一种原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的处理和培养方法

技术领域

本发明属于干细胞与再生医学领域，具体涉及一种原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的处理和培养方法。

背景技术

胎盘壁蜕膜间充质干细胞(Placenta Decidua Parietalis,PCDP)壁蜕膜作为母体组成部分之一，从中分离得到的壁蜕膜间充质干细胞可以用于母亲自身细胞的移植或冻存，具有针对性。蜕膜间充质干细胞在表型、增殖及细胞因子表达等方面与其他来源的间充质干细胞存在差别，具有独特的性质，如低免疫原性等，近年来已经引起众多科学家关注，蜕膜间充质干细胞子宫内膜重建、盆腔脏器脱垂、膀胱组织修复等组织修复具有广阔的应用前景。胎盘来源间充质干细胞与骨髓间充质干细胞相比，具有来源充足、免疫原性低、病毒污染率较低，且无社会伦理争议等方面的优点，使其具有更好的临床应用前景，较易获取。

胎盘在离开人体后，通常由医护人员通过采集装置存放，并由运输人员运输至实验室进行代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的处理和培养，且为了获取高质量的样本，需要在采集过程中避免接触污染和交叉污染，同时需要运输全程保持低温。目前现有的采集、收纳装置大多数结构复杂、操作繁琐、缺乏专业性、容易损坏，发生生物危害等风险，同时原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的细胞纯度低、培养时间长、活性低、数量少、对细胞损伤大现象，传统的原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞处理和培养方法在对采集后的胎盘的运输及分离过程中无任何降温及保温措施，不能保证胎盘的生物活性，将不利于原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的分离；前期需要由孕妇分娩胎儿所产生的胎盘，由于孕妇产道可能有细菌感染导致制备过程中出现污染，且运输过程容易造成污染，细胞难提取，培养时间长、细胞数量少。目前仍缺乏一种能提高原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的纯度、数量、活性和培养时间的处理和培养方法。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够提高制备提高原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的纯度、数量、活性和培养时间，且操作方便的针对原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的处理和培养方法。

为此，本发明提供了以下技术方案。

一种原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的处理和培养方法，其包括以下步骤：

S1、将离体的胎盘组织边缘连接的绒毛膜组织及附着于上面的组织去除，用组织保护液清洗掉血液和血凝块；

S2、刮取1.3g壁蜕膜组织，清洗后剪碎；

S3、按壁蜕膜组织与消化酶的体积比为2:5的比例加入消化酶，在37℃、150rpm的条件下震荡消化至少1小时，再按消化酶与0.05％胰酶的体积比为1:1的比例加入0.05％胰酶，在37℃、在37℃、150rpm的条件下震荡消化15min；

S4、用含有双抗的完全培养基终止消化，将消化后的组织液通过100μm滤器过滤出组织和胎盘壁蜕膜间充质干细胞两部分，组织留在滤器上面，向下层的胎盘壁蜕膜间充质干细胞加入组织保护液清洗并稀释至100ml，得到稀释后的细胞培养液；

S5、向所述稀释后的细胞培养液中加入红细胞裂解液，所述稀释后的细胞培养液与红细胞裂解液的体积比为4:1，混匀后4℃保存1min，在1300rpm、6min条件下离心，弃上清；

S6、向离心沉淀物加入组织保护液清洗并稀释至100ml，加入1％羟乙基淀粉和谷氨酰胺，稀释后的细胞培养液与1％羟乙基淀粉的体积比为4:1，1％羟乙基淀粉与谷氨酰胺的体积比为10:1，混匀后沉降60分钟，去除底部红细胞，在1300rpm、6min条件下离心；

S7、在2个T25细胞培养瓶中各加入0.5ml上述步骤S4中的滤器上的组织；

S8、移弃步骤S6中离心后的上清，用6ml含有双抗的完全培养基重悬细胞沉淀得细胞悬液，将细胞悬液接种至步骤S7中的2个T25细胞培养瓶中，进行培养；

S9、在3天后换液，全部移除培养瓶中的消化组织和培养基，并用0.9％氯化钠溶液清洗后加入完全培养基继续培养；

S10、在3天后，细胞融合率达到90％以上，对原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞进行传代培养。

优选地，所述消化酶为I型胶原酶和DNA酶质量比为10:1的混合物。

优选地，所述胎盘组织是人胎盘组织。

优选地，所述完全培养基是DMEM培养基和胎牛血清体积比为9:1的混合物。

优选地，所述组织保护液为含有1％v/v双抗的生理盐水。

通过羟乙基淀粉沉降可以分离红细胞，减少细胞沉淀中红细胞过多，谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源，可以稳定细胞膜和蛋白质结构，而且参与蛋白质的合成和核酸代谢；通过添加红细胞裂解液可以去除红细胞，利于去除细胞悬液中留存的红细胞，提高制备原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的纯度；所述消化酶与组织配比为2:5是通过实验得出的最佳配比方案，提高制备原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的数量；在所述换液操作中，通过去除培养瓶中的组织，促进细胞增殖，减少原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞培养的时间；所述消化酶为重量比10:1的Ⅰ型胶原酶：DNA酶的混合物，提高了制备原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的活率和数量；在所述种瓶操作中，在2个T25细胞培养瓶中各加入0.5ml滤器上的组织，营造细胞生长环境，减少原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞培养的时间；采用0.05％胰酶对组织进行消化，提高制备原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的数量。

本发明的关键点是羟乙基淀粉、红细胞裂解液、消化酶配比、换液操作、培养过程中加入消化组织，不同的消化酶配比、羟乙基淀粉沉降、红细胞裂解液对制备得到的原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞数量及活性影响显著。现有原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞制备技术都是直接采用Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶消化分离，本发明是通过多次实验后得到的最理想的羟乙基淀粉比例、红细胞裂解液比例、消化酶配比、换液操作、培养过程中加入消化组织等。

本发明的方法操作方便，能够有效提高原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的纯度、存活率、数量和活性，并缩短培养时间。

附图说明

图1是根据本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的流式抗体检测结果。

图2是本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的成脂分化图。

图3是本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的成软骨分化图。

图4是本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的成骨分化图。

图5是本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的STR鉴定检测结果。

图6示出了原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞P0-P9代生长状况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

值得注意的是，本发明提供的羊水间充质干细胞分化为神经干细胞的方法并不用于疾病诊断目的和治疗目的。

如未特别指出，本发明所使用的试剂均为现有试剂，可通过商业渠道获得。出于简要目的，部分技术操作并未具体描述细节，但应理解，这些操作都在本领域技术人员所熟知的范围内，其可以根据本说明书中所记载的内容予以实现。

根据本发明的原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的处理和培养方法的具体步骤如下：

一、采集胎盘和母血样本

1、经伦理道德委员会许可及采集对象同意，在无菌环境下采集孕妇分娩婴儿的胎盘和孕妇的母血，密封于无菌运输瓶中冷藏运输(4-8℃)，运输瓶中放置HDR型科技冰维持温度；

2、对胎盘和母血样本进行检测，检测项目为HIV1型病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、高危型人乳头瘤病毒DNA、细菌和真菌等；

二、原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的处理和培养

1、实验人员在无菌环境下进行操作，完整分离胎盘组织边缘连接的绒毛膜组织及附着于上面的组织，用组织保护液(含有1％v/v青霉素-链霉素溶液的生理盐水，青霉素-链霉素溶液(100X)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml)清洗掉血液和血凝块；

2、用手术器械刮取1.3g壁蜕膜组织，清洗后收集于50ml离心管中，并将其剪碎；

3、按壁蜕膜组织与消化酶的体积比为2:5的比例加入消化酶(消化酶为I型胶原酶和DNA酶质量比为10:1的混合物)，在37℃、150rpm的条件下震荡消化至少1(至多1.5)小时，再按消化酶与0.05％(质量体积浓度)胰酶的体积比为1:1的比例加入0.05％(质量体积浓度)胰酶，在37℃、150rpm的条件下震荡消化15min；

4、用完全培养基(Gibco的Dulbecco's Modified Eagle Medium和胎牛血清(FBS)以9：1体积比配制)(含1％v/v双抗(含有青霉素(10000IU)和链霉素(10mg/ml)在100倍的工作浓度的混合液))终止消化，将消化后的组织液通过100μm滤器过滤出组织和胎盘壁蜕膜间充质干细胞两部分，组织留在滤器上面，向下层的胎盘壁蜕膜间充质干细胞加入组织保护液清洗并稀释至100ml，得到稀释后的细胞培养液；

5、向稀释后的细胞培养液加入红细胞裂解液(Sigma)，该稀释后的细胞培养液与红细胞裂解液的体积比为4:1，混匀后4℃保存1min(由于在使用过程中红细胞裂解液会对其他细胞产生影响，采用4℃保存1min有利于确保细胞活性)，把离心管放入离心机，离心参数为1300rpm、6min，弃上清；

6、向离心沉淀物加入组织保护液清洗并稀释至100ml，加入1％羟乙基淀粉(羟乙基淀粉质量浓度为1％的水溶液)和谷氨酰胺(能够进一步保证细胞活性)，稀释后的细胞培养液与1％羟乙基淀粉的体积比为4:1，1％羟乙基淀粉与谷氨酰胺的体积比为10:1，混匀后沉降60分钟，去除底部红细胞，把离心管放入离心机中离心，离心参数为1300rpm、6min；

7、在2个T25细胞培养瓶中各加入0.5ml上述步骤4中滤器上的组织；

8、移弃步骤6离心后的上清，用6ml完全培养基(Gibco的Dulbecco's ModifiedEagle Medium和胎牛血清(FBS)以9：1体积比配制)(含1％v/v双抗(含有青霉素(10000IU)和链霉素(10mg/ml)在100倍的工作浓度的混合液))重悬细胞沉淀得细胞悬液，将细胞悬液接种至步骤7的2个T25细胞培养瓶中，放进培养箱进行培养；

9、在3天后换液，全部去掉培养瓶中的消化组织和培养液，并用0.9％(质量浓度)氯化钠溶液清洗后加入完全培养基(Gibco的Dulbecco's Modified Eagle Medium和胎牛血清(FBS)以9：1体积比配制)；

10、在3天后，细胞融合率达到90％以上，对原代(P0代)胎盘壁蜕膜间充质干细胞进行传代。图6示出了原代胎盘壁蜕膜间充质干细胞P0-P9代生长状况。由图6可见，各代间充质干细胞形态、生长状况良好。

三、细胞性能检测

1、取1ml细胞悬液计算细胞数量和细胞活率；

2、取部分细胞进行细菌、真菌和病毒源微生物检测、流式抗体检测、细胞数量和活率检测、多向分化检测、细胞STR的鉴定检测、细胞增殖能力检测。

四、检测结果

经检测之后，采用本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的各项指标如以下表1所示(三个平行检测样本)。

表1：本发明的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞性能

通过传统方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞性能如以下表2所示(三个平行检测样本)。

表2：本发明的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞性能

传统方法的具体步骤如下：

1、从合法采集的离体的胎盘组织中直接分离出1.3g壁蜕膜组织；

2、加入2ml I型胶原酶消化1h；

3、过滤后直接取细胞沉淀按常规技术手册指导步骤进行培养。

可见，与传统方法相比，本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的培养时间更短，得到的细胞数量更多，细胞存活率更高，间充质干细胞的纯度更高。

本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的流式抗体检测结果如表3和图1所示。

表3：本发明的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的流式抗体检测结果

该流式抗体检测结果表明：该细胞符合间充质干细胞特征。

图2至图4是本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的多向分化图，其中，图2是成脂分化图，图3是成软骨分化图，图4是成骨分化图。结果显示，本发明得到的间充质干细胞能够通过现有分化技术手段被成功分化为多种不同的细胞。

经细菌、真菌和病毒源微生物检测，本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞中的细菌、真菌和病毒源微生物含量均为0。

本发明的处理和培养方法得到的P0代胎盘壁蜕膜间充质干细胞的STR鉴定检测结果如图5所示，该鉴定结果表明：本发明方法可得到纯净的胎盘壁蜕膜间充质干细胞，不含胎儿DNA污染的母源间充质干细胞。