一种用于抗肿瘤的雷公藤甲素衍生物聚合物胶束制剂

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种治疗结直肠癌的包载难溶性抗肿瘤药物LA67的聚合物胶束及其制备方法。

背景技术

结直肠癌是第三大最常见的恶性肿瘤，也是第四大最常见的癌症相关死亡原因。每年有超过100万例结直肠癌新发病例，2015年全世界大约有83.5万人死亡。如果肿瘤处于早期阶段，手术是最常用的治疗手段，但化疗和生物治疗是晚期和复发结直肠癌患者的主要治疗方法。据推测，近一半的结直肠癌患者有器官转移。化疗不仅对肿瘤细胞有杀伤作用，同时对正常的组织和细胞也有较大损伤。在过去40年中，基于5-Fu的化疗已显著改善晚期结直肠癌患者的预后，但由于化疗药物的不良反应，其临床应用仍受到限制。因此，迫切需要开发新的抗结直肠癌药物，以减少副作用，并提高疗效。

雷公藤甲素是从雷公藤中提取分离到的环氧化二萜内酯化合物，又名雷公藤内酯醇,是我国临床上应用的各种雷公藤制剂的主要活性成分。国内外学者对雷公藤甲素的抗肿瘤作用进行了大量的研究。体内外研究表明雷公藤甲素是一种广谱肿瘤抑制剂，对约60种肿瘤细胞株有抑制作用,涉及到黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、直肠癌、表皮样癌、粒细胞白血病、T细胞淋巴瘤、肝细胞癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌及中枢神经系统肿瘤等,其中以直肠癌细胞株HCT116和乳腺癌细胞株MCF-7最为敏感。体内外研究均证实,与传统抗肿瘤药物多柔比星、丝裂霉素、顺铂、紫杉醇相比雷公藤甲素有更强的抗肿瘤活性,同时有些对传统抗肿瘤药耐药的肿瘤细胞对雷公藤甲素却非常敏感。尽管雷公藤甲素具有治疗多种疾病的作用，但由于其循环半衰期短、水溶性差、副作用严重等特点，限制了其临床应用。为此，人们开发了许多雷公藤内酯醇衍生物。

LA67是雷公藤甲素的一种衍生物(张东明、陈晓光、臧应达、来芳芳、李创军、王雨辰.雷公藤内酯醇衍生物及其制备方法和药物组合物与用途：中国，201810464842.0[P]2018-5-16)。研究表明，LA67在体外和体内均能有效抑制肿瘤细胞生长，并且LA67降低了雷公藤甲素的高毒性，提高了该类化合物的安全窗。但与雷公藤甲素相同，LA67水溶性差，难以制备静脉注射剂，因此需要研制一种静脉注射LA67的药物传递系统。

近年来，控释靶向给药系统受到广泛关注，成为纳米技术研究的热点。在新的给药系统中，聚合物胶束已成为抗肿瘤药物的理想载体。聚合物胶束(polymeric micelles，PMs)系由两亲性嵌段共聚物在水中自组装形成的一种热力学稳定的胶体溶液。聚合物胶束除了用于药物增溶外，还可以提高药物的稳定性，延长药物在体内的循环时间，并通过EPR效应被动靶向癌细胞，从而减少副作用，提高治疗效果。雷公藤甲素包载聚合物胶束由于具有粒径小、靶向性强、溶胶浓度增加等优点，已成为一种有前途的纳米制剂。在我们之前的研究中，我们制备了多西紫杉醇包载的聚合物胶束和LX2-32C包载的聚合物胶束。我们的结果表明聚合物胶束是抗肿瘤药物稳定有效的载体。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种治疗结直肠癌的包载难溶性抗肿瘤药物LA67的聚合物胶束及其制备方法，该胶束能有效地增加LA67的溶解度，提高LA67生物利用率，同时有效增强LA67抑制肿瘤增殖及肝转移效果。

本发明还提供了聚合物胶束制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种雷公藤甲素衍生物LA67聚合物胶束制剂，由LA67与单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸组成，其中：以单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸为聚合物胶束的载体，将LA67包载在单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸中，LA67结构式为C

本发明所述的聚合物胶束制剂，LA67与单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸的质量比为1:10-1:80，优选质量比为1:20-1:70，进一步优选质量比为1:30-1:60，更优选质量比为1:40-1:50，最优选质量比为1:50，所述的聚合物胶束制剂平均粒径为：15-50nm，进一步优选15-40nm，更优选15-30nm，最优选为：15-20nm。

所述的聚合物胶束制剂，单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸优选自单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300。

本发明还提供了上述一种治疗结直肠癌的抗肿瘤药物LA67聚合物胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将LA67和单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸聚合物按质量比为1:10-1:80(优选1:20-1:70，进一步优选1:30-1:60，更优选1:40-1:50，最优选1:50)的比例溶于有机溶剂中，形成均匀的混合溶液；

S2、将混合溶液旋转蒸发除去有机溶剂，制得以单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300聚合物为载体的LA67薄膜；

S3、将以单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300聚合物为载体的LA67薄膜进行水化，即得包载难溶性抗肿瘤药物LA67的聚合物胶束。

进一步地，所述步骤S1中的单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸聚合物选自单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300聚合物，单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300聚合物由单甲氧基聚乙二醇2000和D,L-丙交酯发生开环聚合反应，形成双嵌段聚合物；

进一步地，所述步骤S1中，有机溶剂为乙腈、四氢呋喃或三氯甲烷，优选乙腈。

进一步地，所述步骤S1中，单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300聚合物和有机溶剂的混合比例为150mg/(2～10)ml，优选混合比例为150mg/(3～6)ml，最优选混合比例为150mg/3ml。

进一步地，所述步骤S2中旋转蒸发以及步骤S3中水化的温度均为40～60℃，优选50℃；步骤S3中，水化时加入的去离子水与单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300聚合物的比例为(5～20)ml：150mg，优选(8～15)ml：150mg，进一步优选(9～12)ml：150mg，最优选10ml：150mg。

本发明具有以下有益效果：

采用的单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300聚合物胶束中，单甲氧基聚乙二醇作为聚合物胶束的外壳，能够避免网状内皮系统的吞噬，延长体内循环时间，而聚乳酸嵌段可包裹疏水性药物，且聚乳酸可生物降解，在体内代谢为二氧化碳和水，因此不会在体内蓄积。

本发明的聚合物胶束具有被动靶向性，通过增强的渗透滞留(EPR)效应实现靶向效果，而且具有较小的粒径且表面亲水，不易被网状内皮系统(RES)摄取而在血液中长循环，因此能更有效的在肿瘤部位蓄积。

本发明的聚合物胶束能控制药物的释放，优化药物的体内分布，从而降低药物不良反应及提高治疗效果。

附图说明

图1为包载LA67聚合物胶束(LA67-PMs)的电镜图和粒径分布图。

图2为LA67-PMs的粒径和分散系数随时间变化的统计分析图。

图3为LA67-PMs的体外累积释放曲线。

图4为空白聚合物胶束(blank PMs)对结肠癌细胞C26存活率影响的统计分析图。

图5为LA67-PMs对结肠癌细胞C26存活率影响的统计分析图。

图6为LA67-PMs对结肠癌细胞C26凋亡的影响分析图。

图7为LA67-PMs对结肠癌细胞C26迁移的影响结果图。

图8为LA67-PMs对小鼠结直肠癌模型进行治疗后，肿瘤及其重量和体积的统计分析图。

图9为LA67-PMs对小鼠结直肠癌模型进行治疗后，结直肠癌肝转移情况的病理切片显微照片(图中方框指示肝转移)。

具体实施方式

实施例1：LA67-PMs的制备及稳定性检测

1、制备LA67-PMs

采用薄膜分散法制备LA67-PMs。在圆底烧瓶中，将150mg单甲氧基聚乙二醇2000-聚乳酸1300聚合物与3mg LA67粉末溶于3ml乙腈中，超声助溶后在50℃水浴条件下旋转蒸发30min除去乙腈，使聚合物与药物在器壁上形成一层均匀的薄膜，然后加入10ml 50℃去离子水水化，静置30min，待充分自组装形成胶束后过0.22μm微孔滤膜，即得到LA67-PMs溶液。将LA67-PMs溶液冷冻干燥48h，冻干制剂放入-20℃冰箱贮存备用。图1结果显示：透射电镜下，LA67-PMs外观圆整、颗粒大小均匀，为球形或类球形。表1示，LA67-PMs的平均粒径为17.88±0.84nm，PDI为0.145±0.02，zeta电位为-1.72±0.36mV。载药胶束的包封率为(94.84±1.09)％，载药量为(1.8±0.01)％。

表1.LA67-PMs理化性质表征结果

2、LA67-PMs稳定性检测。

取LA67-PMs冻干制剂适量，加入5％葡萄糖注射液10ml配制成浓度为1mg/ml的溶液。室温放置0、1天、7天后取出1ml，测定样品的粒径和分散系数，考察LA67-PMs的复溶稳定性。由图2可知，LA67-PMs冻干粉室温下复溶稳定性较好，7天内可保持稳定，测定结果详列于表2。

表2.LA67-PMs复溶稳定性(1周内粒径及分散系数变化)

实施例2：LA67-PMs体外累计释放度的测定

取适量LA67-PMs冻干制剂加入一定量释放介质混匀，配制浓度为0.5mg/ml的溶液。将1.0ml配置好的溶液转移至透析袋内，两端扎紧后置于10ml的等渗PBS缓冲液(pH7.40，含0.5％的Tween-80)中，37℃恒温振荡，回旋速度为100rpm。定时取出0.5ml释放介质，同时补充0.5ml新鲜释放介质。取出的释放介质离心(12000rpm，10min)，应用高效液相色谱法测定LA67累积含量。结果如图3显示，LA67-PMs释药平缓且完全，具有控制药物释放的作用(具体测定结果详列于表3)。这将直接延长药物的作用时间，并减少化疗药物的副作用。

表3.LA67-PMs累积释放百分比

实验例1：空白胶束及LA67-PMs对结肠癌细胞C26存活率的影响

将适量结肠癌细胞C26细胞接种于96孔板中，每孔体积为200μl，于37℃，5％CO

表4.培养24小时后空白胶束及LA67-PMs对结肠癌细胞C26存活率影响统计表

表5.培养48小时后空白胶束及LA67-PMs对结肠癌细胞C26存活率影响统计表

表6.培养72小时后空白胶束及LA67-PMs对结肠癌细胞C26存活率影响统计表

实验例2：LA67-PMs对结肠癌细胞C26凋亡的影响

将C26细胞以8×10

表7.各组药物对结肠癌细胞C26凋亡的影响

实验例3：LA67-PMs对结肠癌细胞C26迁移的影响

将C26细胞以1×10

实验例4：LA67-PMs体内抑制结直肠癌增殖及肝转移

在小鼠右侧皮下注射0.1ml C26结肠癌细胞悬液(密度为1×10

综合上述结果，LA67-PMs可有效地抑制结直肠癌增殖和肝转移，而且其效果较游离LA67更强。

表8.各组药物对小鼠结直肠癌模型治疗14天后肿瘤重量及体积统计表