一种基于UPLC-MS/MS的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法

技术领域

本发明属于生物分析领域，涉及一种基于UPLC-MS/MS的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法。

背景技术

心血管疾病(CVD)已成为世界范围内的主要死亡原因和严重的公共卫生挑战。根据世界卫生组织的数据，2016年因心血管疾病死亡的人数已达1790万。如果没有早期预防和干预策略，心血管疾病的患病率将持续增加。由氧化低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的沉积和逐渐积累产生的动脉粥样硬化是CVD的主要原因。然而，其潜在的发病机制尚未完全阐明，这阻碍了CVD的早期预警和有效的风险评估。探究这种复杂疾病的病理生理学基础是诊断动脉粥样硬化性脑血管病的迫切需求，而挖掘疾病相关的敏感、特异和可靠的生物标志物是一种研究途径。

代谢组学作为一种新兴的“组学”策略，被用来描述疾病或异常条件下生物系统中小分子代谢物的变化，已广泛应用于疾病候选生物标志物鉴定、病理机制研究、临床药物发现和评价等领域。近年来，许多基于代谢组学的生物标志物鉴定和病理生理机制探索已越来越多地应用于心血管疾病。几项代谢组学研究表明，血浆TMAO是心血管风险的新标志，具有促动脉粥样硬化作用，其生物合成前体如肉碱、胆碱、甜菜碱、三甲基赖氨酸和γ-丁内酯也可以是CVD的独立危险因素。此外，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)及其微生物代谢产物也显示出与心血管疾病密切相关，与其在免疫调节中的关键作用相对应。

非靶向代谢组技术和靶向代谢组技术是代谢组学研究的主要方法。非靶向代谢组可以提供生物样品更全面更丰富的代谢组分信息，存在峰对齐、峰识别误差、鉴定假阳性率高、不同仪器间结果难以重现、对于低丰度的痕量物质难检出等缺点。而靶向代谢组学也称为定量代谢组学，可以准确地定量复杂生物样品中与特定代谢途径或组分的相关代谢物，相比非靶向代谢组，灵敏度及准确度更高。因此，建立一种高灵敏度、高覆盖率的靶向代谢组学分析方法，对于准确评估内源性代谢物，尤其是关键的微量代谢物具有重要意义。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)结合多反应监测(MRM)可为潜在生物标志物的验证和定量提供更高的灵敏度和选择性。LC-MS/MS技术已被用来证明心血管疾病与某些代谢物(如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)之间的联系，但没有报告验证所用方法的准确性和重现性，但这些方法学的内容无疑对获得毋庸置疑的结果至关重要，另外相关的代谢标志物也不全面，没有已报道的方法将所有相关的标志物都涵盖进去的高通量定量方法。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述问题，本发明建立了一种灵敏可靠的液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，用于同时定量心血管疾病生物标志物，包括TMAO、肉碱、琥珀酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等20种，并验证了该方法的准确性、精密度、线性、稳定性和提取回收率等性能，从而确保该定量方法的准确性及可靠性。该方法有望提供生物标志物的精确定量结果，从而对心血管疾病的病理机制有更深入的了解。

本发明提供了一种基于UPLC-MS/MS的血浆心血管疾病相关生物标志物靶向代谢组学定量方法，所述方法包括以下步骤：

(1)标准品准备

(1.1)将标准品和内标(IS)分别溶解在第一溶剂中，分别得到标准储备液和IS储备液；

(1.2)梯度稀释所述标准储备液，梯度稀释的比例为1-1/400；

(1.3)标准品质控品选取：选取标准储备液进行无稀释、1/20稀释和1/100稀释后定义为高浓度质控品HQC、中浓度质控品MQC、低浓度质控品LQC；

(1.4)将配制好的所有标准溶液储存在4℃冰箱中。

步骤(1.1)中，所述第一溶剂为甲醇和/或水；优选地，为甲醇/水(v/v＝1/1)。

步骤(1.1)中，所述标准储备液的浓度为1mg/mL。

步骤(1.1)中，所述标准品为L-组氨酸、L-赖氨酸、琥珀酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、三甲胺-氮氧化物(TMAO)、甜菜碱、肉碱、氯化胆碱、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚丙烯酸(IA)、吲哚-3-丙酸(IPA)、泛酸、苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)、苯丙氨酸、苯基乳酸、苯基丙酮酸。

步骤(1.1)中，所述IS储备液的浓度为1mg/mL。

步骤(1.1)中，所述内标(IS)为稳定同位素标记的内标物(IS)，包含三甲胺-d9-氧化物(TMAO-d9)、3-羟基丁酸-d4钠盐(3HB-d4)、L-赖氨酸-4，4，5，5-d4盐酸盐(赖氨酸-d4)、D-苯丙氨酸-d7(苯丙氨酸-d7)、吲哚-2，4，5，6，7-d5-3-乙酸酯(IAA-d5)、L-酪氨酸-13C9，15N(酪氨酸-13C9，15N)、L-色氨酸-d5(色氨酸-D5)、苯乙酰-D5-L-谷氨酰胺(PAGln-d5)、氯化胆碱-d9(胆碱-d9)、琥珀酸-2，2，3，3-d4(琥珀酸-d4)。

步骤(1.2)中，所述梯度稀释的比例为1，1/2，1/4，1/10，1/20，1/40，1/100，1/200和1/400。

(2)样本制备

血浆样品制备：

(a)取血浆样品于EP管中，加入内标(IS)和甲醇/水溶液；然后，加入蛋白沉淀剂进行蛋白质沉淀；然后低速涡旋后，再高速低温离心；

(b)将步骤(a)离心后的上清液转移并离心浓缩；

(c)将步骤(b)浓缩后的残余物重新溶解于第二溶剂中；然后低速涡旋混匀后，高速低温离心；然后分离上清液，并用孔板过滤器进行过滤；

低浓度质控品、中浓度质控品、高浓度质控品和标准工作校准样品制备：所述低浓度质控品、中浓度质控品、高浓度质控品和标准工作校准样品按照步骤(a)-(c)进行制备。

空白对照样品制备：所述空白对照样品中用超纯水(空白基质)替代血浆，用IS标准储备液替代甲醇/水溶液，然后按照步骤(a)-(c)进行制备。

其中，所述标准工作校准样品具体指所有血浆样品混合后的QC质控样本。

步骤(a)中，所述血浆样品取量为50-150μL，优选为100μL。

步骤(a)中，所述内标取量为5-15μL，优选为10μL。

步骤(a)中，所述内标IS为稳定同位素标记的内标物(IS)，包含三甲胺-d9-氧化物(TMAO-d9)、3-羟基丁酸-d4钠盐(3HB-d4)、L-赖氨酸-4，4，5，5-d4盐酸盐(赖氨酸-d4)、D-苯丙氨酸-d7(苯丙氨酸-d7)、吲哚-2，4，5，6，7-d5-3-乙酸酯(IAA-d5)、L-酪氨酸-13C9，15N(酪氨酸-13C9，15N)、L-色氨酸-d5(色氨酸-D5)、苯乙酰-D5-L-谷氨酰胺(PAGln-d5)、氯化胆碱-d9(胆碱-d9)、琥珀酸-2，2，3，3-d4(琥珀酸-d4)。

步骤(a)中，所述甲醇/水溶液的体积为10-30μL，优选为20μL。

步骤(a)中，所述蛋白沉淀剂为乙腈和/或甲醇，优选为乙腈。

步骤(a)中，所述蛋白沉淀剂的体积为300-500μL，优选为300μL。

步骤(a)中，所述低速为转速2000-3000rpm，优选为2500rpm。

步骤(a)中，所述涡旋的时间为3-10min，优选为5min。

步骤(a)中，所述高速为转速10000-12000rpm，优选为10000rpm。

步骤(a)中，所述低温为4-10℃，优选为4℃。

步骤(b)中，所述浓缩的时间为1-3h，优选为2h。

步骤(c)中，所述第二溶剂为乙腈/水，甲醇/水，优选为乙腈/水。

步骤(c)中，所述第二溶剂的体积为100-300μL，优选为100μL。

步骤(c)中，所述高速为转速10000-12000rpm，优选为10000rpm。

步骤(c)中，所述低温为4-10℃，优选为4℃。

步骤(c)中，所述低速为转速2000-3000rpm，优选为2500rpm。

步骤(c)中，所述孔板为96孔板。

(3)UPLC-MS/MS分析

液质联用仪系统采用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统串联AB SCIEX 5500Q-Trap系统。

采用正负离子scheduled MRM模式，配备Waters HSS T3色谱柱(1.8μm,100mm×2.1mm)，柱温设置为35℃，流动相A为0.1％FA-水，流动相B为乙腈，流速为0.25mL/min，分析梯度如下：0-10min，2％B-100％B；10-11min，100％B；11.1-16min，2％B。

质谱参数如下：去簇电压DP及碰撞能CE依据每个化合物特异性优化，源参数gas1：60psi；gas2：50psi；气帘气：20psi；源温度：450℃；喷雾电压：5500/-4500V。

在一个具体实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：

标准品准备

将标准物质溶解或稀释在甲醇/水中(50/50，v/v)，分别制备标准储备溶液和IS储备溶液，最终浓度均为1.0mg/mL。根据检测到的血浆中相应代谢物的浓度(血浆中代谢物浓度范围：1/20-1/200，单位为mg/mL)，制备相应的浓度梯度的混合标准品。标准工作校准溶液在合并的标准储备溶液连续稀释后获得，稀释比为1，1/2，1/4，1/10，1/20，1/40，1/100，1/200和1/400。为了使检测点在线性范围的中间，1/20稀释点的浓度大约等于血浆中检测浓度的五倍。无稀释、1/20稀释和1/100稀释分别定义为高、中、低浓度质控品(HQC、MQC、LQC)。上机分析前，所有标准溶液储存在4℃冰箱中。

样本制备

血浆样品制备：取100μL血浆样品于1.5mL EP管中，加入10μL内标和20μL MeoH/水(50:50，v/v)溶液。此外，加入300μL乙腈沉淀蛋白质，以2500rpm的速度涡旋5min，并以10000rpm的速度离心(4℃，5min)。将上清液转移并离心浓缩2小时。将残余物重新溶解在100μL乙腈/H2O(2:98，v/v)中，再涡旋5min，然后以10000rpm(4℃，5min)离心。在液相色谱-质谱分析之前，分离上清液并用96孔板过滤器(Captiva，安捷伦科技公司，美国)过滤。

低、中、高浓度质控品(QC)和标准工作校准样品按照所述的血浆样品制备方法制备。

空白对照样品中仅用100μL超纯水(空白基质)替代100μL血浆，用20μL内标IS储备液替代20μL MeoH/水(50:50，v/v)溶液，然后按照所述的血浆样品制备方法制备。

LC-MS/MS分析

液质联用仪系统采用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统串联AB SCIEX 5500Q-Trap系统。本方法采用正负离子scheduled MRM模式，配备Waters HSS T3色谱柱(1.8μm,100mm×2.1mm)，柱温设置为35℃，流动相A为0.1％FA-水，流动相B为乙腈，流速为0.25mL/min，分析梯度如下：0-10min，2％B-100％B；10-11min，100％B；11.1-16min，2％B。质谱参数如下：去簇电压DP及碰撞能CE依据每个化合物特异性优化，源参数gas1：60psi；gas2：50psi；气帘气：20psi；源温度：450℃；喷雾电压：5500/-4500V。

所述方法，兼具高通量、高灵敏及高分离度，实现在15min内一针进样，同时对心血管疾病生物标志物进行高通量绝对定量分析。

本发明还提供了所述方法在同时定量心血管疾病生物标志物中的应用。

所述心血管疾病生物标志物包括TMAO、胆碱、肉碱、甜菜碱、苯丙氨酸、苯丙酮酸、PAGln、苯乳酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、IAA、IA、IPA、L-组氨酸、赖氨酸、泛酸、2-羟基丁酸酯、3-羟基丁酸酯、琥珀酸酯。

本发明还提供了所述上述方法在定性/定量/绝对定量/同时定量分析生物标志物中的应用。

所述生物标志物包括芳香族氨基酸分解代谢(如苯丙氨酸、色氨酸酪氨酸)、氧化三甲胺生物合成(如氧化三甲胺、胆碱、肉碱、甜菜碱)和组氨酸代谢(如组氨酸)等途径代谢的20种生物标志物，具体为TMAO、胆碱、肉碱、甜菜碱、苯丙氨酸、苯丙酮酸、PAGln、苯乳酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、IAA、IA、IPA、L-组氨酸、赖氨酸、泛酸、2-羟基丁酸酯、3-羟基丁酸酯、琥珀酸酯。

本发明的有益效果在于：本发明采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，开发并验证了一种灵敏可靠的靶向代谢组学方法，用于定量血浆中心血管疾病相关生物标志物。通过优化质谱参数和液相色谱方法，实现了一次进样对20种包括芳香族氨基酸分解代谢(如苯丙氨酸、色氨酸酪氨酸)、氧化三甲胺生物合成(如氧化三甲胺、胆碱、肉碱、甜菜碱)和组氨酸代谢(如组氨酸)等途径代谢的生物标志物进行高通量、高灵敏、高分离度的检测。结果表明，该方法线性良好，线性相关系数均大于0.99，MQC和HQC的RSD小于15％，LQC的RSD小于20％，日内精密度和日间精密度分别为1.12～14.12％和0.30～13.74％，回收率和稳定性也能满足生物样品的分析要求。这种靶向代谢组学方法已被证明具有对代谢标志物进行准确分析的强大能力，为大规模的生物标志物验证提供了有价值的信息，是阐明其潜在的心血管疾病的物质基础，为临床诊断或早期预警提供有力的支持。

附图说明

图1.通过LC-MS/MS计划的MRM方法获得的典型XIC。(A-B)通过双UPLC方法在正离子(A)和负离子(B)离子模式下获得的XIC(没有IS峰)。(C-D)XIC，是通过一维(1D)UPLC方法在正离子(C)和负离子(D)离子模式下获得的(包括IS峰)。(E)表1中20种定量代谢物的XIC显示出良好的峰形。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

实验与方法

试剂与化学品

所有试剂均为质谱级，甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)购自费希尔科技有限公司(FairLawn,NJ,USA)，甲酸(FA)购自默克(Darmstadt,Germany)，超纯水来自娃哈哈公司(中国杭州)。商业来源购买的所有化学品均为分析试剂，标准品包括L-组氨酸、L-赖氨酸、琥珀酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、三甲胺-氮氧化物(TMAO)、甜菜碱、肉碱、氯化胆碱、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚丙烯酸(IA)、吲哚-3-丙酸(IPA)、泛酸、苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)、苯丙氨酸、苯基乳酸、苯基丙酮酸和稳定同位素标记的内标物(IS)购自元业生物技术有限公司(中国上海)、百灵威科技有限公司(中国北京)和多伦多研究化学公司(加拿大多伦多)，包括三甲胺-d9-氧化物(TMAO-d9)、3-羟基丁酸-d4钠盐(3HB-d4)、L-赖氨酸-4，4，5，5-d4盐酸盐(赖氨酸-d4)、D-苯丙氨酸-d7(苯丙氨酸-d7)、吲哚-2，4，5，6，7-d5-3-乙酸酯(IAA-d5)、L-酪氨酸-13C9，15N(酪氨酸-13C9，15N)、L-色氨酸-d5(色氨酸-D5)、苯乙酰-D5-L-谷氨酰胺(PAGln-d5)、氯化胆碱-d9(胆碱-d9)、琥珀酸-2，2，3，3-d4(琥珀酸-d4)。

标准品准备

将标准物质溶解或稀释在甲醇/水中(50/50，v/v)，分别制备标准储备溶液和IS储备溶液，最终浓度为1.0mg/mL。根据检测到的血浆中相应代谢物的浓度，制备相应的浓度梯度的混合标准品。标准工作校准溶液在合并的标准储备溶液连续稀释后获得，稀释比为1，1/2，1/4，1/10，1/20，1/40，1/100，1/200和1/400。为了使检测点在线性范围的中间，1/20稀释点的浓度大约等于血浆中检测浓度的五倍。无稀释、1/20稀释和1/100稀释分别定义为高、中、低浓度质控品(HQC、MQC、LQC)。上机分析前，所有标准溶液储存在4℃冰箱中。

样本制备

取100μL血浆样品于1.5mL EP管中，加入10μL内标和20μL MeoH/水(50:50，v/v)溶液。此外，加入300μL乙腈沉淀蛋白质，以2500rpm的速度涡旋5min，并以10000rpm的速度离心(4℃，5min。将上清液转移并离心浓缩2小时。将残余物重新溶解在100μL乙腈/H2O(2:98，v/v)中，再涡旋5min，然后以10000rpm(4℃，5min)离心。在液相色谱-质谱分析之前，分离上清液并用96孔板过滤器(Captiva，安捷伦科技公司，美国)过滤。低、中、高浓度质控品(QC)和标准工作校准样品按照所述的血浆样品制备方法制备，仅用100μL超纯水(空白基质)替代100μL血浆，用20μL IS工作溶液替代20μL MeoH/水(50:50，v/v)溶液。

LC-MS/MS分析

液质联用仪系统采用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统串联AB SCIEX 5500Q-Trap系统。本方法采用正负离子scheduled MRM模式，配备Waters HSS T3色谱柱(1.8μm,100mm×2.1mm)，柱温设置为35℃，流动相A为0.1％FA-水，流动相B为乙腈，流速为0.25mL/min，分析梯度如下：0-10min，2％B-100％B；10-11min，100％B；11.1-16min，2％B。质谱参数如下：去簇电压DP及碰撞能CE依据每个化合物特异性优化，源参数gas1：60psi；gas2：50psi；气帘气：20psi；源温度：450℃；喷雾电压：5500/-4500V。

方法学验证

根据美国食品和药物管理局(FDA)的“分析方法和方法验证”和“生物分析方法验证”指南，对该方法的线性、选择性、准确度、精密度、稳定性和回收率进行了如下评估：

(1)线性

采用加权(1/x)线性回归分析方法，对9个校准点建立校准标准样品的校准曲线。R2值是决定系数，R2>0.99被认为是可以接受的。LOD和LOQ分别以信噪比(S/N)的3倍和10倍计算。

(2)准确性和精确性

通过分析QC样品在3个浓度水平(LQC、MQC和HQC)下的日内和日间的准确度和精密度，每个浓度3个重复。混合样QCs也被用来评估精度。

(3)回收率

通过比较预处理前后各标准品在3个浓度水平下的峰面积比来计算。

(4)稳定性

对血浆QC样品进行-80℃至室温三次冻融循环，评估冻融稳定性；血浆QC样品在4℃的自动进样器中保存12h、24h、48h和72h，研究其稳定性。

(5)数据分析

数据处理采用MultiQuant(version 3.0.3,AB SCIEX,Concord,ON,Canada)进行定量分析和方法验证分析。标准曲线采用内标法，通过标准品的峰面积与其对应的IS的面积比进行绘制。统计分析采用SPSS统计软件(version 22.0,IBM,Armonk,NY,USA)

结果与讨论

LC-MS/MS分析方法开发

建立UPLC-MS/MS定量分析方法，鉴定血浆中20种代谢物(见表1)。这些代谢物是通过实验发现和文献挖掘筛选出的CVD的生物标志物，涉及的途径包括芳香氨基酸分解代谢、TMAO生物合成、赖氨酸代谢、组氨酸代谢等，部分被证实与肠道菌群紊乱有关。

最佳的MRM离子对是串联质谱获取有效可靠定量数据的必要条件。选择具有高灵敏度和高选择性的母离子和产物离子对作为最终的MRM离子对进行定量。进一步优化了单个MRM离子对的DP和CE，以提高离子化效率达到最大灵敏度。20种代谢物的MRM离子对、DP和CE列于表1。除此之外，与传统的MRM模式相比，scheduleMRM模式的优点是，每个MRM离子对可以扫描在一个预期的保留时间(tR)窗口，可以提高选择性和敏感性，获得更好的信噪比(S/N)产生一个更精确的定量结果，特别是同时量化大量的代谢物。因此，本发明建立了包含MRM离子对、DP、CE、关联tR的scheduleMRM方法(表1)，MRM检测窗口为150s，目标扫描时间为0.8s。

通过优化UPLC的柱型、流动相梯度和流速等分析条件，获得了较好的分析效果。选用HSS T3色谱柱不仅具有较好的柱效和保留能力，而且对亲水性高极性化合物的分离效果优于其他色谱柱。本发明比较了几种不同的流动相条件，包括不同梯度的一维UPLC方法和二维UPLC方法。二维UPLC方法可以同时高效分离强极性和弱极性代谢物，本发明在之前的报道中已经阐述过。然而，双柱的使用延长了分析时间，并没有明显改善相同保留行为的代谢物分离(图1A-1B)。相比之下，选择16分钟的一维色谱流动相梯度(包括5分钟的柱再平衡)，因为它缩短了运行时间，同时确保更好的分辨率。UPLC-MS/MS正负离子模式分析的典型总离子色谱(TICs)显示，代谢物保留时间分布均匀(图1C-D)。提取的20种代谢物在正离子和负离子模式下的离子色谱(XICs)呈现出良好的峰形(图1E)。结果表明，所建立的方法能较好地分离血浆样品，灵敏度高。

表1.用于定量CVD的生物标志物的LC-MS/MS scheduleMRM参数

M代表与心血管疾病相关的代谢物；“IS”代表内部标准。在正离子和负离子模式下收集了一些内标进行校准。

缩写：三甲胺-N-氧化物(TMAO)；苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)；吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚丙烯酸(IA)，吲哚3-丙酸(IPA)。

标准曲线

表2显示了所有分析物的线性相关方程，线性相关系数(R2)，线性范围，定量极限(LOQ)和检测极限(LOD)。表2中的所有校准曲线均可接受，R2≥0.99。需要注意的是，消除了某些分析物的过拟合浓度点，例如酪氨酸，吲哚丙烯酸(IAA)和苯乳酸。校准标准品的线性范围为0.0025～1.0μg/mL至0.4～160μg/mL。获得的分析物的最低定量限低于样品的最低浓度，范围为0.09～139.86ng/mL，分析物的最低定量限为0.022ng/mL～41.96ng/mL。

这些表明该方法具有很高的灵敏度。

表2. 20种代谢物的线性相关方程，R2，线性范围，LOQ和LOD

缩写：三甲胺-N-氧化物(TMAO)；苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)；吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚丙烯酸(IA)，吲哚3-丙酸(IPA)。

准确度及精密度

准确度用于评估测量值和真实值之间的接近程度，这是通过使用校准曲线将计算浓度与实际浓度进行比较来确定的。精密度，包括日内和日间精密度，通过单次测试运行中每日测量结果和三天结果的相对标准偏差(RSD)进行评估。表3总结了质控样品中20种分析物的日间和日间准确度和精密度结果。MQC和HQC的准确率分别为90.84～104.17％和90.37～106.82％，绝对误差小于15％，LQC的准确率为80.86～110.87，绝对误差小于20％。LQC、MQC、HQC和血浆质控的日内和日间精密度分别为1.12～14.12％和0.30～13.74％，均小于15％。综上所述，准确度和精密度试验均符合FDA的要求。

表3. 20种分析物的准确度及精密度

缩写：三甲胺-N-氧化物(TMAO)；苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)；吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚丙烯酸(IA)，吲哚3-丙酸(IPA)。

提取回收率

提取回收率也是方法验证的一个重要参数。在本发明的实验中，通过计算LQC、MQC和HQC三个重复样品预处理前后质控品加标峰面积比来评估回收率。如表4所示，所有分析物的回收率在LQC为80.05～107.33％，MQC为94.98～118.09％，HQC为90.05～113.56％，相对标准偏差均小于15％。上述回收结果表明该方法的回收率可接受。

表4. 20种化合物提取回收率

缩写：三甲胺-N-氧化物(TMAO)；苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)；吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚丙烯酸(IA)，吲哚3-丙酸(IPA)。

稳定性

为了评估反复冻融循环和在4℃自动进样器中长期保存对血浆代谢物含量的影响，对3种冻融循环稳定性和自动进样器稳定性进行了评价。用标准曲线计算代谢物浓度，并与初始状态比较，得出稳定性研究结果。由表5和表6可知，所有样品的准确度为新制样品的85.13～114.86％，RSD<15％，在所有测试条件下均具有较好的稳定性。因此，该方法的稳定性可以满足生物样品的分析要求。

表5.三种冻融循环稳定性的结果

缩写：三甲胺-N-氧化物(TMAO)；苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)；吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚丙烯酸(IA)，吲哚3-丙酸(IPA)

表6.保存12h、24h、48h、72h后自动进样器稳定性结果

缩写：三甲胺-N-氧化物(TMAO)；苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)；吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚丙烯酸(IA)，吲哚3-丙酸(IPA)

结论

本发明开发了一种灵敏可靠的UPLC-MS/MS scheduleMRM方法，用于同时定量心血管疾病实验或文献证实所有与心血管疾病有关的生物标志物。方法验证结果证明，该方法具有良好的准确度、精密度和灵敏度，以及可接受的稳定性和提取回收率。尽管分析物的性质差异很大，但所有分析物都显示出良好的分辨率和令人满意的峰形。在16min内实现一针进样，大大提高了大批量分析检测中目标定量分析的效率。此外，只需修改相应的MRM离子对、DPs和CEs，就可以同时定量更多的代谢物。该方法不仅有助于发现可靠的心血管疾病生物标志物，而且为阐明其潜在的物质基础提供有价值的信息，进一步为心血管疾病的早期诊断和预后提供相应的支持。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。