贝前列素钠作为改善血管性痴呆药物的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及贝前列素钠在制备改善血管性痴呆的药物中的应用。

背景技术

随着人口老龄化，阿尔茨海默病和血管性痴呆等神经退行性疾病变得越来越常见，而其中血管性痴呆的患者逐年增长，仅次于阿尔兹海默病，成为第二大痴呆疾病。血管性痴呆是一种由轻度认知障碍到痴呆的血管性疾病引起的一系列神经功能障碍。这严重影响着人类，特别是老年人群的健康和生活，给家庭与社会带来了巨大的精神及经济负担。

血管性痴呆的分类依据包括白质改变和腔隙性梗死的小血管疾病。慢性脑灌注不足后，动脉硬化可影响白质病变，这种血流动力学变化可影响认知功能。然而，这一机制如何导致血管性痴呆的病理生理学尚未完全阐明。有研究表明，髓鞘是神经轴突周围的绝缘体，神经轴突构成大脑的白质。通过诱导跳跃传导，提高轴突传导速度。因此，髓鞘缺失导致的脑白质损伤与血管性痴呆有关。髓鞘形成对运动学习很重要。如果髓鞘有缺陷或受损，就会导致严重的认知和运动障碍。而髓鞘是由少突胶质前体细胞(OPCs)分化而来的，大脑中少突胶质细胞前体细胞(OPC)受损，就会导致髓鞘形成延迟，或现有的髓鞘被破坏。因此促进少突胶质前体细胞分化，从而减少髓鞘缺失，进而改善轴突传导与白质损伤，有可能作为一种治疗机制来降低这些疾病的严重程度。

贝前列素钠(Beraprost Sodium，BPS)是前列环素类药物，具有抗血小板和血管舒张功能，在多种疾病中发挥重要作用。目前临床上主要用于改善慢性动脉闭塞性疾病引起的溃疡、间歇性跛行、疼痛和冷感等症状。有研究报道，BPS可预防急性缺血性卒中的微循环紊乱，并且BPS可以防止老年脑梗死患者动脉硬化的发展，对肾脏和神经系统具有保护作用，因此猜测贝前列素钠可能在一定程度改善患者的意识障碍。因此使用贝前列素钠，从行为学、黑金染色以及相关蛋白角度对于血管性痴呆模型小鼠的认知改善进行研究，证实药物的有效性及其可能机制，为临床提供治疗新思路。

贝前列素钠(Beraprost Sodium)其化学名称为：(±)-2，3，3a，8b-四氢-2-羟基-1-(3-羟基-4-甲基-1-辛烯-6-炔基)-1H-环戊并苯并呋喃-5-丁酸钠，分子式为C24H29NaO5，分子量为420.48，分子结构式如式(1)所示

目前，尚没有文献报道贝前列素钠用于血管性痴呆疾病的治疗。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种在制备治疗或预防血管性痴呆药物中的应用，该药物可以明显改善血管性痴呆小鼠空间认知记忆能力和探究行为，其发挥的神经保护机制可能与其改善脑白质损伤作用明确相关。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的第一方面，提供贝前列素钠在制备改善血管性痴呆的药物中的应用。

本发明的式(1)化合物可通过市售方式获得。

进一步地，贝前列素钠通过改善脑白质损伤而在制备改善血管性痴呆的药物中应用。

进一步地，所述改善血管性痴呆药物具有以下功用之一：通过促进少突胶质前体细胞向成熟的少突胶质细胞分化，从而增加髓鞘，改善脑白质损伤，从而促进血管性痴呆患者恢复其认知功能。因此可将贝前列素钠设计为靶向药物来改善血管性痴呆患者的认知功能障碍。

本发明的第二方面，提供一种用于改善血管性痴呆的方法，为向对象施用贝前列素钠，所述对象可以是哺乳动物或罹患血管性痴呆的患者。

其应用方法为，将贝前列素钠加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成药学上常用的制剂。

进一步地，将贝前列素钠制备成薄膜衣片制剂，应用于口服给药。

可选的，贝前列素钠薄膜衣片为20μg规格的白色至类白色薄膜衣片，一面刻有“BS20”，除包衣后显白色。

可选的，贝前列素钠薄膜衣片为40μg规格的淡黄色薄膜衣片，一面刻有“BS40”，除包衣后显白色。

所述贝前列素钠改善脑白质损伤的检测方法选自但不限于：行为学检测方法、黑金染色及细胞分子生物学检测方法。

进一步地，所述行为学检测方法可选自水迷宫实验(Morris Water Maze，MWM)、新物体识别实验(Novel Object Recognition Test，NOR)以及Y迷宫实验(Y-Maze)。

进一步地，所述黑金染色选用Black-Gold II Myelin Ready-to-DiluteStaining Kit试剂盒

进一步地，所述细胞分子生物学检测方法可选自蛋白印迹杂交电泳(WesternBlot，WB)以及免疫荧光染色(Immunofluorescence，IF)。

本发明的有益效果在于：

1.本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对贝前列素钠的功能进行了初步研究，发现贝前列素钠具有改善脑白质损伤的作用，进而发现贝前列素钠具有改善血管性痴呆患者认知功能障碍的用途，可以将贝前列素钠设计为靶向药物来促进血管性患者的认知功能恢复，对促进血管性痴呆的治疗有着潜在的巨大应用价值。

2.本发明所述贝前列素钠是一种成品药物，贝前列素钠作用于血管性痴呆的病理过程，符合当今研制治疗血管性痴呆药物的决策；通过促进少突胶质前体细胞向成熟的少突胶质细胞分化，从而增加髓鞘，改善脑白质损伤，进而改善血管性痴呆带来的认知功能障碍。

附图说明

图1表示血管性痴呆模型小鼠Morris水迷宫行为学实验结果；其中，A为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠造模后训练期在登上平台前潜伏期时长统计图；B为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠造模后测试期穿越平台次数统计图；C为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠造模后测试期在目标象限停留时长统计图；D为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠造模后测试期穿越平台潜伏期时长统计图；E为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠造模后测试期运动轨迹示意图。

图2表示血管性痴呆模型小鼠行为学实验结果；其中，A表示血管性痴呆模型小鼠新物体识别行为学实验结果，为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠对新物块的探索时长统计图；B表示血管性痴呆模型小鼠Y迷宫行为学实验结果，为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠探索空间正确率的统计图。

图3表示黑金染色方法及免疫荧光染色法检测血管性痴呆模型小鼠脑组织中胼胝体髓鞘染色结果和少突胶质前体细胞及成熟的少突胶质细胞表达情况；其中，A为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠胼胝体髓鞘染色示意图；B为对照组、VD组、BPS各剂量组小鼠少突胶质前体细胞及成熟的少突胶质细胞染色示意图。

图4表示免疫荧光染色方法检测VD模型小鼠脑组织中少突胶质前体细胞标记物及成熟的少突胶质细胞标记物表达情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明从整体到分子水平，系统探讨贝前列素钠对脑白质损伤的改善作用。本发明首先从整体角度，先通过Morris水迷宫确定BCAS模型导致认知功能障碍，而贝前列素钠可改善其空间记忆认知功能，后又以新物体识别实验、Y迷宫验证醒贝前列素钠对探索行为的改善情况，从而证明贝前列素钠对血管性痴呆的认知功能障碍具有促进其恢复作用；再从整体到离体水平，用分子生物学等技术研究贝前列素钠可以通过增促进少突胶质前体细胞向成熟的少突胶质细胞分化，从而增加髓鞘，以证明贝前列素钠可以作为治疗血管性痴呆的潜在靶点药物。

本实验将双侧颈动脉狭窄(BCAS)的C57BL/6小鼠作为血管性痴呆模型，小鼠置于SPF级实验动物屏障环境中饲养和护理，饲养屏障环境为温度20-26℃，相对湿度为40％-70％，12h:12h明暗交通人工光照循环，屏障内噪声控制在60db以下，自由获取食物和水源，并将体重20-25g的小鼠用于实验。

小鼠血管性痴呆模型的制备

步骤1：麻醉选8-9周大的雄性B6鼠，约20-25g，水合氯醛按0.003ml/g麻醉小鼠。

步骤2：分离将小鼠麻醉后仰卧固定于手术台上，剪毛，消毒，采用颈部正中切口，先分离右侧颈总动脉。

步骤3：结扎通过颈部正中切口，右侧颈总动脉暴露在外，用显微弯镊从组织中挑出。在右侧颈总动脉的远端周围放置一条7-0号丝线。(打活结，放置弹簧圈后解开取出)。

步骤4：放弹簧圈用弯镊夹住缝线轻轻地提起动脉，并将颈总动脉放在弹簧圈之间，弹簧圈通过围绕颈总动脉旋转而缠绕。之后解开活结看到绕着弹簧圈的颈总动脉跳动并且没有出血表示成功。取一小团棉花放在伤口上，滴几滴生理盐水保持伤口湿润。将小鼠固定在保温垫上保持体温，等待30分钟。30分钟后，分离左侧颈总动脉，另一个同样大小的弹簧圈缠绕在左侧颈总动脉，步骤相同。

步骤5：缝合取4-0缝合线缝合伤口，待缝合结束将小鼠放在保温垫上等待苏醒，模型结束。

假手术的动物接受了相同的程序，排除了微线圈的放置。

给药分组以及方式

取48只小鼠，其中36只小鼠接受BCAS手术，12只小鼠接受假手术，之后BCAS组的小鼠随机分成每组12只，分别给予生理盐水、50μg/kg BPS、以及100μg/kg BPS经灌胃方式给药，供药条件为每日两次，连续14日；得到BPS各剂量组的小鼠模型。

对照组小鼠模型为假手术组(sham)小鼠，生理盐水灌胃。

试验例1

Morris水迷宫

水迷宫实验用于检测动物空间位置学习记忆能力的行为学实验方法。水迷宫由黑色圆形水池和可移动的有机玻璃平台组成，水池直径122cm，75cm，平台高度50cm，直径10cm，平台低于水面1cm，水温控制范围为23±2℃。本实验分为训练期及测试期。

步骤1：实验前1天让对照组、VD组及BPS各剂量组小鼠熟悉水迷宫的环境1min；

步骤2：对各组的小鼠进行训练，训练期持续5天，每天将每组实验的小鼠分别从水池的东、西、南、北四个象限面向池壁放入水中，记录小鼠找到平台的逃避潜伏时间，若小鼠超过1min仍未找到平台，则将其引导至平台上停留30s；

步骤3：第6天为测试期，将水池中的平台撤去，将各组小鼠分别放入各个象限，利用Any-maze软件监测小鼠运动轨迹，记录1min内，小鼠穿越平台位置的次数及逃避潜伏期，计算小鼠平均游泳速度及探索路程。

AD模型小鼠Morris水迷宫行为学实验结果参见图1，由图1中的A图-E图可知，BPS各剂量组小鼠训练期找到平台的潜伏期较VD小鼠模型组明显缩短，而测试时BPS各剂量组小鼠穿过平台次数较VD小鼠模型组明显增加，说明贝前列素钠可改善VD小鼠的空间认知功能障碍，且各组小鼠游泳速度没有明显差异，说明贝前列素钠的灌胃对小鼠的运动功能没有明显的影响。图中，所有的数值均表示为平均值±标准误，#表示VD组与sham组比较又统计学差异，*代表各组与VD组比较有统计学差异；#或*表示P<0.05；##或**表示P<0.01；###或***表示P<0.0001；P表示概率值，当P小于0.05时在统计学上才有意义。

试验例2

新物体识别(Novel Object Recognition Test)

新物体识别是利用动物对新物体的探索倾向而建立的检测动物工作记忆学习能力的方法。实验装置为白色不透明、不反光的开口有机玻璃盒，规格为25cm×25cm的正方形底面，四周有墙壁，壁高50cm。实验分为两个阶段，训练期及测试期。

步骤1：训练期持续3天，每天训练2次，每次训练时间间隔6h，将对照组、Aβ组、MEM组及XNJ各剂量组小鼠逐一放入盒内进行训练，每只小鼠在盒内自由探索10min；

步骤2：实验第4天为测试期，第一阶段向盒内放置两个6cm×6cm×6cm的红色物体，由A’和B’表示，将两个相同的物体放置于距离壁8cm处，直线排开，将每组小鼠逐一放入盒内训练，合租小鼠在盒内自由探索10min；

步骤3：测试期第二阶段将置于盒内的两个训练期物体之一换为新物体，新物体为9cm×4cm×6cm的绿色物体，并置于原物体的位置，将小鼠背向物体面对墙壁逐一放入盒内，自由探索5min；

步骤4：利用Any-maze软件记录小鼠在盒内的活动，小鼠用鼻子在1cm范围内指向物体或触碰物体均视为小鼠的探索行为。分别计算测试期小鼠探索熟悉物体(TF)和新物体(TN)的时间，计算小鼠探索新物体的优先指数(PN)，计算公式为PN＝TN/(TF+TN)×100％。同时计算分析训练期小鼠分别探索两个相同物体及新物体的探索时间T1及T2，以及小鼠对相同物体及新物体的探索优先指数P1及P2，统计分析训练期和测试期小鼠对物体探索的总时间。

参见图2A为VD模型小鼠新物体识别行为学实验结果，在训练期阶段BPS各剂量组小鼠对新物块的探索时间较VD小鼠模型组明显增加，说明贝前列素钠可改善VD小鼠的工作记忆功能障碍，且各组小鼠运动速度没有明显差异，说明贝前列素钠灌胃对小鼠的运动功能没有明显的影响。

试验例3

Y迷宫(Y maze)

Y迷宫实验模型用来研究啮齿动物的空间识别记忆能力。自制Y迷宫，由3个等长臂(8cm*6cm*30cm)组成，每两个臂之间夹角为120度，分别记为A、B、C臂。

步骤1：将动物编号后放在迷宫的中间，任其自由探索5min，记录动物5min的行为变化，记录以下指标：①总进臂次数(the total number of entries)：动物进入迷宫臂的次数(以只脚均进入臂计为进臂一次)；②进入每个臂的次序；③分别进入3个臂的次数；

步骤2：将事件数记为总进臂次数-2，以动物依次连续进入Y迷宫全部三个臂一次记为成功一次，统计成功的次数。

参见图2B为VD模型小鼠Y迷宫行为学实验结果：BPS各剂量组小鼠对空间的探索正确率较VD小鼠模型组明显提高，且各组小鼠运动速度没有明显差异，说明贝前列素钠灌胃对小鼠的运动功能没有明显的影响。

试验例4

黑金染色

步骤1：试剂配制：black-gold II:black gold II粉末使用生理盐水稀释至0.3％，4℃避光可保存3个月；甲酚紫：去离子水加冰乙酸配成液体，然后悬浮甲酚紫粉末(浓度0.1％)，4℃保存；硫代硫酸钠：使用去离子水稀释至1％，4℃避光保存。

步骤2：预热0.3％的black-gold II和1％的硫代硫酸钠至60℃。

步骤3：脑片放入去离子水中水化2min。

步骤4：转移至预热好的black-gold II溶液中(60℃)12min。

步骤5：去离子水冲洗2次，2min/次。

步骤6：放入60℃的1％的硫代硫酸钠中3min。

步骤7：去离子水冲洗3次，2min/次。

步骤8：脑片转移至甲酚紫溶液，室温放置3min。

步骤9：去离子水冲洗3次，2min/次。

步骤10：脑片酒精梯度脱水，从85％、90％、95％至100％的酒精，每个浓度放置2min。

步骤11：将脑片转移至二甲苯2min。

步骤12：使用树脂封片，显微镜下观察，拍片。

参见图3所示黑金染色实验检测各组小鼠胼胝体髓鞘组织的染色情况，VD模型组髓鞘脱失严重，而BPS各剂量用药组较模型组明显减轻，说明贝前列素钠可以明显改善髓鞘脱失症状，进而改善白质损伤。

试验例5

组织免疫荧光染色

步骤1：根据实验需要对照小鼠脑组织图谱，选取合适的切片层面，37℃烘箱中烘干约30min后用4％多聚甲醛固定15min。

步骤2：用1×PBS漂洗3次，10min/次。

步骤3：用0.2％PBST(1×PBS+0.2％TritonX-100)孵育脑片20min以使其通透，随后1×PBS漂洗3次，10min/次。

步骤4：用2％BSA(1×PBS配置)常温封闭阻断脑组织非特异性抗原2h。

步骤5：免疫荧光一抗使用封闭液按照1:500稀释，使用的一抗为NG2(1:200，Abcam)以及CC1(1:200，calbiochem)。封闭结束后，将封闭液甩掉，使一抗浸泡脑片，置于4℃冰箱轻摇过夜。

步骤6：次日将脑片取出后，先常温复温0.5h，弃一抗后使用1×PBS漂洗3次，10min/次。

步骤7：免疫荧光二抗按照1:500比例使用封闭液配置，使用的二抗为Alexa Fluor488Donkey Anti-Mouse(Invitrogen，美国)以及Alexa Fluor 594Donkey Anti-Mouse(Invitrogen，美国)，室温避光轻摇2h。

步骤8：1×PBS漂洗3次，10min/次。

步骤9：配置DAPI溶液，孵育脑片15min。

步骤10：1×PBS漂洗3次，10min/次。

步骤11：显微镜下检查染色情况，尽量吸干脑片周围水分，使用防淬灭封片剂封片。

步骤12：使用荧光倒置显微镜(Olympus，日本)观察及拍摄图片。

参见图4所示的免疫荧光染色方法检测VD模型小鼠脑组织中少突胶质前体细胞标记物及成熟的少突胶质细胞标记物表达情况，由图4可知，在贝前列素钠灌胃组小鼠中，成熟的少突胶质细胞标记物的表达量更高，说明小鼠在贝前列素钠的作用下，使少突胶质前体细胞向成熟的少突胶质细胞分化更多，间接说明贝前列素钠可增加髓鞘，改善脑白质的损伤。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。