一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法

技术领域

本发明涉及细胞分离培养技术领域，具体涉及一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法。

背景技术

脂肪干细胞(ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞等，具有较强的增殖分化能力。

Dana-Farber癌症研究所的科学家从成人体内成功分离出一种新型的燃烧能量的脂肪细胞，这一新型脂肪细胞可能是潜在的治疗肥胖的靶细胞。这一新发现的细胞称为“米色脂肪”，形状如豌豆大小，散落在在成人体内脊柱以及锁骨附近的皮肤下。根据研究人员Dana-Farber博士表示：这一类型的脂肪的特点时候可以燃烧掉卡路里，而不是将它们存储起来。在传统意义上，“白色脂肪”细胞主要负责存储卡路里，因此米色脂肪细胞可能是治疗肥胖症和糖尿病的新作用靶细胞。研究发现，在基因方面米色脂肪细胞不用于“棕色脂肪”细胞，“棕色脂肪”细胞主要用于消耗热量产生热量。棕色脂肪细胞存在于小型哺乳动物和人类婴儿体内，在寒冷环境下棕色脂肪细胞免受寒冷的侵袭。但这项新研究发现白色脂肪专门消耗热量，能消耗掉多余的白色脂肪，防止肥胖的发生。

目前对于米色脂肪干细胞的体外分离培养的研究不多，且存在细胞存活率低的问题。

发明内容

本发明提供的一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，解决了现有技术中米色脂肪干细胞分离培养存活率低的问题。

本发明提供的一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，包括以下步骤：

S1，将离体的米色脂肪组织置于含有体积分数为5％双抗的PBS中漂洗，并剪成组织块，将组织块浸泡于细胞保护液中5-8min后取出组织块；

S2，取组织块4-5倍体积的一次消化液与组织块混合后于37℃下震荡消化-1.5-2.5h，然后加入二次消化液进行二次消化20-30min；

所述一次消化液为质量分数为0.1％的I型胶原酶，胶原酶现配现用；

所述二次消化液由质量分数为0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.25％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

所述一次消化液和所述二次消化液的用量体积比为5:1-2；

S3，将S2中的全部消化液移入15ml离心管中进行离心，去上清及脂肪，无菌PBS重悬，获得细胞悬液；

S4，过滤细胞悬液，取滤液于800-900rpm下离心5min,弃上清，获得细胞液；

S5，用含10％FBS和1％双抗的DMEM高糖培养基重悬细胞液，调整细胞密度为3000-5000个/cm

S6，贴壁的P0代细胞每2天换1次DMEM高糖培养基，当细胞达到80％融合时进行传代培养。

进一步的，S1中，所述组织块为1-2×1-2×1-2mm体积大小。

进一步的，S1中，每升所述细胞保护液由以下成分组成：7g NaH

进一步的，S3中，离心条件为转速850rpm，时长5min。

进一步的，S4中，细胞悬液通过200目细胞过滤网进行过滤。

进一步的，S5中，培养箱条件为37℃，5％CO

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明通过细胞保护液浸泡切碎的组织块，维持了细胞的活性，提高了细胞存活率；

2、本发明通过两次消化获得的犬米色脂肪干细胞的细胞密度大，生长状态良好，0.25％的鸡血清能够促进0.125％的胰蛋白酶的消化作用，促进细胞的增值，同时保证了90％以上的高存活率。

附图说明

图1为本发明实施例1的方法分离得到的犬米色脂肪干细胞的细胞形态图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明提供的一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，包括以下步骤：

S1，将离体的米色脂肪组织置于含有5％双抗的PBS中漂洗，并用手术剪剪成1-2×1-2×1-2mm体积大小的组织块，将组织块浸泡于细胞保护液中；

所述离体的米色脂肪组织按照以下方法获得：选15天龄内的幼犬麻醉后，浸入75％酒精3～5min进行消毒处理，从肩胛部位剥离米色脂肪组织；

或者，所述离体的米色脂肪组织是从15天龄内的死亡的幼犬中获得的。

每升所述细胞保护液由以下成分组成：7g NaH

S2，用4-5倍体积的一次消化液于37℃下震荡消化2h，然后加入二次消化液进行二次消化20-30min；

所述一次消化液为质量分数为0.1％的I型胶原酶，胶原酶现配现用；

所述二次消化液由质量分数为0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.25％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

所述一次消化液和所述二次消化液的用量体积比为5:1-2；

S3，将S2中的全部消化液移入15ml离心管，于800-900rpm下离心4-6min，去上清及脂肪，无菌PBS重悬，获得细胞悬液；

S4，使用200目细胞过滤网过滤细胞悬液，取滤液于800-900rpm下离心4-6min,弃上清，获得细胞液；

S5，用含10％FBS和1％双抗的DMEM高糖培养基重悬细胞液，调整细胞密度为3000-5000个/cm

S6，贴壁的P0代细胞每2天换1次DMEM高糖培养基，当细胞达到80％融合时进行传代培养。

本发明提供的犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，包括以下具体实施例：

实施例1

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，包括以下步骤：

S1，将剥离后的米色脂肪组织置于含有5％双抗的PBS中漂洗，并用手术剪剪成1×1×1mm大小的组织块，将组织块浸泡于细胞保护液中；

所述离体的米色脂肪组织按照以下方法获得：选15天龄内的幼犬麻醉后，浸入75％酒精5min进行消毒处理，从肩胛部位剥离米色脂肪组织；

每升所述细胞保护液由以下成分组成：7g NaH

S2，用5倍体积的一次消化液于37℃下震荡消化2h，然后加入二次消化液进行二次消化25min；

所述一次消化液为质量分数为0.1％的I型胶原酶，胶原酶现配现用；

所述二次消化液为质量分数由0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.25％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

所述一次消化液和所述二次消化液的用量体积比为5:1；

S3，将S3中的全部消化液移入15ml离心管，于850rpm下离心5min，去上清及脂肪，无菌PBS重悬，获得细胞悬液；

S4，使用200目细胞过滤网过滤细胞悬液，取滤液于850rpm下离心5min,弃上清，获得细胞液；

S5，用含10％FBS和1％双抗的DMEM高糖培养基重悬细胞液，调整细胞密度为3000个/cm

S6，贴壁的P0代细胞每2天换1次DMEM高糖培养基，当细胞达到80％融合时进行传代培养。

实施例2

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，包括以下步骤：

S1，将剥离后的米色脂肪组织置于含有5％双抗的PBS中漂洗，并用手术剪剪成1×2×1mm大小的组织块，将组织块浸泡于细胞保护液中；

所述离体的米色脂肪组织是从15天龄内的死亡的幼犬中获得的；

每升所述细胞保护液由以下成分组成：7g NaH

S2，用4倍体积的一次消化液于37℃下震荡消化2h，然后加入二次消化液进行二次消化30min；

所述一次消化液为质量分数为0.1％的I型胶原酶，胶原酶现配现用；

所述二次消化液为质量分数为0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.25％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

所述一次消化液和所述二次消化液的用量体积比为5:1.5；

S3，将S3中的全部消化液移入15ml离心管，于900rpm下离心4min，去上清及脂肪，无菌PBS重悬，获得细胞悬液；

S4，使用200目细胞过滤网过滤细胞悬液，取滤液于900rpm下离心4min,弃上清，获得细胞液；

S5，用含10％FBS和1％双抗的DMEM高糖培养基重悬细胞液，调整细胞密度为4000个/cm

S6，贴壁的P0代细胞每2天换1次DMEM高糖培养基，当细胞达到80％融合时进行传代培养。

实施例3

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，包括以下步骤：

S1，将剥离后的米色脂肪组织置于含有5％双抗的PBS中漂洗，并用手术剪剪成2×2×2mm大小的组织块，将组织块浸泡于细胞保护液中；

每升所述细胞保护液由以下成分组成：7g NaH

S2，用5倍体积的一次消化液于37℃下震荡消化2h，然后加入二次消化液进行二次消化20min；

所述一次消化液为质量分数为0.1％的I型胶原酶，胶原酶现配现用；

所述二次消化液为质量分数为0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.25％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

所述一次消化液和所述二次消化液的用量体积比为5:2；

S3，将S3中的全部消化液移入15ml离心管，于800rpm下离心6min，去上清及脂肪，无菌PBS重悬，获得细胞悬液；

S4，使用200目细胞过滤网过滤细胞悬液，取滤液于800rpm下离心6min,弃上清，获得细胞液；

S5，用含10％FBS和1％双抗的DMEM高糖培养基重悬细胞液，调整细胞密度为5000个/cm

S6，贴壁的P0代细胞每2天换1次DMEM高糖培养基，当细胞达到80％融合时进行传代培养。

我们对实施例1的方法获得的犬米色脂肪干细胞形态进行显微观察，结果如图1所示，分离得到的犬米色脂肪干细胞，存活率高，形态良好。

对比例1

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，与实施例基本一致，区别在于：

仅使用一次消化液进行一次消化，未添加二次消化液进行消化。

对比例2

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，与实施例基本一致，区别在于：

二次消化液由质量分数为0.05％的胰蛋白酶和质量分数为0.25％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

对比例3

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，与实施例基本一致，区别在于：

二次消化液由质量分数为0.25％的胰蛋白酶和质量分数为0.25％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

对比例4

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，与实施例基本一致，区别在于：

二次消化液由质量分数为0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.125％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

对比例5

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，与实施例基本一致，区别在于：

二次消化液由质量分数为0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.35％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

对比例6

一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法，与实施例基本一致，区别在于：

二次消化液由质量分数为0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.4％的鸡血清按照体积比1:1混合而成；

表1不同处理获得的犬米色脂肪干细胞存活率

注：75％以上的细胞分离明显，无连成片则分离程度良好；分离明显的细胞大于50％，小于75％，且细胞连成一片时，分离程度一般；分离的细胞低于50％时分离程度差。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。