一种检测MGMT基因启动子甲基化状态的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测MGMT基因启动子甲基化状态的方法。

背景技术

MGMT基因在脑胶质瘤组织中表达与肿瘤细胞对亚硝脲类药物的耐药密切相关，并影响肿瘤的化疗效果和病人的预后。在许多肿瘤中发现MGMT启动子区过甲基化而导致MGMT基因的转录失活，表达量下降，在脑胶质瘤的研究发现，MGMT甲基化导致的基因沉默与替莫唑胺疗效相关，MGMT基因启动甲基化程度越高，使用替莫唑胺药物疗效越好。

目前市面上检测甲基化的技术主要有荧光PCR、数字PCR、焦磷酸测序、基因芯片及二代测序等技术。其中焦磷酸测序方法是目前公认的金标准，但该检测方法检测的通量低(1-5CpG位点)，用的是化学染料来实现检测，故其灵敏度和特异性相对较差；市面上应用最广泛的荧光PCR方法除了上述缺点外，其检测结果只能定性不能是实现定量；数字PCR检测方法在荧光PCR的技术上实现了单分子PCR方法来进行核酸定量，虽然可以绝对定量，但依旧依赖于化学染料，故其检测通量低、特异性差。基因芯片和二代测序技术虽然通量、灵敏度及特异性高，但其检测成本高、且操作复杂，结果分析需要专业的生物信息学人员进行分析。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测MGMT基因启动子甲基化状态的方法，该方法操作简单，且高通量自动化、特异性高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测MGMT基因启动子甲基化状态的方法，包括以下步骤：

S1、提取样本中的DNA；

S2、将DNA通过重亚硫酸盐处理，并纯化回收；

S3、以重亚硫酸盐处理的DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应的体系为：

模板：2-2.1μl；

HPLC-grade water：2.82-2.84μl；

10×PCR buffer with 20mM MgCl

25mM dNTP：0.08-0.09μl；

5U/uL的HotStarTaq Polymerase Enzyme：0.07-0.08μl；

1uM的上、下游引物各2μl；

总体积为8.00μl；

S4、将PCR扩增产物进行虾碱性磷酸酶反应；

S5、将碱性磷酸酶反应产物进行转录酶切反应，并树脂纯化；

S6、将树脂纯化产物进行核酸飞行时间质谱的分析，根据是否出现甲基化峰，判断是否出现甲基化，通过计算甲基化峰值与未甲基化峰值的比值，计算甲基化水平。

进一步的，所述样本为胶质瘤石蜡组织切片，且肿瘤细胞含量>70％。

更进一步的，S3中，上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。

更进一步的，PCR反应的程序为：95℃，15min；95℃，20s，62℃，30s， 72℃，1min，10个循环；95℃，20s，61.8*℃，30s，72℃，1min，40个循环； 72℃，5min；15℃保持；*标识的该步骤每经历一个循环将降低0.2℃。

更进一步的，S6中，将S5的纯化产物放置在MassARRAYTMRS 1000自动点样仪中，放入SpectroCHIP芯片，进行自动化点样，将纯化产物点样到芯片上，将点样芯片放入核酸飞行时间质谱仪检测，并生成结果。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明的检测MGMT基因启动子甲基化状态的方法具备了操作简单，检测周期短，通量高，特异性高以及低污染风险等优势，检测结果将有助于监测经替莫唑胺药物治疗脑胶质瘤的疗效。

附图说明

图1为实施例1EpiTyper软件分析的甲基化位点图。

图2为对比例1的质谱检测峰图。

图3为实施例1的质谱检测峰图。

图4对比例2的琼脂糖凝胶电泳图以及核酸质谱检测峰图。

图5为实施例1的琼脂糖凝胶电泳图以及核酸质谱检测峰图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

检测MGMT基因启动子甲基化状态

1、DNA提取

使用胶质瘤石蜡组织切片，且肿瘤细胞含量>70％，使用全自动提取仪进行提取纯化，并测量提取的核酸浓度及纯度。

2、重亚硫酸盐转化

2.1取1微克样本DNA(如果体积低于20微升则加无酶纯水补充；高于 20微升，则只取20微升)，装入1.5ml洁净的EP管中，再加入130微升CT Conversion Reagent试剂(商品化的)，振荡混匀瞬时离心。

将上一步中的混合液体分装至两个0.6ml的PCR管中，每个分装75微升，然后放入PCR仪中进行表1所示程序反应：

表1重亚硫酸盐转化反应程序

2.3在纯化柱中加入600微升M-Binding Buffer(均是商品化)，然后将步骤2.2中的液体(一份样本有2管)分别加入纯化柱中，上下颠倒混匀，然后离心(10000×g离心力，离心30秒)，弃掉滤液。

2.4往纯化柱中加入100微升M-Wash Buffer，然后以最大离心力离心30 秒，弃掉滤液。

2.5纯化柱中加入200微升Tris-based Wash buffer，室温放置17分钟，然后最大离心转速离心30秒，弃掉滤液。

2.6往纯化柱中加入200微升M-Wash Buffer，最大转速离心30秒，弃滤液。

2.7重复步骤2.6。

2.8将纯化柱放置到1.5ml洁净的EP管中，加入15微升无酶去离子水，室温放置2分钟，最大转速离心30秒。

优化点2：上步中按照原来的操作是加入20微升M-Elution Buffer，但该试剂虽然能增强洗脱能力，但其中的离子成分会影响后续的PCR反应，换成无酶去离子水则可增强后续的PCR反应。

3、PCR反应

3.1MGMT基因启动子甲基化位点的选取及PCR引物的设计

根据NCBI基因数据库提供的数据，找到MGMT基因启动子附近的基因序列，该基因序列中一共含有12个甲基化位点(CpG site)，具体序列位置是： chr10:129467212-129467309；(表示的是10号染色基因序列编号从 1294129467212开始，到129467309结束)；据上述的基因位置，找到相应的基因序列，设计上游引物(Fwd)和下游引物(Rev)：

上游引物：5'-aggaagagagCCTATACGACCCTGTCGGGCGCG-3'(如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物：5'-cagtaatacgactcactatagggagaaggctCCCAGACACTCACCAAGT CGCAAA-3'(如SEQ ID NO.2所示)。

3.2按表2配制PCR缓冲液：

表2PCR缓冲液反应体系

3.3将表2配制的混合试剂按照每个反应孔8微升进行分装，然后取2微升重亚硫酸盐转化后的样本加入反应孔中。

3.4盖好反应孔，振荡混匀，560×g离心1分钟。

3.5将离心好的反应管放入PCR仪中进行如下反应：

95℃，15min；95℃，20s，62℃，30s，72℃，1min，10个循环；95℃，20s， 61.8*℃，30s，72℃，1min，40个循环；72℃，5min；15℃保持；*标识的该步骤每经历一个循环将降低0.2℃。

4、虾碱性磷酸酶(SAP)反应

4.1按表3配制SAP反应液

表3SAP反应液体系

将混合试剂振荡混匀5秒，2500×g离心10秒。

4.2取4微升SAP反应液加入每个反应孔中，盖好盖子，振荡混匀，3000×g 离心1分钟。放入PCR仪，进行如表4所示反应。

表4SAP反应程序

5、转录酶切反应

5.1按照表5配制转录酶切反应液

表5转录酶切反应液体系

将混合试剂振荡混匀5秒，2500×g离心10秒。

5.2将配制好的转录酶切反应混合液，按5微升/孔，分装至新的反应孔中，每个样本取2微升产物(PCR/SAP)加至新的反应孔中(含转录酶切反应混合液)。

5.3盖好反应管，振荡混匀，540x g离心1分钟

5.4将反应管放入PCR仪，进行表6所示反应。

表6转录酶切反应程序

6、树脂纯化

6.1取出反应完的样本，在每个反应孔中加入41微升HPLC-grade water，再加入15毫克纯化树脂，盖好反应孔的盖子，瞬时离心，旋转混匀30分钟。

6.2将反应板放入水平离心机中，4000转/分钟，离心5分钟。

7、SpectroCHIP芯片上样

将离心好的反应管放置在MassARRAY

8、核酸飞行时间质谱检测

将完成好的芯片放入核酸飞行时间质谱仪中，打开仪器自带的EpiTyper软件进行检测程序编辑，将编辑好的检测程序发送至MassARRAY Analyzer软件，从MassARRAYAnalyzer软件中找到该次实验的程序，然后点击运行，等运行结束后检测数据将传入数据库电脑，通过EpiTyper软件中的Analyzer板块即可分析此次检测结果，MGMT启动子甲基化我们选取了12个甲基化位点，甲基化位点具体在DNA序列上的位置如图1所示。

对比例1

重亚硫酸盐转化，步骤中2.5，纯化柱中加入200微升M-Desulphonation Buffer，其余同实施例1。

将实施例1与对比例1进行比较，对比例1加入200微升M-Desulphonation Buffer，但该试剂中含有钠离子，钠离子会粘附到DNA片段上，并使得片段的质量增加22道尔顿(Da)，最终导致质谱的峰发生偏移(图2中箭头所示)。换成Tris-based Wash buffer则可避免该事件发生(图3)。

对比例2

重亚硫酸盐转化，步骤中2.8，将纯化柱放置到1.5ml洁净的EP管中，加入15微升M-Elution Buffer，室温放置2分钟，最大转速离心30秒。

PCR反应，步骤3.2，将“HotStarTaq Polymerase Enzyme,5U/uL”，替换成“PCREnzyme，5U/uL”。

PCR反应，步骤3.2，PCR反应程序替换成下表所示。

表7PCR反应程序

将实施例1与对比例2的检测结果进行对比，图4A为对比例2PCR反应后取扩增产物进行了琼脂糖凝胶电泳，条带较暗表示扩增产物较少了，将此产物进行核酸质谱检测，峰值较低(图4B，约1700)。图5A为实施例1的扩增产物，条带特别明显，表示扩增产物含量高，将此产物进行核酸质谱检测，峰值较之前高了很多(图5B，约8000)。

实施例1相比于对比例2的优化点在于：

优化点1：对比例2加入20微升M-Elution Buffer，但该试剂虽然能增强洗脱能力，但其中的离子成分会影响后续的PCR反应，换成无酶去离子水则可增强后续的PCR反应。

优化点2：对比例2中加粗试剂原来操作是加入”5U/uL PCR Enzyme”，但由于检测样本属于石蜡组织，核酸片段化严重，且检测的MGMT基因甲基化片段 GC含量较高，普通的PCR Enzyme无法扩增该段基因序列。故改进了该步骤，加入了热启动式PCR Enzyme，该酶的特点是需要高温才能将该酶的活性激活，能将GC含量的高的片段从双链解旋成单链，更利于扩增。还有一点就是在配液加样的时候可以不用在低温下进行，因为酶需要高温才能激活，所以常温状态下混合试剂不会发生反应。

优化点3：实施例1在对比例2的基础上，增长了PCR反应第一步的反应时间，使基因片段能充分解旋成单链。然后增加了10个循环的高退火温度(退火温度62℃)的PCR反应，加入此反应的目的是利用高温退火提高反应的特异性，防止非特异性的结合。将目的片段高保真的预扩增出来。后面正式扩增时，我们采用了降落式PCR，退火温度从61.8℃开始，每个循环降低0.2℃，采用此方法可以将扩增效率大大提高，又能保证扩增的特异性。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 深圳市第二人民医院

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<120> 一种检测MGMT基因启动子甲基化状态的方法

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<160> 2

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 1

aggaagagag cctatacgac cctgtcgggc gcg 33 <>

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<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 2

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