一种鹌鹑早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鹌鹑早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对。

背景技术

鹌鹑属于特种经济禽类范畴，鹑蛋和鹑肉的营养物质含量基本都高于鸡蛋和鸡肉，具有极高的食用价值。鹌鹑性成熟早、生长速度快、繁殖力强、饲料转化率高，具有较好的养殖前景。

当今，商业化家禽大都是以配套系模式生产的，父系一般生长速度较快，母系一般繁殖效率较高，因此都需要早期进行性别鉴定，父系要提前淘汰母雏，母系要提前淘汰公雏。肉用鹌鹑公鹌鹑生长速度较快，公母分群饲养，养殖效益会更好。蛋用鹌鹑出雏时只保留母雏，公雏直接淘汰。因此鹌鹑早期性别鉴定在生产中具有重要的意义。

目前鹌鹑早期的性别鉴定主要通过翻肛观察生殖突起进行鉴别。但翻肛鉴别须在雏鹌鹑出生24小时内进行，超过这个时间段，雏鹌鹑肛门难以翻开，生殖突起萎缩甚至陷入泄殖腔深处，不便观察。翻肛鉴别劳动强度大、工作环境差、专业性高，误鉴率也较高。通过分子生物学手段，快速、准确的进行鹌鹑早期性别鉴定具有重要意义。

目前分子性别鉴定一般是利用染色体螺旋蛋白基因(chromobox helicase DNAbinding gene，CHD)，利用雌性个体中具有两个同源拷贝，而雄性个体中只有一个拷贝。但雌性个体CHD基因两个同源拷贝序列较为保守，一般只相差100-200bp，利用琼脂糖电泳，分辨率较低，极容易误判，利用分辨率高的聚丙烯酞胺凝胶电，试验过程过于繁琐，并且毒性很大。

随着我国鹌鹑产业的快速发展，亟需开发一种简单方便，能够快速、准确鉴别鹌鹑性别的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种鹌鹑早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对。

本发明提供了一种鉴定鹌鹑性别的方法，包括如下步骤：

以待测鹌鹑的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，如果得到一种扩增产物、待测鹌鹑为或候选为公鹌鹑，如果得到两种扩增产物、待测鹌鹑为或候选为母鹌鹑；

所述特异引物对由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成。

所述一种扩增产物为一种特征性扩增产物，大小为537bp；

所述两种扩增产物为两种特征性扩增产物，大小分别为941bp和537bp。

所述基因组DNA可提取自鹌鹑的羽毛或血液。

所述基因组DNA可提取自鹌鹑的组织。

所述基因组DNA可提取自鹌鹑的器官。

所述PCR扩增的反应体系具体可为：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物1μL，10μmol/L反向引物1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。

所述PCR扩增的反应程序具体可为：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35循环；72℃10min。

本发明还保护特异引物对，由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成。所述特异引物对用于鉴定或辅助鉴定鹌鹑性别。

本发明还保护所述特异引物对在鉴定或辅助鉴定鹌鹑性别中的应用。

本发明还保护所述特异引物对在制备鉴定或辅助鉴定鹌鹑性别的试剂盒中的应用。

本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定鹌鹑性别的试剂盒，包括所述特异引物对。

本发明还保护所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定鹌鹑性别中的应用。

以上任一所述鹌鹑具体可为朝鲜鹌鹑或日本鹌鹑。

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可用于鹌鹑早期性别快速鉴定的PCR引物对，并提供了应用所述引物对通过PCR鉴定鹌鹑性别的试剂盒和方法。

本发明与现有技术相比具有以下优点：公鹌鹑和母鹌鹑具有条带数量的区别，并且特征带的差异约为400bp，可通过琼脂糖电泳检测，操作简单方便，不容易误判，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。

附图说明

图1为实施例1中的PCR扩增产物的电泳图谱。

图2为实施例2中的PCR扩增产物的电泳图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

记载鹌鹑的文献如下：活体检测预测栗羽蛋鹌鹑屠宰性能的研究，穆春宇，汤青萍，张蕊，付胜勇，常玲玲，卜柱，安徽农业科学，J.Anhui Agric.Sci.2020，48(1):92-95。

实施例1、方法的建立

供试样本：10只已知性别的成年朝鲜鹌鹑，编号1-5的为5只公鹌鹑，编号6-10的为5只母鹌鹑。

1、取供试样本的血液，提取基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增。

PCR扩增采用的引物对如下：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-TGTATTTTGGTTCTACAGGC-3'；

反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-ATCATCATAACCATAAATCT-3'。

PCR扩增的反应体系(50μL)：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物1μL，10μmol/L反向引物1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。

PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35循环；72℃10min。

3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

电泳图见图1。图1中，泳道1至10依次对应供试样本的编号为1至10。所有公鹌鹑均显示单一特征带(经测序，均为537bp)。所有母鹌鹑均显示两条特征带(经测序，一条均为941bp，另一条均为537bp)。

结果表明，本发明的引物对以及相应的PCR检测方法能够快速准确对鹌鹑进行性别鉴定，并且简单易于操作。

实施例2、方法的应用

供试样本：17只未知性别的日本鹌鹑雏鹌鹑。

1、取供试样本的血液，提取基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增。

PCR扩增采用的引物对如下：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-TGTATTTTGGTTCTACAGGC-3'；

反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-ATCATCATAACCATAAATCT-3'。

PCR扩增的反应体系(50μL)：2×PCR Mix(南京博尔迪生物有限公司)25μL，10μmol/L正向引物1μL，10μmol/L反向引物1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。

PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35循环；72℃10min。

3、完成步骤2后，PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

电泳图见图2。图2中，泳道1至17依次代表17个供试样本。其中，部分供试样本显示537bp的单一特征带(泳道3、4、6、7、8、10、11)、判断为公鹌鹑，部分供试样本显示941bp和537bp的两条特征带(泳道1、2、5、9、12、13、14、15、16、17)、判断为母鹌鹑。特征带大小已进行测序验证。

供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 一种鹌鹑早期性别鉴定的方法以及配套试剂盒和专用引物对

<130> GNCYX210395

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtattttgg ttctacaggc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcatcataa ccataaatct 20