一种乏氧响应的基因编辑方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乏氧响应的基因编辑方法。

背景技术

簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白9(Cas9)技术是当前最为热门的一种基因编辑工具，在基因编辑和疾病治疗中起着至关重要的作用。到目前为止，人们已经开发了各种方法，以递送CRISPR-Cas9系统。然而，如何高效、可控地靶向递送CRISPR-Cas9系统仍存在很多挑战。乏氧是大多数实体肿瘤微环境中的普遍特征，考虑到肿瘤的乏氧微环境和偶氮键的乏氧响应性，使得解决CRISPR-Cas9技术有效肿瘤靶向和可控递送问题成为可能。另一方面，光热疗法(PTT)利用光热材料产生的热能来杀伤癌细胞，然而，由于激光诱导的非特异性热能的扩散，高温对周围正常组织造成热损伤。肿瘤细胞的耐热性主要是由热激蛋白90(HSP90)引起的，而Hsp90α是Hsp90的主要亚型。通过以Hsp90α为靶点的CRISPR-Cas9系统和乏氧响应性方法构建的平台，为低温下光热疗法效率的最大化提供了一条有前途的方法。

发明内容

为构建以Hsp90α为靶点的CRISPR-Cas9系统和乏氧响应性平台，本发明将对羧基偶氮苯(p-AZO)一端连接到巯基-聚乙二醇-氨基(SH-PEG-NH

在肿瘤乏氧微环境中，N-N双键被破坏，Cas9/sgRNA复合物可控释放，用于在肿瘤部位特异性地敲除Hsp90α基因。利用金纳米棒的光热转换作用，应用近红外(NIR)光(808nm)对HSP90α基因敲除的肿瘤细胞进行温和热疗。

为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种乏氧响应的基因编辑方法，包括如下步骤：将乏氧响应性纳米复合材料APACP与含目标基因的细胞进行混合，目标基因序列为:5′-ATTCCCTGTCACCGCGTCAC-3′，对羧基偶氮苯在肿瘤乏氧微环境中发生特异性还原，导致偶氮键断裂，在乏氧条件下，实现共价连接在乏氧响应性纳米复合材料APACP上的Cas9/sgRNA精确可控释放，并基于CRISPR-Cas9系统实现了有效的基因编辑，在红外光照射下实现对肿瘤部位治疗，所述目标基因的具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的目标基因包括EGFP基因和HSP90α基因，细胞为A549肺癌细胞，小鼠为BALB/c裸鼠，在肿瘤乏氧微环境中，N-N双键被破坏，Cas9/sgRNA复合物可控释放，用于在肿瘤部位特异性地敲除Hsp90α基因。

进一步地，所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP中，采用的红外光波长为808nm，光照时长为20min。

更进一步地，所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP由Cas9/sgRNA和经对羧基偶氮苯p-AZO修饰的AuNRs组成，并在静电吸附的作用下，在最外层包裹上带正电的聚乙烯亚胺PEI，制得乏氧响应性纳米复合材料APACP。

进一步地，在室温下，在Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的pH为7.4，以1:3的Cas9：sgRNA质量比将Cas9蛋白与sgRNA孵育10分钟，以形成Cas9/sgRNA复合物。

进一步地，通过种子生长法制备金纳米棒，通过巯基键将SH-PEG-NH

更进一步地，采用CTAB介导的种子生长法制备金纳米棒AuNR5×10

进一步地，所述的Cas9蛋白与sgRNA的质量比为1:3，所述的Tris-HCl缓冲液的pH为7.4；所述的聚乙烯亚胺PEI与加入sgRNA质量比为3:1；所述的聚乙烯亚胺的分子量为10000。

本发明所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP在治疗抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述的肿瘤细胞为A549，当把该复合体递送进细胞或者小鼠，实现Cas9对HSP90α基因的精准递送和敲除，同时通过AuNRs将近红外光转化为细胞内的热能，以实现对HSP90α基因敲除的靶向肿瘤细胞的低温热疗。HSP90是一种使细胞适应热环境的热应激蛋白，而HSP90α是其主要亚型。

有益效果：本发明根据AuNRs的光热转化特性，在Cas9/sgHSP90敲除肿瘤组织中的靶基因后，本发明用光热疗法治疗肿瘤。利用金纳米棒的光热转换作用，应用近红外(NIR)光(808nm)对HSP90α基因敲除的肿瘤细胞进行温和热疗。本发明的细胞和动物实验已证实该处理方法有效且优于AuNRs光热处理，也证明了APACP纳米颗粒在肿瘤治疗中的广泛潜力。

附图说明

图1为本发明所述方法的反应原理图。(A)是APACP纳米复合物的制备方法；(B)乏氧条件下，Cas9特异性释放过程。

图2为本发明纳米粒子表征图。(A)是纳米粒子修饰各个过程的电位，9B)是APACP纳米复合物在808nm的紫外吸收峰。

图3为本发明CCK-8检测法测得的在不同纳米粒子浓度条件下细胞的活性图。

图4为本发明细胞层面乏氧响应基因敲除的验证图。图A是T7核酸内切酶I对基因突变率的检测，图B是Western blot对不同条件处理后，测得的Hsp90α蛋白的含量(A549细胞)，图C不同条件下的采用CCK-8检测法测得的细胞存活率。

图5为本发明经各种制剂处理后的肿瘤生长曲线图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。其中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

本发明的一种乏氧响应的基因编辑方法，包括如下步骤：将乏氧响应性纳米复合材料APACP与含目标基因的细胞进行混合，目标基因序列为:5′-ATTCCCTGTCACCGCGTCAC-3′，对羧基偶氮苯在肿瘤乏氧微环境中发生特异性还原，导致偶氮键断裂，在乏氧条件下，实现共价连接在乏氧响应性纳米复合材料APACP上的Cas9/sgRNA精确可控释放，并基于CRISPR-Cas9系统实现了有效的基因编辑，在红外光照射下实现对肿瘤部位治疗，所述目标基因的具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述的目标基因包括EGFP基因和HSP90α基因，细胞为A549肺癌细胞，小鼠为BALB/c裸鼠，在肿瘤乏氧微环境中，N-N双键被破坏，Cas9/sgRNA复合物可控释放，用于在肿瘤部位特异性地敲除Hsp90α基因。

所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP中，采用的红外光波长为808nm，光照时长为20min。

所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP由Cas9/sgRNA和经对羧基偶氮苯p-AZO修饰的AuNRs组成，并在静电吸附的作用下，在最外层包裹上带正电的聚乙烯亚胺PEI，制得乏氧响应性纳米复合材料APACP。

本发明的乏氧响应性纳米复合材料APACP的制备方法：

通过种子生长法制备金纳米棒，通过巯基键将SH-PEG-NH

实施例2

本发明的乏氧响应性纳米复合材料APACP的制备方法：

采用CTAB介导的种子生长法制备金纳米棒AuNR5×10

所述的Cas9蛋白与sgRNA的质量比为1:3，所述的Tris-HCl缓冲液的pH为7.4；所述的聚乙烯亚胺PEI与加入sgRNA质量比为3:1；所述的聚乙烯亚胺的分子量为10000。

本发明所述的乏氧响应性纳米复合材料APACP在治疗抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤细胞为A549，当把该复合体递送进细胞或者小鼠，实现Cas9对HSP90α基因的精准递送和敲除，同时通过AuNRs将近红外光转化为细胞内的热能，以实现对HSP90α基因敲除的靶向肿瘤细胞的低温热疗。HSP90是一种使细胞适应热环境的热应激蛋白，而HSP90α是其主要亚型。

实施例3

本发明的一种乏氧响应的基因编辑方法，包括如下步骤：

采用CTAB介导的种子生长法制备金纳米棒(AuNR)，0.0040g巯基-聚乙二醇-氨基(SH-PEG-NH

试验例1

本实施例验证了系统的光热效应，方法如下：

用不同功率密度(0，0.10，0.75，1.50，2.25W/cm

试验例2

测试实施例1的纳米复合物的细胞毒性，方法如下：

选择肺癌细胞(A549)，利用CCK-8检测法分别测定不同浓度纳米复合物，不同物质的量的纳米粒子对细胞的活性的影响(与细胞共孵育48小时之后测定)。

试验例3

本试验例提供体外进行乏氧响应基因编辑的具体步骤：按照实施例1制备出靶向到Hsp90α基因的纳米复合物，选取实施例3中确定的低毒性条件，与细胞孵育48小时。通过流式直观对细胞凋亡进行分析。随后，为了验证细胞凋亡与靶点基因敲除相关，可提取细胞裂解液，通过T7核酸内切酶I检测基因突变率，验证乏氧响应下目标基因的敲除。此外，还通过Westernblot对靶点蛋白进行了分析，进一步分析了乏氧响应的基因编辑的可行性。

试验例4

本试验例的动物实验均是在南京大学实验动物使用和管理委员会指导下进行的。本实施例验证了乏氧响应的基因编辑在小鼠活体上的效果，具体实验步骤：

将荷瘤小鼠(A549，肿瘤大小约90mm3)随机分为4组，每组5只，分别用PBS,APACP,AuNRs+NIR和APACP+NIR处理，每隔2天通过肿瘤内注射一次试剂，药物剂量100μL，浓度为3.5mg/ml。实验组中的808nm脉冲激光强度采用1.0W/cm2，每次照射15分钟。给药监测20天，在此期间，记录肿瘤体积以供分析，然后在第20天对动物实施安乐死。

试验例5

在实施例3中，APACP纳米颗粒的细胞毒性

纳米粒子的毒性可以通过将不同浓度的APACPs纳米复合材料分别与肺癌细胞(A549)共同孵育后，利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测法检测不同条件下细胞的活性来评估。用不同剂量的APACP纳米颗粒处理A549细胞(人肺腺癌细胞系)。48小时后，用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力，细胞表现出弱的细胞毒性。(图(3)细胞毒性试验表明，APACP纳米复合材料在体内表现出低细胞毒性和良好的生物安全性。

试验例6

在实施例3中，纳米复合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

本发明通过基因编辑和光热疗法的协同作用，检测了纳米复合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用。作为一种应激蛋白，HSP90在肿瘤细胞中过表达，以在恶劣的微环境中维持体内平衡，并在应激环境中促进生存HSP90α纳米复合材料是Hsp90的主要亚型，本发明选择HSP90α基因作为靶基因，以实现对肿瘤细胞的基因编辑和光热协同效应。通过T7核酸内切酶I对基因突变率进行检测(图4A)和Western blot(图4B)对靶点蛋白进行了分析，确认了乏氧响应的基因编辑的可行性。从CCK-8对细胞死活的分析，可直观地证实乏氧体系中红外光对细胞凋亡作用(图4C)，从左到右依次为APACPs,APACPs+NIR,AuNRs+hypoxia APACPs+hypoxia,AuNRs+hypoxia+NIR,APACPs+hypoxia+NIR。

试验例7

在实施例3中，APACP纳米复合材料的体内抗肿瘤作用

给小鼠殖瘤(A549细胞)，待瘤大小达到70mm

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种乏氧响应的基因编辑方法

<130> 2021

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(目标基因序列)

<400> 1

attccctgtc accgcgtcac 20