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血液中结直肠癌的分子标记物及其检测试剂盒和方法

文献发布时间：2023-06-19 10:22:47

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种血液中结直肠癌的分子标记物及其检测试剂盒和方法。

背景技术

目前在结直肠癌筛查上主要有几种常用技术。一种是大便隐血试验。通常肠癌的发生演变在早期可以没有任何征兆，癌细胞可在大肠肠壁上生长数十年再转移到其他部位，在没有任何症状前，增生的组织可渗出少量血液，血液进入大便被排出。而大便隐血试验就是检测大便中的血液成分(检测对象是血红蛋白)，若多次、持续的阳性反应提示消化道出血，应做进一步检查以警惕肠道肿瘤的发生。大便隐血试验最主要的优点是结果显示快、清晰，结果可以半定量。但其存在一系列缺点：首先，其特异性差，受饮食影响大。含亚铁离子的食物和药物对结果有干扰，假阳性率30％。隐血检查前，指导患者应避免服用铁剂、动物血、肝类、瘦肉以及大量绿叶蔬菜3天，如有牙龈出血，误咽下血性唾液，以防粪便隐血检查呈假阳性；其次，其敏感度低，出血量>90μg/ml才能检出；再次，该方法学限制条件多：患者提前准备时间长，由于取材部位不同，反应时间不同，对显色的判断不同，故在同一方法的试验中，也可产生误差，因此一般测试时候均要求患者采用不同天的粪便样品连续测定。

另一种方法是肠镜检查。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可靠的诊断方法。绝大多数早期肠癌患者可由内镜检查发现并确诊。它通过肛门插入可检查到直肠、乙状结肠、降结肠、横结肠、升结肠和盲肠以及与大肠相连的一小段小肠(回盲末端)。通过镜子不但可以清楚地发现肠道病变，还可对部分肠道病变进行治疗，如：大肠息肉等良性病变镜下直接摘除，对肠道出血进行镜下止血，对大肠内异物进行清除。肠镜检查技术是目前其它诊疗手段无法替代的主要手段。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可靠的诊断方法。肠镜虽然是目前结直肠癌的金标准，但是也有其自身的一些缺点：首先，其需要检查前准备，作肠镜需要在检查前3天开始进食流质或少渣半流质饮食，检查当天上午空腹，检查前一天开始服用甘露醇等导泻剂清洁肠道，服用的液体量通常高达2L，清洁灌肠以保证肠道的清洁度，之后不能再进食。检查时医生会通过肠镜向肠腔内注入一定量气体使肠道膨大便于观察。由于结肠结构迂回曲折，检查过程中被检查者会有不同程度的胀痛或牵拉感觉。对于过分紧张或高度肠痉挛的受检者，则需要使用镇静剂或解痉药物。对于不能配合的小儿，则需要在麻醉下进行。其次，其对医生的操作熟练水平有很高的要求，初学者容易在肠镜下遗漏病变部位造成漏诊。由于检查过程中需要注入气体，会使肠内压力增大，易引起穿孔。再次，病人在检查过程中费力，费时，有一定的痛苦。并且检查费用高，较难大规模推广。

除了上述两种方法之外，分子诊断方法是近年来发展迅速的癌症诊断方法。目前，已有大量的结直肠癌分子标记物在组织和血液样本中被研究和报道。且有相关的基于分子检测的产品应用于临床上，这部分产品目前根据样品的不同主要分成两类，一类是基于粪便中的DNA进行检测，例如国外的Cologuard，以及国内的Colosafe，都是针对于粪便中的DNA进行结直肠癌的筛查以及辅助诊断。另外一类是基于血液中的DNA进行检测，例如国外的Epigenomics公司的Epicolon。

基于分子水平的结直肠癌筛查诊断产品首先对于患者而言，最重要的一点是无侵入性检测，安全性非常高，这对于金标准的肠镜的依从性较低是一个非常好的辅助方案；另外一个特点是，基于分子水平的筛查诊断产品，不管是灵敏性或是特异性都有不错的表现，在这点上是好过大便隐血检测的；另外很重要一点是，基于分子水平的筛查诊断产品基本上不对于患者有更多的要求，无需进行特别的饮食禁忌，检测时也无需进行特殊的准备，对于患者非常便捷。但是，目前这些方法也存在着一定的问题：对于粪便样品来讲，粪便中存在多种酶类，会消化，降解粪便中的DNA，另外，粪便中的成分复杂，干扰成分过多，对于样品的处理提出比较高的要求，而样品的处理不当，则容易影响下游的检测，最重要的一个缺点是，由于粪便中含有大量的微生物DNA，且占据绝大比例，所以，对于人类DNA的检测方法的灵敏性以及特异性提出一个非常高的要求，同时进行对应的处理也会增加检测方法的成本以及操作的复杂性。而对于血液样本的检测，DNA的提取以及DNA的纯度有着一定的保证，但是血浆中的cfDNA(Cell-free DNA)含量远比粪便中人源DNA的低，特别对于早期的肿瘤样本来说，cfDNA的含量更低，另外一方面，相比粪便中脱落细胞的DNA，血浆中的cfDNA完整性更差，是比较碎片化的DNA，开发相对应的检测难度很大。针对cfDNA的这种特性，目前市面上的唯一一款产品(Epicolon)只针对一个标记物(marker)进行检测，但单一的marker在灵敏性以及特异性上还存在着可以提高的空间，特别对于早期肿瘤的检测。另外一方面，针对cfDNA的这种特性，更多地利用二代测序平台进行cfDNA检测，二代测序可以灵敏性地检测痕量的cfDNA，同时，二代测序是一个高通量的检测方案，不管是对于marker还是样品数目来讲。但是基于二代测序平台开发的产品也有一定的局限性，第一就是检测周期比较长，从样品DNA的提取到上机测序，再到数据分析出报告，时间周期比较长。另外一方面，二代测序平台的成本比较高。这两点对于产品的推广应用存在着一定的局限性，特别是在早期肿瘤的筛查诊断上。这样一来，开发一款针对血浆cfDNA的无创检测产品，同时具备有高灵敏性，以及快捷便宜的特性对于临床上的早期筛查诊断意义重大。

然而，对于早期的肿瘤样本来说，cfDNA的含量更低，这对于而开发一个满足多markers通量，又需要检测手段有足够好的灵敏性的检测方法是一个很大的挑战，则在体系的优化方面以及稳定性上存在一定的技术挑战。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一类用于检测血液中结直肠癌的标志物。

实现上述目的技术方案如下。

一种检测血液中结直肠癌相关的分子标志物，包括FBN1、SFMBT2、FAM72C、ITGA4、ZNF132、KCNJ12中的任意一种或者两种以上的组合。

在其中一个实施例中，包括FBN1，SFMBT2，FAM72C，和ITGA4。

在其中一个实施例中，还包括以下分子标记物中至少一种：ST8SIA4、TAF3、TWIST1、VAV3-AS1、C9orf50、KCNQ5、THBD、ZNF304、EVC、S1PR1、ZFHX4-AS1、EMID1、FAM19A4、NEUROD。

在其中一个实施例中，所述检测血液中结直肠癌的分子标志物是TWIST1，VAV3-AS1，FBN1，C9orf50，SFMBT2，KCNQ5，FAM72C，ITGA4，KCNJ12，ZNF132的组合。

在其中一个实施例中，所述分子标志物为TWIST1，C9orf50，KCNJ12，ZNF132的组合。

在其中一个实施例中，所述分子标志物为FBN1、SFMBT2、FAM72C、ITGA4、ZNF132、KCNJ12、ST8SIA4、TAF3、TWIST1、VAV3-AS1、C9orf50、KCNQ5、THBD、ZNF304、EVC、S1PR1、ZFHX4-AS1、EMID1、FAM19A4、NEUROD的组合。

本发明的另一个方面，是提供了上述分子标志物在制备检测血液中结直肠癌的试剂盒中的应用。

本发明的另一个方面，是提供了一种可用于检测结直肠癌的试剂盒。

一种用于检测结直肠癌的试剂盒，包括用于对ST8SIA4、ZNF132、TAF3、TWIST1、VAV3-AS1、FBN1、C9orf50、SFMBT2、KCNQ5、FAM72C、ITGA4、KCNJ12、THBD、ZNF304、EVC、S1PR1、ZFHX4-AS1、EMID1、FAM19A4、NEUROD1中的任意一种或两种以上分子标记物的组合进行检测的试剂。

在其中一些实施例中，包括有检测20种分子标记物中的至少一种基因甲基化的引物和探针，所述引物和探针包括：

针对ST8SIA4分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、和SEQ IDNO.7；SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、和SEQ IDNO.9；

针对ZNF132分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13、和SEQ IDNO.16；SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、和SEQ ID NO.17；SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、和SEQ ID NO.18；

针对TAF3分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22、和SEQ IDNO.25；SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.23、和SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、和SEQ ID NO.27；

针对TWIST1分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.31、和SEQ IDNO.34；SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.32、和SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、和SEQ ID NO.36；

针对VAV3-AS1分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.40、和SEQID NO.43；SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41、和SEQ ID NO.44；SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.42、和SEQ ID NO.45；

针对FBN1分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.49、和SEQ IDNO.52；SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.50、和SEQ ID NO.53；SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.51、和SEQ ID NO.54；

针对C9orf50分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.58、和SEQID NO.61；SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.59、和SEQ ID NO.62；SEQ ID NO.57、SEQ ID NO60、和SEQ ID NO.63；

针对SFMBT2分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.64、SEQ ID NO67、和SEQ IDNO.70；SEQ ID NO.65、SEQ ID NO68、和SEQ ID NO71；SEQ ID NO.66、SEQ ID NO69、和SEQID NO.72；

针对KCNQ5分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.73、SEQ ID NO76、和SEQIDNO.79；SEQ ID NO.74、SEQ ID NO77、和SEQ ID NO.80；SEQ ID NO.75、SEQ ID NO78、和SEQ ID NO.81；

针对FAM72C分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.85、和SEQ IDNO.88；SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.86、和SEQ ID NO.89；SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.87、和SEQ ID NO.90；

针对ITGA4分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.94、和SEQ IDNO.97；SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.95、和SEQ ID NO.98；SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.96、和SEQ ID NO.99；针对KCNJ12分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.103、和SEQ ID NO.106；SEQ ID NO.101、SEQ ID NO.104、和SEQ ID NO.107；SEQ ID NO.102、SEQID NO.105、和SEQ ID NO.108；

针对THBD分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.112、和SEQ IDNO.115；SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.113、和SEQ ID NO.116；SEQ ID NO.111、SEQ IDNO.114、和SEQ ID NO.117；

针对ZNF304分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.121、和SEQID NO.124；SEQ ID NO.119、SEQ ID NO.122、和SEQ ID NO.125；SEQ ID NO.120、SEQ IDNO.123、和SEQ ID NO.126；

针对EVC分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.127、SEQ ID NO.130、和SEQ IDNO.133；SEQ ID NO.128、SEQ ID NO.131、和SEQ ID NO.134；SEQ ID NO.129、SEQ IDNO.132、和SEQ ID NO.135，

针对S1PR1分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.136、SEQ ID NO.139、和SEQID NO.142；SEQ ID NO.137、SEQ ID NO.140、和SEQ ID NO.143；SEQ ID NO.138、SEQ IDNO.141、和SEQ ID NO.144；

针对ZFHX4-AS1分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.145、SEQ ID NO.148、和SEQ ID NO.151；SEQ ID NO.146、SEQ ID NO.149、和SEQ ID NO.152；SEQ ID NO.147、SEQID NO.149、和SEQ ID NO.153；

针对EMID1分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.154、SEQ ID NO.157、和SEQID NO.160；SEQ ID NO.155、SEQ ID NO.158、和SEQ ID NO.161；SEQ ID NO.156、SEQ IDNO.159、和SEQ ID NO.162；

针对FAM19A4分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.163、SEQ ID NO.166、和SEQID NO.169；SEQ ID NO.164、SEQ ID NO.167、和SEQ ID NO.170；SEQ ID NO.165、SEQ IDNO.168、和SEQ ID NO.171；

针对NEUROD分子标记物的以下至少一组：SEQ ID NO.172、SEQ ID NO.175、和SEQID NO.178；SEQ ID NO.173、SEQ ID NO.176、和SEQ ID NO.179；SEQ ID NO.174、SEQ IDNO.177、和SEQ ID NO.180。

在其中一些实施例，还包括有对照基因的引物和探针SEQ ID NO.181-SEQ IDNO.183。

本发明的另一个目的是提供一种所述分子标记物的检测方法。

所述分子标记物的检测方法，包括以下步骤：

1)从待检测的血液中提取cfDNA样品；

2)对所述cfDNA样品进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的cfDNA样本；

3)用扩增引物对所述转化后cfDNA样本进行多重PCR反应，得到PCR扩增产物；

4)取PCR扩增产物，并进行稀释，然后用引物和探针进行荧光PCR反应。

在其中一些实施例中，所述多重PCR反应条件如下：预变性，98℃30s,15-35个循环：变性，98℃，15s,退火，58-66℃，15-30s，延伸72℃，15-30s。

在其中一些实施例中，所述荧光PCR反应体系是：预变性，95℃30s，35-50个循环：变性，95℃15s，退火，60℃-64℃，20s。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明找到了与血液中结直肠癌相关的分子标记物，这些分子标记物的甲基化与结直肠癌高度相关，特别是联合使用，可高特异地用于检测结直肠癌。

2)针对血浆cfDNA量少同时要满足多marker检测的要求，开发了一个多重PCR再qPCR定量检测的方法，对于微量的cfDNA，这套体系的检测灵敏性以及特异性都满足于临床上的需求，特别是对于这多个marker的检测方案来讲，在1期的结直肠癌的诊断取得90％的特异性，同时有83％的灵敏度，此表现远好于现有市场上的产品只检测血浆一个marker的表现。

3)针对目前在血浆cfDNA检测方法中常见的二代测序平台，这个基于PCR的方法不管在时效性以及性价比上都远优于二代测序方法。

附图说明

图1是实施例2中10个分子标记物的ROC曲线图。

图2是实施例3中4个分子标记物的ROC曲线图。

图3是实施例4中ITGA4和FBN1检测灵敏度的结果示意图。

图4是实施例4中ITGA4的检测扩增曲线。

图5是实施例4中FBN1的检测扩增曲线。

图6是实施例5中20种分子标记物ROC集合曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明的一个方面，涉及了诊断血液中结直肠癌的新的分子标志物(markers)，包括ST8SIA4、ZNF132、TAF3、TWIST1、VAV3-AS1、FBN1、C9orf50、SFMBT2、KCNQ5、FAM72C、ITGA4、KCNJ12、THBD、ZNF304、EVC、S1PR1、ZFHX4-AS1、EMID1、FAM19A4、NEUROD1中的任意一种或者两种以上的组合。在其中一些实施例中，这些分子标记物可以任何组合，以实现诊断血液中结直肠癌的新的分子标志物。

本发明的一个方面，涉及了将上述分子标记物用于在制备检测结直肠癌的试剂盒。

本发明的一个方面，涉及了一种可用于检测结直肠癌的试剂盒，包括用于对ST8SIA4、ZNF132、TAF3、TWIST1、VAV3-AS1、FBN1、C9orf50、SFMBT2、KCNQ5、FAM72C、ITGA4、KCNJ12、THBD、ZNF304、EVC、S1PR1、ZFHX4-AS1、EMID1、FAM19A4、NEUROD1中的任意一种或两种以上分子标记物的组合进行检测的试剂。例如，可以适用PCR扩增，荧光PCR诊断，数字PCR(digital PCR),或者检测芯片等检测平台，最好是能是实现高通通量检测的平台。

本发明针对这些markers的特定甲基化区域进行引物与探针设计，利用这些引物对对少量的cfDNA经亚硫酸氢盐处理后进行多重扩增，充分放大这些markers的信号，再利用qPCR对这些markers的信号进行高特异性的检测，主要的优点在于，对于含量很少的cfDNA样本，且早期肿瘤的信号很弱这种情况来说，唯一的可以增强对早期肿瘤的检出就是联合检测多个与肿瘤相关的markers，如果直接采用qPCR方法进行检测，这每个样品每次能够检测到的markers比较有限，另外就是检测到的信号落在一个比较不可靠的信号区间中，而我们采用的这个方法，则通过多重PCR先同时放大多个markers的信号，实现了多个markers的同时检测，也在后续的qPCR检测中，得到一个特异性高且信号区间合理的结果。这对于利用cfDNA进行结直肠癌的无创检测非常关键。

实施例1

一种检测血液中结直肠癌的分子标记物的方法，包括以下步骤：

1.全血处理

1.1利用EDTAK2抗凝真空采血管(BD，Cat#367525)采集10mL全血，充分混匀，

避免出现溶血，并在4-6小时内对全血进行血浆分离处理。

1.2全血于低速离心机进行4℃，1600g，15min离心处理，小心吸取上层血浆，避免吸取中间的白膜层，所得血浆再次于高速离心机进行4℃，16000g，10min离心处理，获得所需样品血浆。

2.对血浆进行cfDNA的提取

具体方法：血浆DNA提取具体操作步骤按照Thermo Fisher公司的MagMAX

3.对提取的cfDNA进行亚硫酸盐转化

将提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo DNA Methylation-Direct MagPrep的protocol进行，其中，投入的cfDNA范围在5-20ng，本实施例优选在10ng。亚硫酸氢盐转化的产物全部用于进行多重甲基化扩增。

4.对转化后的cfDNA进行特定多Markers的多重甲基化扩增

转化后的产物全部进行多重甲基化扩增，其中的反应组分为20种Marker的引物组合，其中浓度在300nM，镁离子的浓度在2-5mM，本实施例优选在4mM，dNTP mix浓度在200-600uM，本实施例优选在500uM，采用的酶为Phusion U(Thermo Fisher,Cat#F555L)，一个反应的单位数为1-3U,本实施例优选为1.5U。具体的反应条件为：预变性，98℃30s,15-35个循环(变性，98℃15s,退火，58-66℃，本实施例优选60℃，15s，延伸72℃，15-30s，本实施例优选15s。)，优选28个循环。

多重反应体系配制如下：

5.对多重甲基化扩增产物进行特定甲基化探针的荧光测定

对多重产物进行1-1000稀释，优选10倍稀释，荧光PCR反应组分为引物浓度在200

nM，探针浓度在100nM，dNTP mix浓度在150-200uM，优选在150uM，ROX浓度为1X，采用的酶为Epimark(NEB,Cat#M0490L)，一个反应的单位数为0.5U/20ul PCR。具体的反应条件为：预变性，95℃30s，35-50个循环(变性，95℃15s，退火，60-64℃，优选60℃，20s，信号收集),优选为40个循环。

荧光PCR反应体系配制如下：

6.根据荧光测定的结果，当检测的内参基因ACTB的Ct落在10-20的范围内，则该样本判断为有效样品，即有足够量的cfDNA进行检测。

7.在样品判断为有效样品的情况下，对每个markers进行一个初步的判断，即Ct＜35判断为marker阳性，＞35则判断为marker阴性。

8.多个特定分子标记物和其对应的引物和探针构成的试剂盒，具体如下：

一种检测结直肠癌的试剂盒，该试剂盒的设计针对20种诊断结直肠癌的cfDNA标志物ST8SIA4、ZNF132、TAF3、TWIST1、VAV3-AS1、FBN1、C9orf50、SFMBT2、KCNQ5、FAM72C、ITGA4、KCNJ12、THBD、ZNF304、EVC、S1PR1、ZFHX4-AS1、EMID1、FAM19A4、NEUROD1各设计了三对引物和三条探针，分别标记为引物和探针组1，2，3。具体见以下表格中。其中，一个位点的选择引物和探针1，2，3组，可任意选择与其他为位点的引物和探针组合1，2，3进行进一步组合在同一平台检测。

本实施例和以下实施例中，所使用的引物和探针的组合为：ST8SIA4的组合1，ZNF132的组合2，TAF3的组合3，Twist1的组合2，VAV3-AS1的组合2，FBN1的组合2，C9orf50的组合2，SFMBT2的组合2，KCNQ5的组合3，FAM72C的组合2，ITGA4的组合1，KCNJ12的组合2，THBD的组合3，ZNF304的组合1，EVC的组合3，S1PR1的组合2，ZFHX4-AS1的组合1，EMID1的组合1，FAM19A4的组合2，FAM19A4的组合1。

内标基因引物和探针的设计及制备，针对ACTB基因设计引物和探针，具体如SEQID 181至SEQ ID 183。将该内标基因引物和探针分别配制成10μM的母液储存，根据检测需求制备成1.15μM的工作液备用。

实施例2

利用实施例1的实验方法对46例肠镜无结直肠癌的正常人以及175例结直肠癌病人的血浆样本进行检测，具体的检测试剂盒和实验方法以及数据判断处理与实施例1一致，引物和探针的组合也为实施例1所优选使用的。选取其中的10markers(TWIST1，VAV3-AS1，FBN1，C9orf50，SFMBT2，KCNQ5，FAM72C，ITGA4，KCNJ12，ZNF132)利用逻辑回归模型进行建模分析，按照6：4的切分，进行100次重复，在90％的特异性下，测试集的1期的检测灵敏度为78±12％，2期的检测灵敏度为77±10％，3期的检测灵敏度为82±11％，4期的检测灵敏度为88±5％，对于所有的结直肠癌样本，检测的整体灵敏度为85±5％。整体的AUC为0.91±0.03。表明了这些markers与结直肠癌的高度相关，并且通过该方案方法，可以非常灵敏地检测出结直肠癌，包括早期的结直肠癌。结果参见图1。

实施例3

利用实施例1的检测试剂盒和实验方法对46例肠镜无结直肠癌的正常人以及175例结直肠癌病人的血浆样本进行检测，具体的实验以及数据判断处理与实施例1一致，引物和探针的组合也为实施例1所优选使用的。选取其中的4markers(TWIST1，C9orf50，KCNJ12，ZNF132)利用逻辑回归模型进行建模分析，按照6：4的切分，进行100次重复，在90％的特异性下，测试集的1期的检测灵敏度为78±12％，2期的检测灵敏度为76±10％，3期的检测灵敏度为81±11％，4期的检测灵敏度为88±5％，对于所有的结直肠癌样本，检测的整体灵敏度为82±5％。整体的AUC为0.91±0.03。表明了这些markers与结直肠癌的高度相关，并且通过该方案方法，可以非常灵敏地检测出结直肠癌，包括早期的结直肠癌。结果请参见图2。

实施例4分子标记物的灵敏性以及特异性检测

利用

1.对不同甲基化比例的标准品DNA进行亚硫酸氢盐转化

将不同甲基化比例的标准品DNA进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo DNA Methylation-Direct MagPrep的protocol进行，其中，投入的cfDNA为10ng。亚硫酸氢盐转化的DNA产物全部用于进行多重甲基化扩增。

2.对转化后的标准品DNA进行多Markers的多重甲基化扩增

转化后的DNA产物全部进行多重甲基化扩增，其中的反应组分为各特定Marker的引物组合(20种分子标记物的实施例1优选的引物组合+内参基因的引物组合，以下实施例相同)，其中浓度在300nM，镁离子的浓度在2-5mM，本实施例优选在4mM，dNTP mix浓度在200-600uM，本实施例优选在500uM，采用的酶为Phusion U,一个反应的单位数为1-3U，本实施例优选为1.5U。具体的反应条件为：预变性，98℃30s,15-35个循环(变性，98℃15s,退火，58-66℃，本实施例优选60℃，15s，延伸72℃，15-30s,本实施例优选15s。)，优选28个循环。多重反应体系配制如下：

3.对多重甲基化扩增产物进行特定甲基化探针的荧光测定

对多重产物进行1-1000稀释，优选10倍稀释，荧光PCR反应组分为引物

4.浓度在200nM，探针浓度在100nM，dNTP mix浓度在150-200uM，优选在150uM，ROX浓度为1X，采用的酶为Epimark(NEB,Cat#M0490L)，一个反应的单位数为0.5U/20ul PCR。具体的反应条件为：预变性，95℃30s，35-50个循环(变性，95℃15s，退火，60-64℃，优选60℃，20s，信号收集。),优选为40个循环。

在本实施例中，检测ITGA4,FBN1,VAV3-AS1的检出灵敏性，全部引物和如实施例1所述，其中ITGA4的引物组合为SEQ NO.91,SEQ NO.94探针选择SEQ NO.97,FBN1的引物组合为SEQ NO.47,SEQ NO.50,探针选择SEQ NO.53,VAV3-AS1的引物组合为SEQ NO.38,SEQNO.41,探针选择SEQ NO.44。

荧光PCR反应体系配制如下：

5.根据荧光测定的结果，当检测的内参基因ACTB的Ct落在10-20的范围

内，则该样本判断为有效样品，即有足够量的cfDNA进行检测。

6.在样品判断为有效样品的情况下，对每个markers进行一个初步的判断，即Ct＜35判断为marker阳性，＞35则判断为marker阴性。

在4次重复检测中，根据结果得到3个marker在不同甲基化比例样品下的检出率，初步得到多重PCR加单独qPCR这个方案对于这些分子标记物的检测灵敏度，结果参见图3。可以看到，利用多重PCR，再进行单独的qPCR检测每一个分子标记物这种方案可以对一个样品的多个分子标记物进行同步检测,同时各个分子标记物的单独检测灵敏度还是非常高的，ITAG4在低至0.2％甲基化比例的样品中的检出率都还是高达100％，而FBN1则在0.5％的甲基化比例的样品中的检出率高达100％，在0.2％的甲基化比例样品中，也有75％的检出率，也就是在4次重复检测中，有3次是可以得到阳性信号的。而对于出现阴性结果的样本中，例如该实施例的FBN1检测信号为阴性的0.2％甲基化比例样本中，该样本的ITGA4的检出率为阳性，这种互补的优势对于联合使用多个分子标记物来进行检测到非常弱信号的样本，如血浆样本具有非常大的优势。

7.对0％甲基化比例样本的检测扩增曲线如图4和图5：

可以看到，利用非甲基化标准品DNA对ITGA4以及FBN1的引物和探针以及检测方法进行特异性检测，该实施例所涉及的引物和探针涉及以及该检测方案都有非常好的特异性。

实施例5分子标记物与结直肠癌的关系

1.对结直肠癌石蜡组织DNA的提取

具体方法：石蜡组织DNA提取具体操作步骤按照Qiagen公司的ALLPrep DNA/RNAFFPE Kit说明书进行。

2.对提取的20ng DNA进行亚硫酸盐转化

如实施例4所述。

3.对转化后的DNA进行特定多Markers的多重甲基化扩增

如实施例4所述。

4.对多重甲基化扩增产物进行特定甲基化探针的荧光测定

如实施例4所述。

5.根据荧光测定的结果，当检测的内参基因ACTB的Ct落在10-20的范

围内，则该样本判断为有效样品，即有足够量的DNA进行检测。

6.在样品判断为有效样品的情况下，对每个markers进行一个初步的判断，即Ct＜35判断为marker阳性，＞35则判断为marker阴性。

7.在37例肠镜无异常的组织样本中，以及58肠镜结果为结直肠癌前病变或癌变的组织样本中，对20种分子标记物进行检测，结果请见图6。其中，分别对ITGA4、FBN1、C9orf50、FAM72c、KCNQ5、SFMBT2b、TWIST1、VAV3-AS1、ZNF132、THBD、EVC多个分子标记物进行了单分子标记物的检测。结果如下：

其中ITGA4单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.942。其中特异性为90％时，灵敏性可达89.7％，特异性为95％时，灵敏性也有70.7％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中FBN1单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.922。其中特异性为90％时，灵敏性可达79.3％，特异性为95％时，灵敏性也有70.7％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中C9orf50单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.887。其中特异性为90％时，灵敏性可达72.4％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中FAM72C单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.895。其中特异性为90％时，灵敏性可达81％，特异性为95％时，灵敏性也有74.1％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中KCNQ5单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.932。其中特异性为90％时，灵敏性可达81％，特异性为95％时，灵敏性也有65.5％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中SFMBT2单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.944。其中特异性为90％时，灵敏性可达88％，特异性为95％时，灵敏性也有79.3％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中TWIST1单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.853。其中特异性为90％时，灵敏性可达70.7％，特异性为95％时，灵敏性也有67.2％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中VAV3-AS1单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.944。其中特异性为90％时，灵敏性可达83.6％，特异性为95％时，灵敏性也有64.7％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中ZNF132单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.916。其中特异性为90％时，灵敏性可达82.8％，特异性为95％时，灵敏性也有75.9％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中THBD单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.913。其中特异性为90％时，灵敏性可达81％，特异性为95％时，灵敏性也有74.1％。

表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

其中EVC单独作为一个分子标记物进行结直肠癌诊断，AUC高达0.863。其中特异性为90％时，灵敏性可达67.2％，特异性为95％时，灵敏性也有60.3％。表明该分子标记物甲基化水平与结直肠癌的癌变高度相关。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市基准医疗有限责任公司

<120> 血液中结直肠癌的分子标记物及其检测试剂盒和方法

<160> 183

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA