunol.2014；5:56)、大鼠IgG2a TX25(Van Vo,A,Molecular Immunology；2016；69:70-76)；大鼠IgG2b 10e5(Dardalhon,V.J Immunol 2005；175:1558-1565)；小鼠TX94、TX95、TX96、TX107和TX108(Okumura,G,Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis andImmunotherapy,2017；36(3):135-139)、2E6和3B9(Hou,S,The J.Biol.Chemistry；2014；289(10):6969–6977)、NewE1(Gaud,G等人,Sci.Signal.2018；11:eaar3083；doi:10.1126/scisignal.aar3083)、DX11(Bio-Rad MCA2257)、11A8(BioLegend 338311)和LeoA1(Millipore Sigma MABT398)。

但是，尚未报告人抗人CD226激动剂抗体，并且没有处于临床开发以治疗癌症的抗CD226抗体。因此，需要与人CD226结合、增强免疫应答并用于治疗癌症的激动剂抗体。

本文所述的抗人CD226激动剂抗体与人CD226结合，刺激T细胞衍生的IFNγ产生并在鼠肿瘤模型中作为单药治疗抑制肿瘤生长。在一个实施方案中，本发明的抗体展示了所需的物理和化学稳定性，包括但不限于体内稳定性、热稳定性、溶解度、低自我缔合，和药代动力学特征，并且因此潜在地可用于治疗癌症。在另一个实施方案中，本发明的抗人CD226激动剂抗体是全人抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗人CD226激动剂抗体是人源化抗体。

本公开还提供了结合人CD226(SEQ ID NO:13)或其胞外片段(例如，SEQ ID NO:14)并且在癌症的鼠肿瘤模型中作为单药疗法抑制肿瘤生长的人抗人CD226 IgG1-效应子无效(IgG1-EN)抗体，所述抗人CD226抗体包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链(LC)的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成的抗体。

本公开还提供一种能够表达抗人CD226抗体的哺乳动物细胞，所述抗体包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR的抗人CD226抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成的抗体。

本公开还提供一种用于产生抗人CD226抗体的方法，所述方法包括培养能够表达抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，其中抗体包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成的抗体。本公开还提供通过该方法产生的抗人CD226抗体。本公开还提供一种药物组合物，其包含通过该方法产生的抗人CD226抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本公开还提供一种DNA分子，其包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、或SEQ IDNO:11和12的序列的多核苷酸。本公开还提供一种包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:11和12的序列的多核苷酸。

本公开还提供一种包含抗人CD226抗体和可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，所述抗体包含：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCVR和具有SEQID NO:8的氨基酸序列的LCVR的抗人CD226抗体。在一些实施方案中，抗人CD226抗体包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，抗人CD226抗体由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成。

本公开提供了治疗方法和使用方法。已经研究了CD226作为共刺激受体在免疫系统中的作用。例如，相比野生型(WT)细胞，缺乏CD226的小鼠在体外针对表达CD226配体的肿瘤显示显著更少的细胞毒活性(Iguchi-Manaka,A,J.Exp.Med.2008；205(13):2959-2964)。因此，当激活CD226途径时，免疫系统活性升高，这可以在治疗癌症中通过刺激(激动)CD226途径加以利用，并且激动剂抗人CD226抗体可以通过激活NK细胞和/或T细胞活性提供对抗癌症的治疗效果。

CD112和/或CD155表达已经涉及多种人实体瘤，包括结直肠癌(Masson,D.,Gut,2001；49:236-240；Tahara-Hanaoka,S.Blood,2006；107:1491-1496)；胃癌(Tahara-Hanaoka,S.,Blood,2006；107:1491-1496)；卵巢癌(Carlsten,M.,Cancer Res.,2007:67:1317-1325)；胰腺癌(Nishiwada,Anticancer Research；2015；35:2287-2298)；并涉及前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌(Sloan,K.,BMC Cancer2004；4:73)。

肺腺癌中CD155过量表达与淋巴结转移显著相关，CD155过量表达阳性的患者中肿瘤的细支气管肺泡癌比率和无疾病存活率显著地低于CD155过量表达阴性的患者中(Nakai,R,Cancer Sci.；2010；101(5):1326–1330)。多变量存活分析揭示CD155表达是不利结局的独立风险因子(Nakai,R,Cancer Sci.；2010；101(5):1326–1330)。

本公开提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的抗人CD226抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在另一个实施方案中，本公开还提供了包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR的抗体。在另一个实施方案中，本公开还提供了包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC的抗体。在另一个实施方案中，本公开还提供了由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成的抗体。

在一些实施方案中，本公开还提供了癌症是实体瘤癌症。在另一个实施方案中，本公开还提供了实体瘤癌症是膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、胃(胃的)癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或尿道上皮癌。在一个优选的实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在另一个优选实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。

本公开提供一种与人CD226(SEQ ID NO:13)或与其胞外片段(例如，SEQ ID NO:14)结合的抗人CD226抗体用于疗法中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成的抗体。

在一个实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法。在另一个实施方案中，本公开提供了癌症是实体瘤癌症。在另一个实施方案中，本公开提供了实体瘤癌症是膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、胃(胃的)癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或尿道上皮癌。在一个优选的实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在另一个优选实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。

本公开还提供一种与人CD226(SEQ ID NO:13)或与其胞外片段(例如，SEQ ID NO:14)结合的抗人CD226抗体用于制造治疗癌症的药物的用途，所述抗体包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC和具有SEQID NO:10的氨基酸序列的LC的抗体。在另一个实施方案中，本公开提供了由具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成的抗体。

在一个实施方案中，本公开还提供了癌症是实体瘤癌症。在另一个实施方案中，本公开还提供了实体瘤癌症是膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃(胃的)癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或尿道上皮癌。在一个优选的实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在另一个优选实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。

本公开还提供一种人抗人CD226激动剂抗体。在一个实施方案中，体内施用时，所述人抗人抗体具有抗肿瘤效果。本公开提供能够表达所述人抗人抗体的哺乳动物细胞。本公开还提供一种用于产生所述人抗人CD226抗体的方法，所述方法包括：培养能够表达该抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体。

本公开还提供一种人抗人CD226抗体用于疗法中。在一个实施方案中，人抗人CD226抗体是激动剂抗体。在另一个实施方案中，人抗人CD226抗体刺激免疫应答。在另一个实施方案中，体内施用时，人抗人CD226抗体具有抗肿瘤活性。

本公开还提供人抗人CD226抗体用于治疗癌症。在一个实施方案中，本公开提供一种人抗人CD226激动剂抗体用于治疗实体瘤癌症。在另一个实施方案中，该抗体刺激免疫应答。在另一个实施方案中，体内施用时，该抗体具有抗肿瘤活性。

在一个实施方案中，本公开提供一种人抗人CD226抗体用于治疗实体瘤癌症。在另一个实施方案中，本公开提供了实体瘤癌症是膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、胃(胃的)癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或尿道上皮癌。在一个优选的实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在另一个优选实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。

本公开提供人抗人CD226激动剂抗体用于制造治疗癌症的药物的用途。在一个实施方案中，本公开提供了癌症是实体瘤癌症。在另一个实施方案中，本公开提供了实体瘤癌症是膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、胃(胃的)癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或尿道上皮癌。在一个优选的实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在另一个优选实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包含将有效量的本文中公开的抗体同时、独立或依次与一种或多种抗肿瘤药组合施用。抗肿瘤药的非限制性实例包括雷莫芦单抗(ramucirumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、吉西他滨、培美曲塞、加卢色替(galunisertib)、阿贝西利(abemaciclib)、顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、长春瑞滨、艾瑞布林(eribulin)、紫杉醇、注射用蛋白质结合型紫杉醇混悬剂、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX(亚叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)、FOLFIRI(亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康)、西妥昔单抗、EGFR抑制剂、Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、CDK4/6抑制剂、CDK7抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂、TGFβ抑制剂、TGFβ受体抑制剂、IL-10和聚乙二醇化IL-10(例如，pegilodecakin)。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包含将有效量的本文中公开的抗体的化合物同时、独立或依次与一种或多种免疫肿瘤学药物组合施用。免疫肿瘤学药物的非限制性例子包括纳武单抗(nivolumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、pidilizumab、派姆单抗(pembrolizumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、乌瑞芦单抗(urelumab)、利瑞鲁单抗(lirilumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、抗Tim3抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗PD-L1抗体LY3300054(在WO2017/034916和US 2017/0058033中分别作为SEQ ID NO:10和11示出了阐述所述抗体的重链序列和轻链序列)。在另一个优选实施方案中，免疫肿瘤学药物是抗PD-1抗体。在另一个优选实施方案中，抗PD-1抗体是派姆单抗。

在另一个实施方案中，CD226抗体包含：具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR。在另一个实施方案中，本发明提供一种能够表达所述抗体的哺乳动物细胞；一种用于产生抗体的方法，所述方法包括培养哺乳动物细胞和回收该抗体；一种通过该方法产生的抗体；和一种药物组合物，其包含该抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一个实施方案中，CD226抗体包含：具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC。在另一个实施方案中，本发明提供一种能够表达抗体的哺乳动物细胞；一种用于产生抗体的方法，所述方法包括培养哺乳动物细胞和回收该抗体；一种通过该方法产生的抗体；和一种药物组合物，其包含该抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一个实施方案中，CD226抗体由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成。在另一个实施方案中，本公开还提供一种能够表达抗体的哺乳动物细胞；一种用于产生抗体的方法，所述方法包括培养哺乳动物细胞和回收该抗体；一种通过该方法产生的抗体；和一种药物组合物，其包含该抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本公开还提供一种DNA分子，所述DNA分子包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:11和12的序列的多核苷酸；一种包含该DNA分子的哺乳动物细胞。

本公开还提供一种治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本发明抗体。

本公开还提供本发明的抗体用于治疗中。在一个实施方案中，本公开还提供了所述用途是治疗癌症。

本公开还提供本发明的抗体用于制造治疗癌症的药物。

在一个实施方案中，本公开还提供了癌症是实体瘤癌症。在另一个实施方案中，实体瘤癌症是膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、(胃)癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或尿道上皮癌。在一个优选的实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在另一个优选实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。

在一个优选的实施方案中，本发明提供与人CD226结合并阻断CD226与CD112结合、但不阻断与CD155结合的抗人CD226抗体。

在另一个优选实施方案中，本发明还提供一种抗人CD226抗体，其显示出激动剂功能，即，在暴露于抗人CD226抗体的CD226

在另一个优选实施方案中，本发明还提供一种抗人CD226抗体，其显示激动剂功能，即，相对于(例如，如本文中公开的)未体外暴露于抗人CD226抗体的HEK细胞，如本文中公开那样在人胚肾(HEK)细胞中诱导NF-KB活化报道基因。

在另一个优选实施方案中，本发明提供不活化血小板的抗人CD226抗体。在一个实施方案中，使用流式细胞术进行测定，来确定血小板表面上的p-选择(CD62P)的表达情况，以确定血小板活化状态。

如本文所用的术语“抗体”指一种多肽复合体，其具有两条重链(HC)和两条轻链(LC)，从而重链和轻链通过二硫键互联；其中抗体是IgG亚类抗体。每个HC包含N端HCVR和重链恒定区(“HCCR”)。每个LC包含N末LCVR和轻链恒定区(“LCCR”)。当在某些生物系统中表达时，具有原初人Fc序列的抗体在Fc区中糖基化。一般，糖基化发生在抗体的Fc区中高度保守的N-糖基化位点处。N-聚糖一般与天冬酰胺连接。抗体也可以在其他位置糖基化。

本发明的抗体是非天然存在的多肽复合体。本发明的DNA分子是这样的DNA分子，其包含非天然存在的编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有本发明抗体中至少一种多肽的氨基酸序列。

HCVR区和LCVR区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布较保守的区域，称为构架区(FR)。每个HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，HC的三个CDR称作“HCDR1、HCDR2和HCDR3”并且LC的三个CDR称作“LCDR1、LCDR2和LCDR3”。CDR含有大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。

可以通过将编码HCVR的DNA与编码HCCR的另一DNA分子有效连接，将编码HCVR区的分离DNA转化成全长HC基因。本领域已知人以及其他哺乳动物的HCCR基因的序列。例如可以通过标准PCR扩增法获得涵盖这些区域的DNA片段。

可以通过将编码LCVR的DNA与编码LC恒定区的另一DNA分子有效连接，将编码LCVR区的分离DNA转化成全长LC基因。本领域已知人以及其他哺乳动物的LCCR基因的序列。可以通过标准PCR扩增法获得涵盖这些区域的DNA片段。LCCR可以是κ恒定区或λ恒定区。优选地，对于本发明的抗体，LCCR是κ恒定区。

本发明的多核苷酸可以在该序列已经与表达控制序列有效连接后表达于宿主细胞中。表达载体一般在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分是可复制的。通常，表达载体将含有选择标记，例如，四环素标记、新霉素标记和二氢叶酸还原酶标记，以允许检测那些用目的DNA序列转化的细胞。

可以在哺乳动物细胞中轻易地产生本发明的抗体，所述哺乳动物细胞的非限制性实例包括CHO、NS0、HEK 293或COS细胞。使用本领域熟知的技术培养宿主细胞。

可以通过熟知方法将含有目的多核苷酸序列(例如，编码抗体的多肽和表达控制序列的多核苷酸)的表达载体转移至宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型变动。

可以使用多种蛋白质纯化方法，并且本领域已知并且例如在Deutscher,Methodsin Enzymology 182:83-89(1990)和Scopes,Protein Purification:Principles andPractice,第3版,Springer,NY(1994)中描述了这类方法。

在本发明的其他实施方案中，抗体(或编码它的核酸)以分离的形式提供。如本文所用，术语“分离的”指不含或基本上不含细胞环境存在的任何其他大分子种类的蛋白质、肽或核酸。如本文所用的“基本上不含”意指，目的蛋白质、肽或核酸包含多于80％(基于摩尔)、优选地多于90％和更优选地多于95％存在的该大分子种类。

可以通过肠胃外途径施用本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物，肠胃外途径施用的非限制性实例是皮下施用和静脉内施用。本发明的抗体可以按单个或多个剂量地仅与可药用载体、稀释剂或赋形剂一起施用至患者。本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的方法来制备(例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版(2012),A.Loyd等人,Pharmaceutical Press)并且包含(如本文中公开的)抗体和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。

如本文所用，“CD226”指具有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的受体；uniprot.org/uniprot/Q15762。在rndsystems.com存在CD226胞外结构域-His标签构建体的实例，产品编号Q154762。

“CD226”的别名是DNAX辅助分子-1、DNAM-1、DNAM1、PTA1和TLiSA1。

如本文所用，“抗人CD226激动剂抗体”指这样的抗体，其(a)结合于人CD226(SEQID NO:13)或结合于其胞外片段(例如，SEQ ID NO:14)，(b)在体外刺激免疫应答，例如，如在本文公开的T细胞细胞因子(例如，IFN-γ)释放测定法中测定的，或在体内刺激免疫应答，例如，如通过受试者的血液或血清中的T细胞细胞因子(例如，IFN-γ)释放所测定，和(c)体内施用至受试者时，产生抗肿瘤活性。

在单克隆治疗性抗体的语境下，术语“人”、“人源化”和“全人”是本领域普通技术人员熟知的(Weiner LJ,J.Immunother.2006；29:1-9；Mallbris L等人,J.Clin.Aesthet.Dermatol.2016；9:13-15)。

“CD155”的别名是脊髓灰质炎病毒受体、PVR、Necl-5、NECL5、Tage4、HVED和PVS。

“CD112”的别名是Nectin细胞黏附分子2、nectin-2、NECTIN2、PRR-2、PVRL2、PVRR2和HVEB。

CD226途径的免疫刺激性作用例如可以由与细胞表面上激动活化性信号的LFA-1缔合介导。LFA-1接合导致Fyn激酶介导的CD226R胞质结构域磷酸化(Marcus,A,AdvImmunol.2014；122:91-128)。在另一个实例中，CD226还可以介导对其增强NK细胞细胞毒性和细胞因子产生的能力是必需的活化生物化学信号；这些信号由保守的ITT基序或ITT样基序(pYxNx)引发，所述基序经历Src家族激酶的磷酸化并招募衔接子Grb2。接下来，Grb2激活Vav-1、PI3′K、和PLC-γ1，这导致Erk激活、Akt激活和钙流的激活。这样的途径促进肌动蛋白聚合和颗粒极化，因而增强细胞毒性。由于CD226表达于其他免疫细胞中，包括CD8

本领域普通技术人员已知体外分析CD226活性的方法，例如在Gaud,G等人,Sci.Signal.2018；11:eaar3083；doi:10.1126/scisignal.aar3083中描述。

实体瘤体内鼠模型是本领域普通技术人员熟知的，如本文中显示并且例如，如以下文献公开：Sanmamed MF等人,Ann.Oncol.2016；27:1190-1198；Manning HC等人,J.Nucl.Med2016；57(Suppl.1):60S-68S；Teich BA.Cancer Ther.2006；5:2435；RongvauxA等人,Ann.Rev.Immunol.2013；31:635-74；Stylli SS等人,J.Clin.Neurosci 2015；619-26；Oh T等人,J.Transl.Med.2014；12:107-117；Newcomb,EW等人,Radiation Res.2010；173:426-432；Song Y等人,Proc Natl.Acad.Sci.USA 2013；110:17933-8；和Rutter EM等人,Scientific Reports 2017；7:DOI:10.1038/s41598-017-02462-0。

如本文所用，就实体瘤而言，术语“抗癌活性”指肿瘤尺寸缩减；相对于未经抗CD226激动剂抗体治疗的患者，经抗CD226激动剂抗体治疗的患者中患者体内从一个阶段至另一个阶段的癌症进展下降；或相对于未经抗CD226激动剂抗体治疗的患者，经抗CD226激动剂抗体治疗的患者中转移性癌症的发生率下降。

在临床实体瘤癌治疗的语境下，可以通过以下方式评估CD226途径的免疫刺激性作用的活化(激动)：使用本领域普通技术人员熟知的技术，例如，使用以下一者或多者，检查肿瘤消退：X射线成像、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术、超声成像、组织活检、肿瘤活检、手术可及和目视查看、病理学分析、免疫组织化学、体液或组织生物标记物分析、体格检查和触诊。

可以调整剂量方案以提供所需的最佳反应(例如，治疗作用)。可以滴定治疗剂量以优化安全性和功效。用于静脉内(i.v.)或非静脉内施用的局部或全身性或其组合的给药方案一般为从单次快速浓注剂量或连续输注至每日多次施用(例如，每4-6小时施用)，或如治疗医师和患者状况所指示。给药量和频率可以由治疗患者的医师确定。

术语“治疗”(或“治疗了”)指延缓、中断、中止、缓解、阻止、减少现有症状、病症、病状或疾病或者逆转其进展或严重程度。

“有效量”意指本发明抗体的量或包含本发明抗体的药物组合物的量，所述量将对组织、系统、动物、哺乳动物或人类激发正在为研究者、医学医生或其他临床医生寻求的生物学反应或医学反应或想要的治疗效果。抗体的有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体在个体中激发所需反应的能力而变动。有效量也是这样一种量，其中抗体的治疗有益作用超过任何有毒或有害作用。

有效量可以由本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察类似条件下所获得的结果轻易地确定。为患者确定有效量时，主治诊断医师考虑众多因素，包括但不限于：患者的体型大小、年龄和总体健康状况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的程度或牵涉面或严重程度；个体患者的反应；施用的具体化合物；施用模式；所施用制剂的生物利用度特征；选择的给药方案；同时用药使用情况；和其他相关情形。

如本文所用，术语患者的“有效应答”或患者的“治疗应答性”指当施用本公开的抗体时赋予患者的临床或治疗益处。这类益处包括以下任一项或多项：延长的存活期(包括总生存期和无进展生存期)；产生客观应答(包含完全应答或部分应答)；疾病稳定化；或改善癌症的迹象或症状等。

本文公开的方法的潜在优点是在患者中以可接受的安全性特征产生明显和/或延长的抗肿瘤活性的可能性，所述可接受的安全性特征包括可接受的耐受性、毒性和/或不良事件，从而患者总体上从治疗方法获益。可以依据评价癌治疗时常用的多个终点度量本公开的治疗的功效，所述终点包括但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩减、至进展的时间、总生存期、无进展生存期、总应答率、应答持续时间和生活质量。

如本文所用，术语“实体瘤”指组织中并非血液、淋巴或骨髓的肿瘤。

如本文所用，术语“完全应答(CR)”指全部目标病灶均消失。任何病态淋巴结(无论是否为目标或非目标)必须在短轴方面缩减到<10mm。肿瘤标志物结果必须已经正常化。

如本文所用，术语“部分应答(PR)”意指以基线总计直径作为参考，目标病灶的直径总和至少减少30％。

如本文所用的术语“进展性病情(PD)”意指以参与研究时最小总和(若这种总和最小，则包括基线总和)作为参考，目标病灶的直径总和增加至少20％。除相对增加20％之外，该总和还必须展示至少5mm的绝对增加。出现1个或多个新病灶也视为进展。对于模棱两可的进展结果(例如，非常小的和不确定的新病变；现有病灶中的囊性变或坏死)，治疗可以继续直至下一次计划内评估为止。如果在下一次计划内评估时确认进展，则进展日期应当是怀疑进展时的更早日期。

如本文所用，术语“无进展生存期(PFS)”定义为从任何研究药物首剂日期起直至影像学上有据可查的PD或任何原因所致死亡的日期(以较早者为准)为止的时间。

如本文所用，术语“总生存期(OS)”定义为从任何药物首剂日期起至任何原因所致死亡的日期为止的时间。

如本文所用，“抗体1”指这样的抗体，其具有SEQ ID NO:1的HCDR1氨基酸序列、SEQID NO:2的HCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:3的HCDR3氨基酸序列、SEQ ID NO:4的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5的LCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:6的LCDR3氨基酸序列、SEQ ID NO:7的HCVR氨基酸序列、SEQ ID NO:8的LCVR氨基酸序列、SEQ ID NO:9的HC氨基酸序列、SEQ IDNO:10的LC氨基酸序列、SEQ ID NO:11的HC DNA序列和SEQ ID NO:12的LC DNA序列。

使用与North等人.J.Mol.Biol.2011:406:228-256方法一致的编号规则，对本文所示序列的每种抗体中的构架序列和CDR序列编号。

表1中列出了本文所用的序列标识符。

抗体表征、产生、表达和纯化

使用SEQ ID NO:11中所示的HC多核苷酸序列和SEQ ID NO:12中所示的LC多核苷酸序列在哺乳动物细胞中产生抗体，导致全长抗体(此后称作“抗体1”)的产生，所述全长抗体具有SEQ ID NO:9中所示的HC氨基酸序列和SEQ ID NO:10中所示的LC氨基酸序列。

可以通过使用已知方法产生本发明的抗体，所述方法包括但不限于噬菌体展示。另外，可以使用本文所述的测定法，进一步筛选如上文所述那样衍生的抗体。

在标题为“氨基酸和核苷酸序列”章节部分中示出了抗体1的HC可变区和LC可变区的多肽、重链和轻链完整氨基酸序列和编码它们的核苷酸序列。

SEQ ID NO:13中示出了人CD226的序列，并且SEQ ID NO:14中示出了人CD226胞外结构域(ECD)-Fc融合物的序列。

可以例如基本上如下那样产生并纯化本发明的抗体，包括但不限于抗体1。可以使用预先确定的最佳HC:LC载体比率或同时编码HC和LC两者的单个载体系统，用表达系统瞬时或稳定转染适宜的宿主细胞，例如HEK 293或CHO，来分泌抗体。使用许多常见技术中任一技术纯化其中已经分泌有抗体的明确培养基。例如，可以将培养基便利地施加至MabSelect柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)，所述柱已经用相容性缓冲液如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)平衡。可以洗涤所述柱以移除非特异性结合的组分。可以洗脱结合的抗体，例如，借助pH梯度洗脱(如20mM Tris缓冲液pH 7至10mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0、或磷酸盐缓冲盐水pH 7.4至100mM甘氨酸缓冲液pH 3.0)。可以检测抗体级分，如通过UV吸光度或SDS-PAGE检测，并且随后可以汇集这些级分。取决于预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常见技术，将抗体浓缩和/或无菌过滤。可以通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换、多模式或羟基磷灰石层析有效地移除可溶性聚集物和多聚体。产物可以在-70℃立即冷冻或可以冻干。

抗体1与人CD226结合

可以通过ELISA测量本文公开的抗体结合人CD226的能力。为了测量与人CD226的结合，将96孔板(Immulon 2HB)在4℃用人CD226-Fc(R&D Systems)包被过夜。将诸孔用封闭缓冲液(含有1％牛血清白蛋白的PBS)封闭2小时。将诸孔用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤三次。随后将抗体1或对照IgG(100μL)按不同浓度添加并且在室温温育1小时。在洗涤后，将平板在室温与100μL山羊抗人IgG F(ab’)2-HRP缀合物(Jackson Immuno ResearchLaboratories)温育45分钟。将平板洗涤并且随后与100μL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺温育。在

在基本上如上文所述进行的实验中，抗体1以0.1nM的EC50结合人CD226。

抗体1与食蟹猴CD226结合

可以使用流式细胞分析测量本文公开的抗体与细胞表面食蟹猴CD226结合的能力。通过使用Fugene-6试剂(Promega)根据生产商的操作方案，将Cyno-CD226质粒DNA转染入人HEK 293细胞(ATCC)中，产生表达食蟹猴CD226的稳定细胞。使用含有10％胎牛血清和1％GlutaMAX

在FACS缓冲液中洗涤后，将第二抗体—别藻蓝蛋白(APC)缀合的山羊抗人IgG,F(ab’)

在基本上如上文所述进行的实验中，浓度为0.14μg/mL的抗体1显示2917.5(11495/3.94)的更高MFI比率。

抗体1与细胞表面上的人CD226结合

可以使用流式细胞分析测量本文公开的抗体与细胞表面人CD226结合的能力。通过使用Fugene-6试剂(Promega)根据生产商的操作方案，将人CD226质粒DNA转染入人HEK293细胞(ATCC)中，产生表达人CD226的稳定细胞。使用含有10％胎牛血清和1％GlutaMAX

在FACS缓冲液中洗涤后，将第二抗体，即，别藻蓝蛋白(APC)缀合的山羊抗人IgG,F(ab’)

在基本上如上文所述进行的实验中，浓度为0.14μg/mL的抗体1显示850.78(7640/8.98)的更高MFI比率。

抗体1的动力学/亲和力结果

Biacore T200仪器可以用来测量固定的人CD226-Fc与抗体1结合的动力学。借助胺偶联法(GE Healthcare)，将重组的人CD226-Fc融合蛋白(R&D Systems)共价地固定到CM5传感芯片上。以HBS-EP+缓冲液中100μL/min的流速进行CD226抗体测试。将样品按多种浓度注射上样，并且在25℃获得量值。每次用10mM甘氨酸-HCl pH 2.1以流速10μL/min注射样品30秒并且随后用缓冲液固定10秒后，使表面再生。使用Biacore T200软件评价浓度1.95nM至1000nM的传感图。从稳态拟合计算平衡解离常数(KD)或结合亲和力常数。在基本上如上文所述进行的实验中，抗体1以表2中所示的亲和力常数结合人CD226。

表2

抗体1的NF-κB萤光素酶报道分子测定法活性

可以如下测量本文公开的抗体激活NF-κB的能力。在含有10％胎牛血清和1％GlutaMAX

在基本上如上文所述进行的实验中，抗体1以4.11nM的EC50诱导人CD226介导的NF-kB报道分子。

抗体1促进T细胞衍生的干扰素-γ产生

可以如下测量本文公开的抗体的促进T细胞衍生性干扰素-γ(IFN-γ)产生的能力。通过Ficoll密度梯度离心(

在基本上如上文所述进行的实验中，抗体1增强借助CD3/CD28共刺激作用对人PBMC的次优活化，如依据IFN-γ细胞因子产生所测量。在这个方面，相对于对照IgG处理，用100μg/mL的抗体1处理导致IFN-γ的产生增加1.6倍。

抗体1在已建立肿瘤模型中的抗肿瘤功效

将HCC827人非小细胞肺癌(ATCC)肿瘤细胞系在其相应的培养基中维持并收获供移植。将肿瘤细胞(1x 10

在基本上如上文所述进行的实验中，用抗体1治疗的小鼠显示明显的肿瘤生长抑制作用(T/C％＝56.7；P<.01)。

氨基酸和核苷酸序列

SEQ ID NO:1(抗体1HCDR1)

AASGFTFSSYAMS

SEQ ID NO:2(抗体1HCDR2)

AISGSGGSTYYADSVKG

SEQ ID NO:3(抗体1HCDR3)

ARDRWELHDAFDI

SEQ ID NO:4(抗体1LCDR1)

RASQSISSYLN

SEQ ID NO:5(抗体1LCDR2)

YRASTLQS

SEQ ID NO:6(抗体1LCDR3)

QQSYSTPDT

SEQ ID NO:7(抗体1HCVR)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRWELHDAFDIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:8(抗体1LCVR)

VIWMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPRLLIYRASTLQSGVPSRFSGDGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPDTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO:9(抗体1HC)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRWELHDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:10(抗体1LC)

VIWMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPRLLIYRASTLQSGVPSRFSGDGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPDTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:11(抗体1HC DNA)

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgagagatcggtgggagcttcatgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgcactgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtatgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaagactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccatcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctattccaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggcaaa

SEQ ID NO:12(抗体1LC DNA)

gtcatctggatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaggctcctgatctaccgtgcatccactttacaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcgatggatctggaacacatttcactctcaccatcagcagcctccagcctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccccgacacttttggccaggggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO:13(人CD226)

MDYPTLLLALLHVYRALCEEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV

SEQ ID NO:14(人CD226-胞外结构域-Fc)

EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNHIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK