一种提升级联催化体系效率的多酶有序共固定化方法

技术领域

本发明涉及酶工程和酶固定化技术领域，具体地涉及一种提升级联催化体 系效率的多酶有序共固定化方法。另外，本发明还涉及使用有序共固定的蔗糖 合成酶与糖基转移酶，应用于高效制备皂苷类药学活性化合物。

背景技术

生物催化剂酶在生产实践中有着广泛的应用。酶的固定化通过物理或化学 的方法将游离酶结合于固相基质载体，有助生物催化剂与反应溶液分离，实现 酶的循环利用，降低生成成本。由于复杂催化体系多涉及多种酶参与的连续反 应，构成了多酶级联催化。发展多酶体系的共固定化，不仅可将不同酶的催化 特性有机结合，促进酶催化效能，而且有助酶分子稳定性改善，利于保存运输。 但多数情况下，常规的多酶共固定方法(包括交联，截留和直接附着功能基质 表面)常会导致各种酶分子的随机分布，形成的级联酶间的随机共固定化。由 于在级联多酶随机共固定化中，酶分子间存在空间位阻或过于分散，从而会显 著降低级联多酶催化反应的协同性。许多功能紧密相关的多酶，在自然界中已 进化成在细胞器和细胞膜上区隔共定位，或构成多酶复合物。这种多酶间特殊 的空间邻近排布，一定条件下会产生出底物通道效应，避免反应中间体的溶液 扩散，促进中间体在酶分子间传递，来保持代谢物的局部高浓度，利于生物体 内发生高效的多步代谢反应。受自然界级联多酶空间共定位底物通道现象的启 发，设计构建级联多酶的有序共固定化体系，通过相关酶催化位点的邻近阵列 排布，有望促进人工级联体系中多步连续反应的效率。已报道的多种酶有序共 固定化的方法主要利用支架介导的共定位，例如，使用DNA折纸，RNA或肽作 为支架来共固定多酶。然而很多有应用价值的酶(例如脱氢酶，过氧化氢酶和 许多糖基转移酶)多是由多亚基构成的寡聚酶。利于支架分子有序共固定化多 聚酶的化学计量是复杂的，使得基于分子支架构建有序共固定多亚基酶技术复 杂化，常需对酶-支架连接设计进行广泛地优化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可显著提升多酶级联反应催化效率的多酶共固 定阵列催化材料。

本发明的第一方面，提供了一种多酶共固定阵列催化材料，所述催化材料包 含如下部分：

1)多酶纳米自组装体，包含两类以上级联催化体系的元件酶和配对酶以及融 合于所述元件酶和/或所述配对酶上的组氨酸标签，其中，

所述元件酶为寡聚酶分子，且所述寡聚酶分子的亚基上融合有自反应肽段或 者自反应化学对，并且任选地融合了组氨酸标签；

所述配对酶为功能酶分子，且所述功能酶分子的亚基上融合有自反应肽段或 者自反应化学对，并且任选地融合了组氨酸标签；

所述元件酶和所述配对酶通过各自融合的自反应肽段或者自反应化学对间的 自发链接反应获得所述多酶纳米自组装体；和

2)Ni

所述多酶纳米自组装体通过所述组氨酸标签与所述Ni

在另一优选例中，所述多酶纳米自组装体包含2-5类级联催化体系的元件酶和 配对酶，较佳地2-3类，更佳地2类(如1类元件酶和1类配对酶)。

在另一优选例中，所述组氨酸标签是多价的，如2价。

在另一优选例中，所述自反应肽段选自下组：SpyTag、SpyCatcher、或其组合。

在另一优选例中，所述自反应化学对选自下组： SnoopTag/SnoopCatcher、favidin/biotin、二硫键、或其组合。

在另一优选例中，所述SpyTag或SpyCatcher通过柔性多肽链[(AG)

在另一优选例中，所述元件酶选自下组：蔗糖合成酶SUS、葡糖脱氢酶、或其 组合；和/或

所述配对酶选自下组：糖基转移酶UGTm、细胞色素氧化酶P450m、或其组合。

在另一优选例中，所述元件酶(或第一酶)为蔗糖合成酶SUS。

在另一优选例中，所述蔗糖合成酶SUS的亚基上融合有SpyTag。

在另一优选例中，所述配对酶(或第二酶)为糖基转移酶UGTm。

在另一优选例中，所述糖基转移酶UGTm的亚基上融合有SpyCatcher。

在另一优选例中，所述元件酶与所述SpyTag肽段的摩尔比为1：4。

在另一优选例中，所述配对酶与所述SpyCatcher肽段的摩尔比为1：2。

在另一优选例中，所述多酶纳米自组装体中，所述第一酶和所述第二酶的摩 尔比为1：2。

在另一优选例中，所述多酶纳米自组装体中，所述元件酶的亚基或单体与所 述组氨酸标签的摩尔比为1：3-15(较佳地1：4-12，更佳地1：5-10)；和/或

所述配对酶的亚基或单体与所述组氨酸标签的摩尔比为1：3-15(较佳地1：4-12，更佳地1：5-10)。

在另一优选例中，所述催化材料中，10-100％摩尔的所述元件酶融合有所述组 氨酸标签(较佳地30-100％，更佳地50-100％，最佳地80-100％)；和/或

10-100％摩尔的所述配对酶融合有所述组氨酸标签(较佳地30-100％，更佳地50-100％，最佳地80-100％)。

在另一优选例中，所述固相基底为形状功能型材且选自下组：树脂微球、琼 脂糖微球、磁珠微球、或其组合。

在另一优选例中，所述固相基底选自下组：聚苯乙烯微球、琼脂糖微球、或 其组合。

在另一优选例中，所述微球的粒径为50-250um，较佳地50-200um，更佳地 50-150um。

在另一优选例中，所述多酶纳米自组装体与Ni

本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述的催化材料的制备方法， 包括步骤：

1)提供第一反应液、第二反应液和第三反应液，所述第一反应液包含元件酶， 所述第二反应液包含配对酶，所述第三反应液包含Ni

所述元件酶为四聚体分子，且所述元件酶融合有SpyTag和任选的组氨酸标签；

所述配对酶为二聚体分子，且所述配对酶融合有SpyCatcher和任选的组氨酸标签；

2)混合所述第一反应液和所述第二反应液，得到第四反应液，自组装反应得 到多酶纳米自组装体；

3)混合步骤2)所得产物和所述第三反应液，得到第五反应液，反应得到所 述多酶共固定阵列催化材料。

在另一优选例中，所述第四反应液的pH为4.5-8.5。

在另一优选例中，所述第四反应液的pH为4.5-7.5，较佳地4.5-7.2。

本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的多酶共固定阵列催化 材料的用途，用于选自下组的用途：

1)用于催化皂苷类化合物的合成；

2)用于自循环产生UDP-葡萄糖(UDPG)作为糖供体。

本发明的第四方面，提供了一种皂苷类化合物的合成方法，包括步骤：

1)以本发明第一方面所述的多酶共固定阵列催化材料为酶，将蔗糖和UDP反 应，得到UDPG；

2)直接以步骤1)所得产物为原料，将其与原人参二醇PPD反应，得到尿苷二 磷酸(UDP)和皂苷Rh2。

在另一优选例中，所述方法的反应效率为50-100％(较佳地50-95％，更佳地 50-90％)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：设计有序共固定化二聚体的糖基转移酶UGTm和四聚体蔗糖合成酶 SUS形成级联酶催化阵列；A)首先将SpyCatcher/SpyTag融合到UGTm和SUS 的亚基末端，借助SpyCatcherUGTm和SpyTagSUS之间自发形成稳定共价异肽键 及多亚基酶的寡聚形成多酶纳米自组装体。进而利用多酶纳米自组装体中组成 酶上带有的众多多组氨酸标签进一步固定于Ni2+：NTA表面功能化的微球上， 创建一种有序的多酶阵列式排布的共固定化生物催化材料。B)糖基转移酶 UGTm和蔗糖合成酶SUS构成的人工级联催化体系；在构建的UGTm-SUS的这 种有序共固定多酶阵列中，可促进人参皂苷原人参二醇PPD转化为稀有的人参 皂苷Rh2以及昂贵的糖供体UDPG再生。

图2：用于构建的多亚基酶的四级结构。(A)来自酿酒酵母的UGT51(PDB： 5GL5)的结构。(B)来自拟南芥的蔗糖合酶SUS的结构(PDB：3S28)。N 和C末端分别标记为红色和蓝色圈。。

图3：表达SpyTag/SpyCatcher融合酶的构建体以及SpyCatcher和SpyTag之 间的自发共价结合反应。(A)pET28a-SpyCatcherUGT质粒。SpyC：SpyCatcher 域；LL：(GGGGS)2联结元件。(B)pET28a-SpyTagSUS质粒。SpyT： SpyTag域；LL：[(AG)3PEG]5联结元件。(C)SpyCatcher/SpyTag化学配对 的结构和分子机理。。

图4：融合或未融合酶的凝胶过滤色谱分析(A)SpyCatcherUGTm和未融 合UGTm的洗脱谱。(B)SpyTagSUS和未融合的SUS对应物的洗脱谱。。

图5：比较SpyCatcherUGTm，SpyTagSUS和非融合酶的相对酶活性。所有 测量至少进行了3次，误差线代表标准误差。。

图6：(A)SpyCatcher/SpyTag介导的UGTm-SUS自组装的SDS-PAGE分 析。将纯化的酶和组装的UGTm-SUS多酶纳米蔟进行10％SDS-PAGE操作， 并用考马斯亮蓝染色。泳道M，蛋白分子量；泳道1，纯化的重组SpyTagSUS 蛋白；泳道2，纯化的重组spyCatcherUGTm蛋白；泳道3，组装的 SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS蛋白。(B)通过光密度测定法确定组装的SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS蛋白的纯度，纯度为91％。

图7：不同pH下SpyCatcher/SpyTag的介导不可逆共价结合。泳道M：蛋白 质标志物(kDa)，泳道1：SpyTagSUS，泳道2：SpyCatcherUGTm，泳道3： 在pH 7.0Tris-HCl缓冲液中的自组装，泳道4：在pH 7.5Tris-HCl缓冲液中的自 组装，泳道5：在pH 8.0Tris-HCl缓冲液中的自组装，泳道6：在pH 8.5Tris-HCl 缓冲液中的自组装。

图8：(A)用于体内蛋白共表达和自组装的 pACYDuet-6xHis-SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS的构建体(B)对用Ni+-NTA亲 和色谱法得到的大肠杆菌粗裂解液中自组装的6xHis-SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS进行10％SDS-PAGE分析。泳道M：蛋白 质标志物(kDa)，泳道1：细胞裂解物，泳道2：上清液，泳道3：洗涤的样品， 泳道4：洗脱的样品。。

图9：功能化微球上固定化的UGTm-SUS组件的表征。A)Broadford法分 析固定化材料；彻底清洗酶溶液中孵育的微球后，使用Bradford溶液检查支持 物上附着的蛋白质；空白对照：Broadford溶液；非固定化材料：新鲜制备的 微球在Broadford溶液中；固定化材料：酶固定处理后的微球在Broadford溶液。 (B)酶固定化或非固定化处理的功能化微球的光学显微镜图像。凸凹表面形 态的示例由蓝色箭头指示。未固定化处理的功能化微球显示出光滑的表面(插 图)。

图10：固定化UGTm-SUS自组装体的功能化微球的光学显微镜图像。凹 凸表面形态的示例由蓝色箭头指示。。

图11：UGTm-SUS阵列有序共固定的代表性电子显微镜图像。A)固定化 的UGTm-SUS自组装体在支持物表面的扫描电镜图像。固定后，将样品冻干 并在分析之前用纳米金溅射涂层。在扫描电镜下观察到固定化材料中出现颗粒 状结构。B)固定化的UGTm-SUS自组装体的透射电镜图像。在透射电镜下 可以看到表面上有序排列的微小颗粒。C)固定化的UGTm-SUS自组装体的原 子力电镜图像。固定的多酶复合物的微观结构的高度约为20nm。

图12：多酶固定化速率，UDPG再生效率，以及有序共固定的UGTm-SUS 阵列存储稳定性和重复实用性分析。A)在20℃和pH 7.0下，UGTm-SUS自 组装体和多酶混合物在载体上的固定效率分析；从用于固定化的总蛋白质与固 定后溶液中残留量之间的差异确定固定化蛋白质的量。B)转换效率分析。转 化率显示为PPD转化为最终产物Rh2的百分比。C)有序共同固定，随机共同 固定系统和自由多酶纳米自组装体在不同UDP浓度下的初始转化速率。D)在 4℃下的储存稳定性。所有测量均在40μM蛋白质浓度下进行；E)在多个 回收周期后，有序共固定化的UGTm-SUS阵列可重复使用性；数据代表三个测 量值的平均值±标准偏差。

图13：通过有序固定的UGTm-SUS级联的协同催化，由PPD形成的最终产 物Rh2的HPLC分析。

图14：未装载前微球的SEM图片。

图15：随机固定化多酶后所得催化材料的扫描电镜照片。

图16：多酶有序固定化所得微球的扫描电镜照片。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，设计制备了一种定向有序固定多酶阵列 于固体基底的催化材料，使用所述多酶有序共固定催化材料进行催化反应时， 所述催化材料的第一酶在催化第一反应产物，在级联反应中是后续酶的底物，由于 体系内多酶分子被组装为阵列排布，避免的底物随机扩散，缩短了底物在多酶间的 传送距离，从而可快速启动后续酶的催化反应，前一反应产物的转化，可解除酶催 化中常见的产物抑制效应，使得反应平衡向最终产物方向移动，从而提高多酶协同 催化效率。本发明所述多酶共固定阵列催化材料构建，是利用自组装体带有众多的 His标签，无需引入其他额外修饰，即可直接结合于Ni:NTA功能化的基底材料表面。 由于固定方法简单，操作步骤少，可快速完成，有利于保持生物催化剂高活性。利 用组装体带有众多的His标签的群体效应，相对其他利用单融合蛋白His标签介导的 固定化，该方法明显固定效率高，稳定性强，不易与基底材料脱离。本发明所述多 酶共固定阵列催化材料中，利用寡聚酶每个亚基上均融合有的His标签进行基底结 合，形成了寡聚酶与基底多点结合，可有效避免寡聚酶应用中常见的亚基解离造成 寡聚酶的失活，从而提升了寡聚酶催化材料的整体稳定性，利于寡聚酶催化材料的 循环重复使用。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“UDP”是指尿苷二磷酸，结构式为

如本文所用，术语“UDPG”是指二磷酸尿苷葡糖，结构式为

如本文所用，术语“PPD”是指原人参二醇，结构式为

如本文所用，术语“Rh2”是指人参皂苷，结构式为

术语“MENCs”是指多聚酶纳米簇，具体是指多酶间通过自组装后形成了 超分子纳米蔟状催化材料。

本发明涉及一种可提升多酶级联催化整体效率的有序共固定级联多酶的 新方法。具体是提供了一种利用寡聚酶自组装及自装体上丰富的多组氨酸亲和 标签介导，实现将多酶有序共固定于固相基底上的新技术。通过这种多酶共固 定化技术获得多酶级联阵列排布，易于级联体系内不同的酶分子间形成底物通 道效应，促进不同酶分子间反应中间体的传递，提升协同催化效率；该共固定 化方法，可有效增强多亚基酶的稳定性，强化生物级联催化系统的整体性能。 包括步骤：将级联体系内多个寡聚酶,如：二聚体糖基转移酶UGT51及四聚体 的蔗糖合成酶分别融合SpyCatcher及SpyTag自反应化学对进行重组表达，利用 这些酶的寡聚化和SpyCather/SpyTag自发共价反应，组装成了多酶纳米蔟模块， 进一步依靠自组装体模块上存在的丰富的多组氨酸标签，将多酶组装体直接固 定于功能化的Ni

多聚体酶首先经历由多聚体寡聚化驱动的分级自组装，其中SpyTag/ SpyCatcher共价配对反应产生高度有序的超分子结构多酶纳米蔟组装体MENCs。 随后，可将多酶纳米蔟组装体模块通过组成酶的多组氨酸标签进一步固定在合 适的Ni

设计将遗传融合的SpyTag/SpyCatcher共价化学反应对与多亚基酶的自发 寡聚化相偶联，可快速获得多酶的模块化自组装。源于CnaB2结构域的 SpyTag/SpyCatcher共价化学反应对，以其在多种条件下均能自发形成稳定异 肽键的优势在蛋白质化学领域获得广泛应用，如生物耦联、疫苗的合成和耐热 酶的制备等。CnaB2被拆分为两个部分:SpyTag(13个氨基酸肽段)和 SpyCatcher(116个氨基酸肽段)；SpyTag中的Asp和SpyCatcher上的Lys能 自发反应生成异肽共价键。

His标签(His-tag)又称多组氨酸标签，由6到10个连续的组氨酸残基组 成。在一般或变性条件His标签可以和Ni

目前，生物催化领域需要一种固定化工艺简单，可有效避免酶分子的随机 分布，将级联催化体系内多亚基酶快速，高效形成位点特异性结合于在固相基 底上的多酶有序共固定化技术，从而在固相载体上构成高密度的级联酶有序催 化功能单元。此外，将多亚基酶有序固定在支持物上可通过减轻亚单位解离相 关的失活，在苛刻的反应条件下改善多聚酶的稳定性。开发方便，高效的多酶 有序共固定化技术在制造先进的纳米生物反应器或其他酶催化传感装置方面 均有着潜在的应用。

本发明提供一种多酶的有序共固定化方法，该方法操作简单，重复性好， 可以大大提高固定化酶的稳定性和重复使用性，从而降低生物制造的生产成本。

在构建有序共固定化多酶阵列时，来自酿酒酵母的二聚体糖基转移酶 UGT51突变体(UGTm，S81A/L82A/V84A/K92A/E96K/S129A/N172D) 和拟南芥的四聚体蔗糖合酶(SUS)被选作人工级联催化体系的模型酶。有序 共固定化糖基转移酶与蔗糖合成酶，增强人工级联催化途径中的多酶协同效应， 在生物催化制备天然糖苷类药物分子和糖衍生化领域有着重要的应用价值。

根据本发明的多酶的有序共固定化方法，包括如下步骤：

(1)酶分子结构分析，基于蔗糖合成酶SUS是由分子量为92kDa的单体组 成的四聚体分子，且其N末端处在折叠外，相对较小的SpyTag(～1.5kDa)和 6xHis肽被设计融合于每个SUS单体的N末端。糖基转移酶UGTm是由45kDa单 体构成的二聚体分子，也有着延申出折叠的N末端，SpyCatcher(～9.5kDa) 肽被设计融合到每个UGTm单体N-端，并在C-端融合了6xHis标签。为了使酶- 底物的相互作用保留足够的旋转柔韧性，在相应的SpyCatcher/SpyTag与融合 酶之间引入了柔性([(AG)

(2)在大肠杆菌中表达并纯化SpyCatcherUGTm和SpyTagSUS融合酶，以及 未融合的相应酶。纯化蛋白的凝胶过滤色谱分析表明，SpyCatcherUGTm和 SpyTagSUS显示出与未融合的相应酶相似的保留曲线，表明融合标签的引入未 对酶蛋白的表达和折叠产生可见的影响。此外，对UDPG转化率的分析表明， 融合的SpyCatcherUGTm和SpyTagSUS表现出与非融合对应物相似的酶活性，这 表明SpyTag或SpyCatcher融合并未明显影响到这些酶的结构和功能完整性。

(3)混合这些SpyCatcher/SpyTag融合酶导致形成共价交联的酶自组装体。 SDS-PAGE显示对应于150kDa以上分子量的蛋白带，这与理论上计算出的共价 偶联的SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS亚基分子量在166kDa的基本一致，表明不 同酶分子间之间已形成异肽共价键，实现自组装。

(4)这种SpyCatcher/SpyTag自组装交联反应对pH敏感。通过调节pH值， 当在50mMTris-HCL缓冲液pH 7.0，融合酶以1：1亚基摩尔比，室温孵育1小时 后，SDS-PAGE分析发现SpyCatcherUGTm与SpyTagSUS的交联组装率至少>90 ％(密度测定法)。

(5)发明人还分析了在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中的共表达是否可直接 获得用于固定的自组装UGTm-SUS功能单元。实际上，使用pRSFDuet-1载体的 共表达载体，在体内实现了酶的自组装，即通过纯化可直接获得共价结合的 6xHis-SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS。这些多酶菌内共表达结果表明可以在体 内形成自组装的产物。但鉴于体外混合程序的自组装效率很高，可控性强，体 外自组装酶材料被用于多酶的固定化。

(6)利用自组装模块上丰富的多价组氨酸标签，将多酶组装体直接固定于 功能化的Ni

(6)在级联单元中，稀有的具有药理活性的人参皂苷Rh2可通过糖基转移酶 UGTm糖基化原人参皂苷原二醇(PPD)与伴随UDP生成UDP-葡萄糖(UDPG) 来有效合成。在这个人工级联催化体系中产生的UDP中间体可以直接运输到 邻近的蔗糖合成酶SUS，在高浓度蔗糖存在时，该酶催化昂贵的糖供体UDPG 的再生。共固定的UGTm-SUS阵列的设计和实现具有高效和经济的方式生产有 价值的稀有活性糖苷类分子的潜力。

(7)用30mM咪唑，50mM Tris-HCL缓冲液(pH 7.6)和1％Tween彻底洗 涤以除去非特异性蛋白吸附后，收集具有固定要求的微球用于Broadford分析分 析。仅在UGTm-SUS固定化微球的组装中观察到了Broadford的可见蓝色变化， 表明蛋白质可以快速加载到固相支持物上。

(8)与未固定的微球的光滑表面不同，UGTm-SUS组件固定的微球在光学 显微镜下显示出明显的异质酒窝表面形态。

(9)场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)成像显示存在覆盖载体的颗粒状纳 米层。透射电子显微镜(TEM)显示出定义明确的均匀纳米颗粒的密集分布， 表明微小的生物催化剂组装颗粒以高度有序的阵列形式存在于表面上。酶的四 级结构以及多聚体复合物的潜在多点连接可能是造成这种观察到的形态的原 因。原子力显微镜(AFM)显示，高度均一的蛋白质层的纳米层平均高度约为 20nm。此高度与UGTm/SUS装配结构的估计几何尺寸一致。表明组装体可以 有效地固定以上载体上，从而创建有序的多酶共固定阵列催化材料。

更具体地，本发明提供了一种级联多酶的有序共固定化方法，将级联的多 酶分子通过自组装技术得到多酶纳米蔟，利用多酶纳米蔟元件酶均带有的多组 氨酸标签，形成酶组装体上数量极为丰富的多组氨酸标签，可将有序的多酶纳 米蔟直接亲和固定到Ni

基于该策略，构建了糖基转移酶UGTm和SUS蔗糖合酶SUS的有序共固定阵 列，以实现昂贵的糖供体UDP-葡萄糖的有效原位再生，应用于生物药学活性的 稀有人参皂苷Rh2的生物合成。

糖基转移酶UGTm和SUS蔗糖合酶SUS分别融合SpyCatcher和SpyTag肽段， 及柔性的链接肽段，通过构建表达质粒，或共表达质粒，在异源表达宿主菌种 进行重组表达，进行蛋白纯化，组装。

所述的糖基转移酶UGTm具有如SEQNO:1的氨基酸序列。

所述的糖基转移酶SUS具有如SEQNO:2的氨基酸序列。

所述的重组质粒融合了SpyCatcher及6xHis标签，所述重组质粒的载体为 pET-28a(+)质粒。

所述的重组质粒融合了SpyTag及6xHis标签，所述重组质粒的载体为 pET-28a(+)质粒。

所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述实现多位点糖基化的步骤，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，以原人参二 醇PPD作为糖基受体，在含有UDP-葡萄糖和原人参二醇PPD的反应体系中加入 所述的糖基转移酶和蔗糖合成酶共固定材料进行反应，得到反应液，通过高效 液相色谱(HPLC)、质谱(LC-MS)等进行分离、检测。

通过确定初始酶量减去溶液中残留的蛋白质对固定的孵育时间来检查固 定率。有序共固定的UGTm-SUS阵列仅在30分钟内达到加载平稳期，而随机固 定，即直接将6xHis-UGTm和6xHis-SUS的等摩尔混合物附着于同一Ni

为了分析生物催化效率，发明人检查了有序共固定的UGTm-SUS阵列，随 机共固定的酶及其未结合的游离自组装体对应物的总酶活性。反应在不同的时 间进行，将相应的PPD底物转化率总结。在相同的反应条件下，在总酶浓度相 同的情况下，在第一小时反应时间内，有序的共固定阵列比起的随机共固定和 游离自组装酶系统分别显示出高出约2.9倍和1.7倍的转化率。在第4小时，将近 98.0％的PPD在有序共固定阵列中转化，但是相比之下，在随机共固定中只有 51.0％的PPD被转化，而在游离的自组装体系统中只有73.7％的PPD被转化。

与随机共固定和自由MENC系统相比，有序共固定阵列显示出最高的Rh2 合成初始速率，尤其是在低浓度UDPG(小于400μM)时(图12B)。这些结 果表明，与随机共固定相比，有序共固定的UGTm-SUS阵列不仅增强了酶级联 反应的催化效力，而且还导致UDPG载量降低了3倍。

有序共固定的UGTm-SUS阵列，随机共固定的UGTm/SUS和游离 UGTm-SUS MENC均已制备并储存在4℃下。这些生物催化系统用于在第0天， 然后每两天检测一次酶活性，总共需要八天。有序共固定的UGTm-SUS阵列的 存储稳定性高于随机共固定的阵列和游离MENC对应物。到第8天，游离的 UGTm-SUS MENCs和随机共固定阵列分别仅保留其初始活性的25％和36％，而 有序的共固定的UGTm-SUS阵列在相同条件下保留了其原始活性的约51％

可以通过过滤容易地从反应溶液中分离出多种固定化酶。固定的 UGTm-SUS生物催化级联的可重复使用性由其在每个连续的测试回合中观察到 的活性证明。在每一轮中，将固定的UGTm-SUS生物催化级联与5mM PPD，0.5 mM UDP，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，400mM蔗糖和1％Tween 80(v/v)于 35℃孵育3个小时。有序的固定化UGTm-SUS阵列显示出稳定且连续的操作稳 定性，即使在8轮反应后仍保持超过初始活性的75.1±4.4％

与现有技术相比，本发明具有以下主要优点：

(1)本发明所述多酶共固定阵列催化材料构建中，利用了构建的自组装 体将带有众多的His标签。在实现固定化中，无需引入其他额外修饰，可直接结 合于Ni:NTA功能化的基底材料表面。由于该固定方法简单直接、操作步骤少， 利于保持生物催化剂高活性。而且，所利用的组装体上众多的His标签形成群体 效应，相对其他单融合蛋白His标签介导的固定化，该方法结合力强，明显固定 效率高，稳定性强，不易与基底材料脱离。

(2)本发明所述多酶共固定阵列催化材料中，利用寡聚酶每个亚基上均融合 有的His标签进行基底结合，形成了寡聚酶与基底多点结合，可有效避免寡聚酶应 用中常见的亚基解离造成寡聚酶的失活，从而提升了寡聚酶催化材料的整体稳定性， 利于该催化材料的循环重复使用。

(3)本发明所述多酶共固定阵列催化材料中，所述第一酶(如SUS)和所述第 二酶(如UGTm)有序定向排列并稳定结合于固相基底上，在应用于生物化学合成反 应时，第一酶在催化后的产物，可立即被体系内第二酶接触作为其底物转化，解除 了酶催化中常见的底物抑制效应，提升级联多酶间的协同性，这种多酶间有序的阵 列排布可极大地促进了多酶级联体系的整体催化效率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数 按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉 的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明 方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实验部分

材料

引物STAR Max DNA聚合酶，限制性核酸内切酶和聚合酶链反应(PCR)试 剂购自TaKaRa(中国大连)。蛋白质测定试剂盒购自Sangon(中国上海)，质粒， 凝胶和PCR纯化试剂盒购自Generay(中国上海)。原戊二醇(PPD)，UDP-葡萄 糖，UDP和人参皂甙Rh2标准品购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。异 丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，蔗糖和亚硝酸三乙酸镍(NTA)功能化 的聚苯乙烯基微球购自Raygood Biotech(中国上海)。所有其他试剂均为可用的最 高纯度。

融合基因构建

先前已报道，合成了大肠杆菌密码子优化的编码酿酒酵母UGT51和拟南芥 SUS的基因，并将其用作构建本研究中使用的变体的模板。通过使用带有引物 S81A FP/RP，L82AFP/RP，V84A FP/RP，K92A FP/RP，E96K FP/RP 的引物SQuick Quick PCR扩增UGTm(S81A/L82A/V84A/K92A/E96K/S129A /N172D)，S129A FP/RP和N172D FP/RP。随后将UGTm的片段克隆到 pET28a-SpyCatcher载体中，以使用非连接依赖性克隆产生具有N端SpyCatcher 和C端6xHis标签的质粒pET28-SpyCatcherUGTm。使用SUS FP/RP引物将SUS编 码序列亚克隆到pET28a-SpyTag载体中，以产生带有N末端6xHis标签和SpyTag 的质粒pET28-SpyTagSUS。具有两个多克隆位点(MCS)的pRSFDuet-1载体 (Novagen，Inc。)用于克隆和共表达融合蛋白。还通过标准分子克隆程序构 建了pACYDuet-6xHis-SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS的共表达质粒。在该表达载 体中，插入MCS-1的SpyCatcherUGTm基因可产生在N端带有-6xHis标签的重组蛋 白。与位于MCS-II中的基因相对应的重组蛋白SpyTagSUS没有融合亲和标签。 表S1列出了用于质粒构建的引物和氨基酸序列。通过测序验证所有质粒，然后 将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用于重组蛋白表达。

蛋白质表达和纯化

将阳性转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株在补充有50μg/mL卡那霉素的LB液 体培养基中于37℃下生长。当600nm处的光密度达到0.8时，在20℃下培养16h， 0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。通过以8,000rpm离心15分钟收获细胞，并将其 重悬于pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲液中。重悬的细胞用匀浆器在4℃裂解， 并以12,000rpm离心30分钟。使用0.44μm过滤器过滤上清液，然后将其上样到 Ni-NTA琼脂糖柱(GE，美国)上。用20mM Tris-HCl pH 8.0、500mM NaCl和 30mM咪唑缓冲液洗涤后，重组表达的蛋白用20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl和200mM组成的缓冲液洗脱咪唑并使用Amicon Ultra-15管(美国密理 博)在4℃下离心浓缩。通过在AKTA FPLC系统(GE，USA)上使用Superdex200 递增-10/300柱进行凝胶过滤色谱。根据Broadford方法测定蛋白质浓度。为了 在体内共表达和测试自我组装，还使用标准程序在存在氯霉素(34mg/L) 的情况下，将pACYDuet-6xHis-SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS的共表达质粒转化 到大肠杆菌BL21(DE3)中。用于蛋白质表达和纯化。

酶活性测定

通过高效液相色谱(HPLC)检测了UGTm和SUS的酶活性。用于UGTm活性的 标准检测混合物包含50种Tris-HCl缓冲液(50mM pH 8.0)，PPD(0.5mM)， UDP-葡萄糖(5mM)，1％(v/v)吐温80和0.25mg/mL纯化蛋白，对于SUS 酶分析，该混合物包含50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5mM UDP和500mM蔗糖， 0.25mg/mL蛋白。加入0.25mg/ml酶引发反应后，将反应混合物密封，在 37℃孵育2小时。通过添加300μl正丁醇淬灭酶促反应(300μl)，通过在13,000 g下离心10分钟去除沉淀的蛋白质，并小心去除正丁醇层。使用第二个300μl体 积的正丁醇再萃取一次反应混合物。通过旋转蒸发浓缩合并的正丁醇层，并将 残留物重新溶解在100μl甲醇中，并使用Agilent Eclipse XDB-C18(5μm， 4.6×250mm)色谱柱进行HPLC分析。使用以下梯度实现样品分离：0–14分钟， 14–18分钟内100％B，18–20分钟内45％B，流速保持在0.5mL/min。SUS活性 在35℃下进行1h，将测定混合物煮沸3分钟以终止反应。将反应的混合物以13， 000×g离心20分钟。将上清液用于HPLC分析，并用100mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH6.5和10mM溴化四丁基铵对Eclipse XDB-C18柱进行预平衡。根据标准的 保留时间分配产生的UDPG。所有测量均重复三次。

多种酶的自组装和SDS-PAGE分析

确定新鲜纯化蛋白的浓度后，将具有不同摩尔浓度的SpyCatcherUGTm和SpyTagSUS在含有50mM Tris-HCl pH 7.0至8.5、100mM NaCl的缓冲液中在室 温下混合1h，然后将装配体进行10％SDS-PAGE分析。对于凝胶的详细分析， 使用Tanon GIS数字图像分析系统(Tanon，中国上海)通过光密度法对每个条 带的强度进行定量。

固定化测定

将Ni

FE-SEM，TEM和AFM实验

对于FE-SEM，将固定的UGTm-SUS的材料在10N冻干机(美国克里斯特)上 冻干。在以10kV操作的FEI Sirion 200扫描电子显微镜(FEI，美国)上收集 图像。为了降低充电效果，在分析之前，先用纳米金对样品进行溅射镀膜。对 于TEM，将样品与1.0％的磷钨酸进行对比。TEM使用Tecnai G2 spirit Biotwin 显微镜(美国FEI)进行。对于AFM，通过将10μL固定的MENC滴到裂解的云母 上10分钟，用去离子水洗涤并在空气中干燥来制备样品。使用以拍打模式操 作的扫描探针显微镜(AFM/Multimode NanoscopeIIIa，Bruker，GER)在空 中收集图像。使用Nanoscope v.5.30软件包执行图像分析。

共固定化生物催化级联反应的催化活性

有序共固定的UGTm-SUS阵列，随机共固定的酶及其未结合的游离MENC对应 物的总体酶活性通过监测PPD底物转化率来确定，该转化率是通过HPLC分析获 得的。该测定是在以下混合物中进行的：将50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)， 2mM PPD(溶于乙醇)，500mM蔗糖和1％(v/v)Tween 80与有序共固定的 UGTm混合-SUS阵列，游离的MENC或酶混合物，并预孵育5分钟，然后通过添加 各种浓度的UDP引发反应。随后，将反应物用相同体积的正丁醇淬灭，通过 0.22μm过滤器过滤，并按照酶活性测定法通过HPLC直接分析。所有测量均重 复三次。

稳定性和可重用性分析

通过在25℃下0、2、4、6和8天后在50mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中储存 后测量Rh2合成的酶活性来评估固定化UGTm-SUS MENC和游离酶混合物的储存稳 定性C。初始活性定义为100％。通过过滤器的多次循环研究了有序共固定 的UGTm-SUS阵列的可重用性。将每个循环后有序共固定的UGTm-SUS阵列的活 性归一化至初始值。

结果与分析讨论

图1为设计有序共固定化二聚体的糖基转移酶UGTm和四聚体蔗糖合成酶 SUS形成级联酶催化阵列；A)首先将SpyCatcher/SpyTag融合到UGTm和SUS的 亚基末端，借助SpyCatcherUGTm和SpyTagSUS之间自发形成稳定共价异肽键及 多亚基酶的寡聚形成多酶纳米自组装体。进而利用多酶纳米自组装体中组成酶 上带有的众多多组氨酸标签进一步固定于Ni2

在本发明中，以自组装的多聚酶纳米簇(MENCs)作为设计原理，我们开 发了一种新颖的面部策略，用于有序共固定化多聚酶，促进底物通道化，从而 改善生物催化级联反应的整体性能。在构建中，来自酿酒酵母的二聚体UGT51 糖基转移酶突变体(UGTm，S81A/L82A/V84A/K92A/E96K/S129A/N172D) 和拟南芥的四聚体蔗糖合酶(SUS)被选作模型酶。多聚体酶首先经历由多聚 体寡聚化驱动的分级自组装，其中SpyTag/SpyCatcher共价配对反应产生多聚 酶纳米簇组装。随后，可将MENC模块通过MENC组成酶的多组氨酸标签进一 步固定在合适的Ni

为了避免损害酶活性，我们首先刨析了UGTm-SUS级联组成酶的四级结构。 UGTm和SUS都具有从各个蛋白质的分子表面向外指向的N末端(图2)。SUS 的结构是由分子量为92kDa的单体组成的均四聚体。因此，我们在每个SUS单 体的N末端融合了一个相对较小的SpyTag(～1.5kDa)和6xHis肽。UGTm是 具有45kDa单体的同型二聚体分子，在该分子上，我们将SpyCatcher(～9.5kDa) 肽融合到N-末端，并在每个UGTm单体的C-末端融合了6个组氨酸标签(图 3A,B)。这些带有SpyTag和SpyCatcher反应序列的酶可以表达并纯化以进行生物缀合(图3C)。为了为酶-底物的相互作用保留足够的旋转柔韧性，在相应 的SpyCatcher/SpyTag与融合构建物中的肽之间引入了柔性([(AG)3PEG]5 连接子(图3)。

图2为用于构建的多亚基酶的四级结构。(A)来自酿酒酵母的UGT51(PDB： 5GL5)的结构。(B)来自拟南芥的蔗糖合酶SUS的结构(PDB：3S28)。N 和C末端分别标记为红色和蓝色链。

图3为表达SpyTag/SpyCatcher融合酶的构建体以及SpyCatcher和SpyTag之 间的自发共价结合反应。(A)pET28a-SpyCatcherUGT质粒。SpyC：SpyCatcher 域；LL：(GGGGS)2联结元件。(B)pET28a-SpyTagSUS质粒。SpyT： SpyTag域；LL：[(AG)3PEG]5联结元件。(C)SpyCatcher/SpyTag化学配对 的结构和分子机理。

在大肠杆菌中表达并纯化了融合的SpyCatcherUGTm和SpyTagSUS，以及 未融合的相应酶。纯化蛋白的凝胶过滤色谱分析表明，SpyCatcherUGTm和SpyCatcherSUS显示出与未融合的相应酶相似的保留曲线(图4)。此外，对UDPG 转化率的分析表明，融合的SpyCatcherUGTm和SpyTagSUS表现出与非融合对应 物相似的酶活性(图5)，这表明SpyTag或SpyCatcher融合并未明显损害这些酶 的结构和功能完整性设计。

图4为融合或未融合酶的凝胶过滤色谱分析(A)SpyCatcherUGTm和未融 合UGTm的洗脱谱。(B)SpyTagSUS和未融合的SUS对应物的洗脱谱。

图5为比较SpyCatcherUGTm，SpyTagSUS和非融合酶的相对酶活性。所 有测量至少进行了3次，误差线代表标准误差。

接下来，我们探讨了混合这些融合的SpyCatcher/SpyTag酶是否会导致 形成共价交联的酶复合物。SDS-PAGE显示对应于150kDa以上分子量的蛋白带， 这与理论上计算出的共价偶联分子量166kDa的SpyCatcherUGTm/SpyTagSUS 亚基的分子量一致(图6A)。SpyCatcher/SpyTag对已显示可自组装并在不 同多肽之间形成共价异肽键。值得注意的是，这种交联反应对pH敏感(图7)， 支持SpyCatcher/SpyTag介导的共价结合。当融合酶以1：1亚基摩尔比(50mM Tris-HCL缓冲液(pH 7.6)，室温，孵育1小时)混合时，发现SpyCatcherUGTm 与SpyTagSUS的结合率至少>90％(光密度法分析)。

图6为(A)SpyCatcher/SpyTag介导的UGTm-SUS自组装的SDS-PAGE分析。 将纯化的酶和组装的UGTm-SUS多酶纳米蔟进行10％SDS-PAGE操作，并用考马 斯亮蓝染色。泳道M，蛋白分子量；泳道1，纯化的重组SpyTagSUS蛋白；泳道 2，纯化的重组spyCatcherUGTm蛋白；泳道3，组装的 SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS蛋白。(B)通过光密度测定法确定组装的SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS蛋白的纯度，纯度为91％。

图7为不同pH下SpyCatcher/SpyTag的介导不可逆共价结合。泳道M：蛋 白质标志物(kDa)，泳道1：SpyTagSUS，泳道2：SpyCatcherUGTm，泳道3： 在pH 7.0Tris-HCl缓冲液中的自组装，泳道4：在pH 7.5Tris-HCl缓冲液中 的自组装，泳道5：在pH 8.0Tris-HCl缓冲液中的自组装，泳道6：在pH 8.5 Tris-HCl缓冲液中的自组装。

我们还检查了在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中的共表达是否可用于获得用 于固定的自组装UGTm-SUS功能单元。实际上，在体内自组装后，直接产生了包 含来自pRSFDuet-1载体的共表达构建体，即共价结合的6xHis-SpyCatcherUGTm /SpyTagSUS产品，并通过亲和色谱法纯化(图8B)。这些最初的共表达结果 表明可以在体内形成组装的产物。但是，鉴于体外混合程序的组装效率很高， 我们将体外方法用于随后的固定化实验。

图8，(A)用于体内蛋白共表达和自组装的 pACYDuet-6xHis-SpyCatcherUGTm-SpyTagSUS的构建体(B)对用Ni

为了快速有效地固定UGTm-SUS组件，我们使用了市售的基于聚苯乙烯的微 球(直径约100至150μm)，并用Ni

图9为功能化微球上固定化的UGTm-SUS组件的表征。A)Broadford法分析 固定化材料；彻底清洗酶溶液中孵育的微球后，使用Bradford溶液检查支持 物上附着的蛋白质；空白对照：Broadford溶液；非固定化材料：新鲜制备 的微球在Broadford溶液中；固定化：固定处理过的微球在Broadford溶液。(B) 固定化或非固定化处理的功能化微球的光学显微镜图像。凸凹表面形态的示 例由蓝色箭头指示。未固定化处理的功能化微球显示出光滑的表面(插图)。

图10为固定化UGTm-SUS自组装体的功能化微球的光学显微镜图像。凹凸 表面形态的示例由蓝色箭头指示。

场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)成像显示存在覆盖载体的颗粒状纳米层 (图11A)。透射电子显微镜(TEM)显示出定义明确的均匀纳米颗粒的密集分 布，表明微小的生物催化剂组装颗粒以高度有序的阵列形式存在于表面上(图11B)。酶的四级结构以及多聚体复合物的潜在多点连接可能是造成这种观察 到的形态的原因。原子力显微镜(AFM)显示，高度均一的蛋白质层的纳米层 平均高度约为20nm(图11C)。此高度与UGTm-SUS组装结构的估计几何尺寸(约 16nm)一致。以上结果表明，该组件可以有效地固定，从而创建有序的生物 催化级联阵列。

图11为UGTm-SUS阵列有序共固定的代表性电子显微镜图像。A)固定化的 UGTm-SUS自组装体在支持物表面的扫描电镜图像。固定后，将样品冻干并在 分析之前用纳米金溅射涂层。在扫描电镜下观察到固定化材料中出现颗粒状 结构。B)固定化的UGTm-SUS自组装体的透射电镜图像。分析之前，将组装 好的样品用磷钨酸染色。在透射电镜下可以看到表面上有序排列的微小颗粒。 C)固定化的UGTm-SUS自组装体的原子力电镜图像。固定的多酶复合物的微观 结构的高度约为20nm。

接下来，我们通过确定初始酶量减去溶液中残留的蛋白质对固定的孵育时 间来检查固定率。有序共固定的UGTm-SUS阵列仅在30分钟内达到加载平台，而 由于随机固定，直接附着于同一Ni

图12为多酶固定化速率，UDPG再生效率，以及有序共固定的UGTm-SUS阵列 存储稳定性和重复实用性分析。A)在20℃和pH 7.0下，UGTm-SUS自组装体和 多酶混合物在载体上的固定效率分析；从用于固定化的总蛋白质与固定后溶液 中残留量之间的差异确定固定化蛋白质的量。B)转换效率分析。转化率显 示为PPD转化为最终产物Rh2的百分比。C)有序共同固定，随机共同固定系统 和自由多酶纳米自组装体在不同UDP浓度下的初始转化速率。D)在4℃下的储 存稳定性。所有测量均在40μM蛋白质浓度下进行；E)在多个回收周期后， 有序共固定化的UGTm-SUS阵列可重复使用性；数据代表三个测量值的平均值± 标准偏差。

通过HPLC分析，我们确定了在固相支持物上有序共固定的UGTm-SUS生物催 化级联反应是活跃的，可用于稀有Rh2的生物合成(图13)。为了分析生物催 化效率，我们检查了有序共固定的UGTm-SUS阵列，随机共固定的UGTm和SUS酶 以及它们的未结合的游离MENC的整体级联酶活性。反应在不同的时间进行，相 应的人参皂苷PPD底物转化率总结在图12B中。在相同的反应条件下，在总酶浓 度相同的情况下，有序的共固定阵列在第一个小时内的转化率分别比随机的共 固定和游离MENCs系统高近3.8和2.3倍。在第4小时，几乎100％的PPD在有序共 固定阵列中被转化，但是相比之下，在随机共固定中只有43.5％的PPD被转化， 而在自由MENCs系统中只有66.7％的PPD被转化。我们认为，与随机排列的酶 级联反应相比，UGTm和SUS之间的适当底物通道可能存在于有序的共固定阵列 中，从而显着改善了生物催化级联的协同效应。该有序共固定阵列在所有测试 时间点均显示出比游离MENC更高的催化效率，这表明MENC的超分子结构可能对 底物和产物产生扩散约束，当MENC表面固定在载体上时可以消除。UGTm-SUS 的有序共固定阵列确保底物分子可以轻松访问生物催化剂的活性位点，从而增 强了活性。

图13是通过有序固定的UGTm-SUS级联的协同催化，由PPD形成的最终产物 Rh2的HPLC分析。

我们通过使用各种浓度的UDP测量Rh2产生的初始速率，进一步分析了生物 催化级联的UDPG再生效率。与随机共固定和自由MENCs系统相比，有序共固定 阵列显示了最高的Rh2合成初始速率，尤其是在低浓度UDP(小于0.4mM)下(图 12C)。有序的固定化UGTm-SUS阵列在0.4mM UDP水平下显示出最高的Rh2合成 初始速率。但是，多酶的随机共固定化在1.2mM UDP时具有最高的合成率。这 些结果表明，与随机共固定相比，有序共固定的UGTm-SUS阵列不仅增强了酶级 联反应的催化效力，而且还导致UDP使用量减少了3倍。底物通道化促进了中间 体的运输，避免了在糖基转移酶反应中经常观察到的UDP抑制，并实质上刺激 了Rh2的合成。此外，由于SUS催化易于逆转，因此UDPG的快速消耗和UDP传输 将SUS介导的反应平衡向UDPG合成转移，从而促进了整个酶促级联反应。

当谈到固定化对生物生产应用的重要性时，存储稳定性和可重复使用性是 重要的参数。有序共固定的UGTm-SUS阵列，随机共固定的UGTm/SUS和游离UGTm-SUS MENC均已制备并储存在4℃下。这些生物催化系统用于检测酶活性， 从第零天开始，然后每两天检测一次，共八天。有序共固定的UGTm-SUS阵列的 存储稳定性高于随机共固定的阵列和游离MENCs对应物。到第8天，随机共固定 的UGTm和SUS生物催化剂和游离的MENC分别仅保留其初始活性的19.1％和26.6 ％，而有序的共固定的UGTm-SUS阵列在相同条件下保留了其原始活性的约52.6 ％。条件(图12D)。这种增强的储存稳定性可能来自精确的超分子结构的形 成，该结构在长期储存过程中保留了酶的结构。

此外，证明了可以通过过滤容易地将多种固定化酶从反应溶液中分离。固 定的UGTm-SUS生物催化级联的可重复使用性由其在每个连续的测试回合中观 察到的活性证明。在每一轮中，将固定的UGTm-SUS生物催化级联与5mM PPD， 400μM UDP，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，400mM蔗糖和1％Tween 80(v/v) 于35℃孵育。3个小时。有序的固定化UGTm-SUS阵列显示出稳定且连续的操作 稳定性，即使在8轮反应后仍保持超过初始活性的73.1±3.2％(图12E)。我 们观察到的简单分离和出色的可重用性将显着降低在生物转化中实际应用固 定级联反应的操作成本。

总之，这项研究已经开发出一种新的策略，通过使用自组装多聚酶纳米簇 作为构建基块和蛋白质六组氨酸标签亲和力技术，将不同的生物催化组分在固 相支持物上进行有序共定位。与随机，无组织的共同固定系统相比，开发的拓 扑明确定义的共同固定系统可以更好地激活酶级联反应。同样，自组装的最新 进展表明，其他新的自反应生物正交反应化学对可用于设计不同级联生物催化 剂的结合。这些生物正交基团在蛋白质中的位点特异性引入以及三个或更多酶 级联的组织，或固定级联反应中心的拓扑自组装，代表了令人兴奋的未来机会。 在酶的某些位置上选择性引入的组氨酸标签还可以在与Ni

图14为未装载前微球的SEM图片。

图15为随机固定化多酶后所得催化材料的扫描电镜照片。

图16为多酶有序固定化所得微球的扫描电镜照片。

上述结果表明：多酶有序共固定化形成了稳定的装载在微球表面，而简单 混合多酶后装载微球，产生随机固定化；在同样固定结束用缓冲液洗微球后， 电镜下出现了层结构的破损缺失(见图15)，而有序固定化表面出现明显固定层， 且完整(见图16)。这一对比结果，表明了直接his标签介导的产生的随机固定 多酶是相对不稳定的。

本发明涉及序列如下所示：

表S1在质粒构建体中使用的引物

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种提升级联催化体系效率的多酶有序共固定化方法

<130> P2020-2155

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Leu Met Ile Asp Glu Asn Pro His Tyr Lys Thr Ser Ile Lys Pro Asn

1 5 10 15

Lys Ser Tyr Lys Phe Gly Leu Leu Thr Ile Gly Ser Arg Gly Asp Val

20 25 30

Gln Pro Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Gly Leu Ile Lys Glu Gly His Gln

35 40 45

Val Val Ile Ile Thr His Ser Glu Phe Arg Asp Phe Val Glu Ser His

50 55 60

Gly Ile Gln Phe Glu Glu Ile Ala Gly Asn Pro Val Glu Leu Met Ala

65 70 75 80

Ala Met Ala Glu Asn Glu Ser Met Asn Val Ala Met Leu Arg Lys Ala

85 90 95

Ser Ser Lys Phe Arg Gly Trp Ile Asp Ala Leu Leu Gln Thr Ser Trp

100 105 110

Glu Val Cys Asn Arg Arg Lys Phe Asp Ile Leu Ile Glu Ser Pro Ala

115 120 125

Ala Met Val Gly Ile His Ile Thr Glu Ala Leu Gln Ile Pro Tyr Phe

130 135 140

Arg Ala Phe Thr Met Pro Trp Thr Arg Thr Arg Ala Tyr Pro His Ala

145 150 155 160

Phe Ile Val Pro Asp Gln Lys Arg Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Thr

165 170 175

His Val Leu Phe Glu Asn Val Phe Trp Lys Gly Ile Ser Gly Gln Val

180 185 190

Asn Lys Trp Arg Val Glu Thr Leu Gly Leu Gly Lys Thr Asn Leu Phe

195 200 205

Leu Leu Gln Gln Asn Asn Val Pro Phe Leu Tyr Asn Val Ser Pro Thr

210 215 220

Ile Phe Pro Pro Ser Ile Asp Phe Ser Glu Trp Val Arg Val Thr Gly

225 230 235 240

Tyr Trp Phe Leu Asp Asp Lys Ser Thr Phe Lys Pro Pro Ala Glu Leu

245 250 255

Gln Glu Phe Ile Ser Glu Ala Arg Ser Lys Gly Lys Lys Leu Val Tyr

260 265 270

Ile Gly Phe Gly Ser Ile Val Val Ser Asn Ala Lys Glu Met Thr Glu

275 280 285

Ala Leu Val Glu Ala Val Met Glu Ala Asp Val Tyr Cys Ile Leu Asn

290 295 300

Lys Gly Trp Ser Glu Arg Leu Gly Asp Lys Ala Ala Lys Lys Thr Glu

305 310 315 320

Val Asp Leu Pro Arg Asn Ile Leu Asn Ile Gly Asn Val Pro His Asp

325 330 335

Trp Leu Phe Pro Gln Val Asp Ala Ala Val His His Gly Gly Ser Gly

340 345 350

Thr Thr Gly Ala Ser Leu Arg Ala Gly Leu Pro Thr Val Ile Lys Pro

355 360 365

Phe Phe Gly Asp Gln Phe Phe Tyr Ala Gly Arg Val Glu Asp Ile Gly

370 375 380

Val Gly Ile Ala Leu Lys Lys Leu Asn Ala Gln Thr Leu Ala Asp Ala

385 390 395 400

Leu Lys Val Ala Thr Thr Asn Lys Ile Met Lys Asp Arg Ala Gly Leu

405 410 415

Ile Lys Lys Lys Ile Ser Lys Glu Asp Gly Ile Lys Thr Ala Ile Ser

420 425 430

Ala Ile Tyr Asn Glu Leu Glu Tyr Ala Arg Ser Val Thr Leu Ser Arg

435 440 445

Val Lys Thr Pro Arg Lys Lys Glu Glu Asn Val Asp Ala Thr Lys Leu

450 455 460

Thr Pro Ala Glu Thr Thr Asp Glu Gly Trp Thr Met Ile

465 470 475

<210> 2

<211> 808

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Ala Asn Ala Glu Arg Met Ile Thr Arg Val His Ser Gln Arg Glu

1 5 10 15

Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg Asn Glu Val Leu Ala Leu

20 25 30

Leu Ser Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln Gln Asn Gln

35 40 45

Ile Ile Ala Glu Phe Glu Ala Leu Pro Glu Gln Thr Arg Lys Lys Leu

50 55 60

Glu Gly Gly Pro Phe Phe Asp Leu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile

65 70 75 80

Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val

85 90 95

Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Leu His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu

100 105 110

Gln Pro Ala Glu Phe Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Val

115 120 125

Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala

130 135 140

Ser Ile Pro Arg Pro Thr Leu His Lys Tyr Ile Gly Asn Gly Val Asp

145 150 155 160

Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser

165 170 175

Leu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Arg Leu His Ser His Gln Gly Lys

180 185 190

Asn Leu Met Leu Ser Glu Lys Ile Gln Asn Leu Asn Thr Leu Gln His

195 200 205

Thr Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ala Glu Leu Lys Ser Glu Thr

210 215 220

Leu Tyr Glu Glu Phe Glu Ala Lys Phe Glu Glu Ile Gly Leu Glu Arg

225 230 235 240

Gly Trp Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu Asp Met Ile Arg Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu

260 265 270

Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly

275 280 285

Tyr Phe Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln

290 295 300

Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Ile Glu Met Leu

305 310 315 320

Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Lys Pro Arg Ile Leu Ile

325 330 335

Leu Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Glu Arg

340 345 350

Leu Glu Arg Val Tyr Asp Ser Glu Tyr Cys Asp Ile Leu Arg Val Pro

355 360 365

Phe Arg Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu

370 375 380

Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Ala Ala Val Glu Leu

385 390 395 400

Ser Lys Glu Leu Asn Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser

405 410 415

Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr

420 425 430

Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

435 440 445

Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Asp Asp Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln

450 455 460

Phe Thr Ala Asp Ile Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr

465 470 475 480

Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Glu Thr Val Gly Gln Tyr

485 490 495

Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His

500 505 510

Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala

515 520 525

Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Glu Lys Arg Arg Leu Thr

530 535 540

Lys Phe His Ser Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Val Glu Asn

545 550 555 560

Lys Glu His Leu Cys Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Pro Ile Leu Phe

565 570 575

Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Leu Ser Gly Leu Val Glu

580 585 590

Trp Tyr Gly Lys Asn Thr Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asn Leu Val Val

595 600 605

Val Gly Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Asn Glu Glu Lys Ala

610 615 620

Glu Met Lys Lys Met Tyr Asp Leu Ile Glu Glu Tyr Lys Leu Asn Gly

625 630 635 640

Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asp Arg Val Arg Asn Gly Glu

645 650 655

Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala

660 665 670

Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly

675 680 685

Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys Lys Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val

690 695 700

His Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Asp Gln Ala

705 710 715 720

Ala Asp Thr Leu Ala Asp Phe Phe Thr Lys Cys Lys Glu Asp Pro Ser

725 730 735

His Trp Asp Glu Ile Ser Lys Gly Gly Leu Gln Arg Ile Glu Glu Lys

740 745 750

Tyr Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val

755 760 765

Tyr Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Leu Glu Ala Arg

770 775 780

Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Pro Leu Ala Gln

785 790 795 800

Ala Val Pro Leu Ala Gln Asp Asp

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

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Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met

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Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp

50 55 60

Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val

65 70 75 80

Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe

85 90 95

Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys

100 105 110

Gly Asp Ala His Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

His Met Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Glu Leu Ala Gly Ala Gly Ala Gly Pro Glu Gly Ala Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Pro Glu Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Pro Glu Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Gly Pro Glu Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Pro Glu

50 55 60

Gly Gly Gly Ser

65

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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cattttccac catcaacgcc atcaactcca ctgg 34

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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gtggagttga tgtccgcgat ggtggaaaat gaat 34

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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attcattttc caccatcgcg gacatcaact ccac 34

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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ttgatgtcct tgatggcgga aaatgaatca atga 34

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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tcattgattc attttccgcc atcaaggaca tcaa 34

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<212> DNA

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atgaatcaat gaatgttgcg atgctgagag aagct 35

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<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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gttaaaatgc tgagagcggc ttcgagcaaa ttt 33

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<212> DNA

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aaatttgctc gaagccgctc tcagcatttt aac 33

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<211> 34

<212> DNA

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ctgattgaat cacccgcggc tatggttggt attc 34

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<212> DNA

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aataccaacc atagccgcgg gtgattcaat caga 34

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<212> DNA

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aaaaaagggg cggtgcgtat aactacctga ca 32

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<212> DNA

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<400> 17

tgtcaggtag ttatacgcac cgcccctttt tt 32

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<212> DNA

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cgcggatccg caaacgctga acgtatgata acg 33

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

ccgctcgagt caatcatctt gtgcaagagg aacagc 36