一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌。

背景技术

乙醇酸(glycolate,glycolic acid)又称为羟基乙酸(hydroxyacetic acid)、甘醇酸，分子式为C

尽管化学法是合成乙醇酸的常用方法，但化学法对环境的污染严重，过程中使用氰化物等危险品降低了生产过程的安全性。目前发展的生物法(微生物酶催化法和全生物合成法)合成乙醇酸，其生产过程安全，且对环境友好，是大宗化学品发展的趋势。He等成功地从土壤中分离出一种新产腈水解酶的产碱杆菌(Alcaligenes.sp.ECU0401)。经过优化培养条件和反应条件后，乙醇腈可以通过生长细胞、静置细胞和固定化细胞有效地水解为乙醇酸，经过29次循环转化，乙醇酸的产量为1042g/g CDW(He et al.,2018,AppliedBiochem Biotech 136(5):1428-1440)。一种土壤分离红酵母菌3Pr-126，在优化pH、溶氧等条件后，能产生乙醇酸105g/L。以上这两种使用的是微生物酶催化法，都需要额外添加乙醇腈或丙二醇，相对成本较高，不能满足工业生产的需求。

全生物合成法，利用的是乙醛酸循环途径，通过乙醛酸途径产生的乙醛酸，在乙醛酸还原酶的作用下生成乙醇酸。以乙醇和木糖为底物，利用乙醛酸途径，改造后的酵母菌株分批发酵75h能产6.7g/L乙醇酸(Koivistoinen et al.,2013,Microbial CellFactories,12,82)，最大生产速率为0.1g/gCDW/h；以五碳糖(木糖、L-阿拉伯糖)为底物，利用乙醛酸途径，改造后的菌株GA-10，分批发酵产40g/L，木糖产乙醇酸转化率为0.63g/g(Brian Pereira et al.,2015,Metabolic Engineering,34(6):80-87)；以葡萄糖为底物，利用乙醛酸途径，改造后的大肠杆菌，5L分批发酵，产65.5g/L乙醇酸，糖酸转化率为0.79g/g(Deng et al.,2018,Metabolic Engineering,46,28-34)。

中国科学院天津工业生物技术研究所张学礼团队构建得到利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌NZ-Gly303，将该菌株进行5L发酵，发酵70h，乙醇酸产量达到73.3g/L，生产速率达到1.04g/L/h，乙酸到乙醛酸的转化率为1.08g/g，葡萄糖到乙醛酸的转化率为2.58g/g(参见“Yong Yu,et al.Construction of a carbon-conservingpathway for glycolate production by synergetic utilization of acetate andglucose in Escherichia coli.Metabolic Engineering 61(2020)152–159”)。如果要更好的应用于工业生产，其糖酸转化率和产量都需要进一步提高。

发明内容

本发明的目的是提供一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌及其应用。

第一方面，本发明要求保护一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌。

本发明要求保护的利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌，具体为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ-G304，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.20414。该菌株是从重组大肠杆菌NZ-Gly303出发，通过进化代谢得到的。

第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明所要求保护的菌剂的其活性成分为前文所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ-G304。

所述菌剂中除了活性成分还可含有本领域常用的辅料或载体。

第三方面，本发明要求保护前文所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ-G304或前文所述的菌剂在生产乙醇酸中的应用。

第四方面，本发明要求保护一种生产乙醇酸的方法。

本发明所要求保护的生产乙醇酸的方法，可包括如下步骤：对前文所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ-G304进行发酵培养，从而获得乙醇酸。

在第三和第四方面中，所述生产乙醇酸为利用葡萄糖和乙酸作为双碳源生产乙醇酸。

进一步地，在所述生产乙醇酸的过程中，乙酸在发酵培养基中可以以乙酸盐(如乙酸钠)的形式存在。

更进一步地，进行所述发酵培养时使用的发酵培养基可为含20-30g/L(如28g/L)葡萄糖和3-6g/L(如5.2g/L)乙酸钠的无机盐培养基AM1。

在本发明的具体实施方式中，所述发酵培养基的配方如下：每1L中含有葡萄糖28g/L、5.2g/L乙酸钠、2g/L酵母提取物、NH

在进行所述发酵培养时，使用615g/L乙酸钠做补料，乙酸为中和剂。发酵条件为起始OD550nm为0.1，37℃，空气流速3min/L，溶氧25％，转速200-500rpm。

实验证明，重组大肠杆菌NZ-Gly303进行5L发酵，发酵70h，乙醇酸产量达到73.3g/L，生产速率达到1.04g/L/h，乙酸到乙醛酸的转化率为1.08g/g，葡萄糖到乙醛酸的转化率为2.58g/g。而重组大肠杆菌NZ-G304进行5L发酵，发酵60h，乙醇酸产量达到84g/L，生产速率达到1.06g/L/h，乙酸到乙醇酸的转化率为1.06g/g，葡萄糖到乙醇酸的转化率为3.05g/g。可见从重组大肠杆菌NZ-Gly303出发，通过进化代谢得到的重组大肠杆菌NZ-G304，其产乙醇酸的能力大幅度提高，同时发酵时长也有所缩短。本发明对于从乙酸到酰基CoA为原料生产大宗化学品，利用葡萄糖作为还原力的供给，用于工业生产乙醇酸具有重要意义。

保藏说明

菌株名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

参椐的生物材料(株)：NZ-G304

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年7月22日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20414

附图说明

图1为通过进化代谢获得重组大肠杆菌NZ-G304。在含有30-80g/L乙醇酸(钠)的培养基中代谢进化，提高菌株对乙醇酸钠的耐受性。

图2为重组大肠杆菌NZ-G304 5L发酵罐发酵。单位g/L表示每升发酵液中目标物的含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的大肠杆菌菌株NZ-Gly303记载于“Yong Yu,etal.Construction of a carbon-conserving pathway for glycolate production bysynergetic utilization of acetate and glucose in Escherichia coli.MetabolicEngineering 61(2020)152–159”一文，公众可从申请人处获得该菌株，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。该菌株的基因型如表1所示。

表1本发明中所用的菌株

实施例1、进化代谢获得重组大肠杆菌NZ-G304

从重组大肠杆菌NZ-Gly303出发，通过进化代谢提高对乙醇酸的耐受力，从而提高菌株产乙醇酸的能力。

NBS种子培养基(1L)：葡萄糖5g、乙酸钠10g、(NH4)

驯化培养基：同上种子培养基，并添加30-80g/L的乙醇酸钠。

驯化培养：将LB平板上的单克隆转接于2ml NBS种子培养液，37℃、250rpm培养12-24h。按1％(体积比)的接种量转接于20ml NBS含乙醇酸钠的驯化培养基中，乙醇酸钠在驯化过程中依次提高，从30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L到80g/L。

经过52代转接培养(图1)，最后获得在80g/L乙醇酸钠培养基中生长良好的菌株NZ-G304。菌株NZ-G304已经与2020年7月22日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.20414，建议的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

实施例2、重组大肠杆菌NZ-Gly303和NZ-G304的摇瓶发酵

对重组大肠杆菌NZ-Gly303和NZ-G304分别进行发酵产乙醇酸评价。

NBS种子和发酵培养基(1L)：葡萄糖5g、乙酸钠10g、(NH4)

摇瓶发酵：将LB平板上的单克隆转接于2ml NBS种子培养液，37℃、250rpm培养12-24h。按1％(体积比)的接种量转接于20ml NBS发酵培养基中，37℃、250r/min培养24h。

结果分析：取样离心，上清用HPLC分析乙醇酸产量。NZ-Gly303和NZ-G304的乙醇酸产量分别为7.20g/L和8.11g/L，NZ-G304产量提高了12.5％，其乙酸到乙醇酸的转化率略有提高，为0.94mol/mol，葡萄糖到乙醇酸的转化率也略有提高，为5.48mol/mol(表2)。

表2重组大肠杆菌NZ-Gly303和NZ-G304产乙醇酸摇瓶发酵

实施例3、重组大肠杆菌NZ-Gly303的5L发酵罐发酵

种子培养基：同实施例2。

发酵培养基：葡萄糖28g/L、5.2g/L乙酸钠、2g/L酵母提取物、NH

使用615g/L乙酸钠做补料，乙酸为中和剂。发酵条件为起始OD550nm为0.1，37℃，空气流速3min/L，溶氧25％，转速200-500rpm。

重组大肠杆菌NZ-Gly303进行5L发酵，发酵结果显示，发酵70h，乙醇酸产量达到73.3g/L，生产速率达到1.04g/L/h，乙酸到乙醛酸的转化率为1.08g/g，葡萄糖到乙醛酸的转化率为2.58g/g(见表3)。

实施例4、重组大肠杆菌NZ-G304的5L发酵罐发酵

种子培养基：同实施例2。

发酵培养基：同实施例3。

使用615g/L乙酸钠做补料，乙酸为中和剂。发酵条件为起始OD550nm为0.1，37℃，空气流速3min/L，溶氧25％，转速200-500rpm。

重组大肠杆菌NZ-G304进行5L发酵，发酵结果见图2。发酵60h，乙醇酸产量达到84g/L，生产速率达到1.06g/L/h，乙酸到乙醇酸的转化率为1.06g/g，葡萄糖到乙醇酸的转化率为3.05g/g。相比于NZ-Gly303，NZ-G304的产量提高13％(见表3)。

表3重组大肠杆菌NZ-Gly303和NZ-G304产乙醇酸5L发酵

综合以上实施例2-4所示的结果，可见从重组大肠杆菌NZ-Gly303出发，通过进化代谢得到的重组大肠杆菌NZ-G304，其产乙醇酸的能力大幅度提高，同时发酵时长也有所缩短。无疑这对于大规模工业生产乙醇酸具有重要意义。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。