一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

背景技术

间充质干细胞是一种多能的，具有自我更新能力的细胞，最早从骨髓中发现，可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉等组织。现在间充质干细胞不仅可以从骨髓中分离出来，也可从脂肪、滑膜、脐带、胎盘等组织中分离出来。与骨髓相比，脐带来源广泛，便于取材，病毒污染率低(由于胎血屏障的存在)、对供者不造成创伤以及无伦理道德制约，因此，人脐带间充质干细胞有着更加理想的发展前景。

人脐带间充质干细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞。如采用二甲基亚砜(DMSO)为保护剂。因为如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。中国发明专利申请CN201510718538.0公开了一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存液与冻存方法，其冻存液由DMSO、基础培养基和胎牛血清(FBS)(10％～50％，v/v)组成。

但由于二甲基亚砜存在一定的毒性作用，因此高含量二甲基亚砜的冷冻液增大了临床使用的风险性。另外，引入外源性动物血清可能增加临床研究与应用中外源性蛋白引起排异反应的风险，同时由于血清成分的不确定性及血清培养的不稳定性可能会影响充质干细胞正常的诱导分化功能。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液50～60份，右旋糖苷40葡萄糖注射液20～40份，氯化钠注射液1～10份，葡萄糖注射液1～10份，人血白蛋白30～50份；间充质干细胞无血清培养基1～10份。

作为一种优选的技术方案，所述复方电解质注射液与右旋糖苷40葡萄糖注射液的体积比为(1.5～2)：1。

作为一种优选的技术方案，所述右旋糖苷40葡萄糖注射液与人血白蛋白的体积比为1：(1.2～1.8)。

作为一种优选的技术方案，一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份。

本发明的第二方面提供了所述一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

作为一种优选的技术方案，还包括将配置得到的无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液置于医用冷藏箱中预冷30min以上。

作为一种优选的技术方案，所述医用冷藏箱的温度设置为2～8℃。

作为一种优选的技术方案，所述一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液制备原料按体积份计，还包括血清替代物1～5份。

作为一种优选的技术方案，所述血清替代物与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：(3～5)。

本发明的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取上述所述的无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

有益效果：

1、本发明提供的人脐带间充质干细胞注射液冻存液中不含DMSO，而是以右旋糖苷40葡萄糖注射液作为非渗透性细胞冻存保护试剂在细胞外形成高渗，使细胞脱水，从而保护细胞不受冰晶形成的损伤，避免了加入DMSO带来的不利影响。

2、本发明所述间充质干细胞无血清培养基不含动物血清或其他异源性蛋白，减少了细胞制剂被污染的危险。在无血清培养基中特定的营养因子，提高了细胞扩增效率并保持了干细胞的生物特性，增加了间充质干细胞的活率，确保了细胞的分化能力。

3、本发明冻存液冻存的细胞可直接稀释后应用于临床，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，直接应用于临床给药，更加方便。

4、本发明冻存液的成分能够更好的维持人脐带间充质干细胞的生物学功能，使人脐带间充质干细胞冻存复苏后具有高的存活率，同时保持更好的分化能力。

附图说明

图1为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞的成骨分化形态图；

图2为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞的成软骨分化形态图；

图3为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞的成脂肪分化形态图；

具体实施方式

结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本发明中提供的任何定义不一致，则以本发明中提供的术语定义为准。

在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义，“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本发明的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

为了解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液50～60份，右旋糖苷40葡萄糖注射液20～40份，氯化钠注射液1～10份，葡萄糖注射液1～10份，人血白蛋白30～50份；间充质干细胞无血清培养基1～10份。

人脐带间充质干细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞。因为如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。现有技术往往采用DMSO为保护剂，DMSO可渗入细胞内，使水分大量渗出，保护细胞不受冰晶形成的损伤，但DMSO存在一定的毒性作用，能够与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性。

本发明提供的人脐带间充质干细胞注射液冻存液中不含DMSO，而是以右旋糖苷40葡萄糖注射液作为非渗透性细胞冻存保护试剂在细胞外形成高渗，使细胞脱水，从而保护细胞不受冰晶形成的损伤，避免了加入DMSO带来的不利影响。

为了维持细胞离子渗透压、胞内胞外电解质平衡，在一些优选的实施方式，所述复方电解质注射液与右旋糖苷40葡萄糖注射液的体积比为(1.5～2)：1。

为了维持细胞胶体渗透压，所述右旋糖苷40葡萄糖注射液与人血白蛋白的体积比为1：(1.2～1.8)。

在一种优选的实施方式，所述人脐带间充质干细胞注射液冻存液制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份。

本发明提供的人脐带间充质干细胞注射液冻存液中也不含血清，由于血清成分的不确定性及血清培养的不稳定性可能会影响充质干细胞正常的诱导分化功能，特别是引入外源性血清可能增加临床研究与应用中外源性蛋白引起排异反应的风险。

本发明所述间充质干细胞无血清培养基不含动物血清或其他异源性蛋白，减少了细胞制剂被污染的危险。在无血清培养基中特定的营养因子，提高了细胞扩增效率并保持了干细胞的生物特性，增加了间充质干细胞的活率，确保了细胞的分化能力。

在一些优选的实施方式，所述人脐带间充质干细胞注射液冻存液制备原料还包括血清替代物1～5份，血清替代物成分确定，有利于确定加入的含量。在一些更优选的实施方式，所述血清替代物与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：(3～5)，为细胞冻存复融过程提供了足够的碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素等所需养分的同时，为人脐带间充质干细胞的进一步增殖分化提供了有力的条件保障。

本发明的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

当制备原料还包括血清替代物时，制备方法包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，血清替代物，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

在一些优选的实施方式，人脐带间充质干细胞冻存液的制备方法还包括将配置得到的人脐带间充质干细胞冻存液置于医用冷藏箱中预冷30min以上。

作为一种优选的技术方案，所述医用冷藏箱的温度设置为2～8℃。

本发明的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取如上述所述的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床，更加方便快捷。

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。

实施例

以下通过实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例1提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01。

实施例1的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

实施例1的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

实施例2提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份，血清替代物2份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01；

所述血清替代物购自北京达科为生物技术有限公司。

实施例2的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

实施例2的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

实施例3提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基5份，血清替代物1份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01。

所述血清替代物购自北京达科为生物技术有限公司。

实施例3的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

实施例3的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

实施例4提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液50份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01。

实施例4提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液50份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

实施例4提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液50份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

实施例5提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自友康恒业生物科技(北京)有限公司，货号为NC0103。

实施例5的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

实施例5的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

实施例6提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液25份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01。

实施例6的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

实施例6的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

对比例1提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液45份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01。

对比例1的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

对比例1的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

对比例2提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液18份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基6份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01。

对比例2的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

对比例2的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

对比例3提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白20份；间充质干细胞无血清培养基6份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01。

对比例3的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

对比例3的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

对比例4提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液，按体积份计，其制备原料包括复方电解质注射液55份，右旋糖苷40葡萄糖注射液30份，氯化钠注射液5份，葡萄糖注射液5份，人血白蛋白40份；间充质干细胞无血清培养基1份，血清替代物1份。

所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司；

所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司；

所述氯化钠注射液购自广东大冢制药有限公司；

所述葡萄糖注射液购自济民健康管理股份有限公司；

所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司；

所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-SC01。

对比例4的第二方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：

S1、按配方，将右旋糖苷40葡萄糖注射液加至500mL接收器中，然后向其中缓慢加入复方电解质注射液，氯化钠注射液，葡萄糖注射液，间充质干细胞无血清培养基，边加边摇动直至混匀；

S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白，上下颠倒混匀即得所述无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液。

对比例4的第三方面提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的人脐带间充质干细胞冻存液；

S2、将人脐带间充质干细胞重悬于冻存液中，然后灌装于冻存袋，经程序降温仪降温后存储于液氮罐。

在使用时，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，取出后直接稀释后应用于临床。

性能评价

1、人脐带间充质干细胞存活率测试

检测实施例1～6和对比例1～4中人脐带间充质干细胞冻存复苏后的细胞存活率，存活率≥90％的记为A级，存活率≥85％但＜90％的记为B级，存活率＜85％记为C级，检测结果见表1。

2、人脐带间充质干细胞分化能力测试

检测实施例1～5冻存液中的人脐带间充质干细胞的分化能力，图1为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞的成骨分化形态图；图2为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞的成软骨分化形态图；图3为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞的成脂肪分化形态图；实施例2～5的细胞分化能力与图1、2、3类似。

表1

通过上述实施例和对比例可以得知，本发明提供了一种无DMSO人脐带间充质干细胞注射液冻存液及其制备和冻存方法，冻存液中不含DMOS和血清，从而降低临床使用的风险性，避免了血清成分的不确定性及血清培养的不稳定性影响充质干细胞正常的诱导分化功能，本发明冻存液使人脐带间充质干细胞保持良好的冻存效果，人脐带间充质干细胞冻存复苏后具有高的存活率。另外，冻存液冻存的细胞可直接稀释后应用于临床，不需要离心去除冻存液的成分，冻存液可以作为辅料，直接应用于临床给药，更加方便。

最后指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。