一种用于细胞膜成像的荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针领域，具体地说，涉及一类基于荧光素母体的细胞膜荧光探针及其制备方法。

背景技术

细胞膜不仅能够阻止外来物质进出细胞，同时能进行细胞内的化学反应信号传导，具有屏障作用以及稳定细胞内稳态的作用。对细胞膜或者细胞膜上的生物分子进行识别标记有利于实现对细胞膜及其功能的检测、研究和处理,具有重要的研宄意义。

荧光成像技术作为新兴的分析技术，具有高灵敏度和高选择性的优异特点，且可进行实时观察、对生物影响较小，在生物学、医学和环境科学等领域已得到广泛应用。一般来说,通过修饰不同的识别基团,探针可以与细胞膜表面大量过表达的受体如生物素、叶酸、唾液酸和多肽等,产生特异性识别作用,从而在细胞膜表面选择性聚集。虽然探针可以通过特异性识别标记在细胞膜表面,但是各种内吞作用使得探针材料,很容易进入细胞内，同时没有一个很好地荧光增强的效果，大大降低了细胞膜成像的信噪比。因此,设计制备具有高效靶向性、能与细胞膜稳定结合，具有显著荧光增强性质的新型探针依然具有很大的挑战性。

发明内容

本发明的目的在于提供一类具有荧光开关型细胞膜成像的荧光探针，具有高亮度、高信噪比等优势。

本发明的目的提供一种用于细胞膜成像的荧光探针的合成方法，该方法具有原料价格低廉、制备方法简便等特点。

本发明提供一种用于细胞膜成像的小分子荧光探针，以荧光素为母体，通过酰胺化连接亲脂性长碳链烷烃基团，具体的化学结构如下：

其中：n＝3,4,5,6,7,8,9。

该类荧光探针在水环境与非水环境中具有强的荧光对比，其中在PBS缓冲溶液中加入表面活性剂后，荧光增强了56倍；同时又具有高的细胞膜脂质亲和力以及高的细胞膜非渗透性，最终实现快速、高信噪比的细胞膜成像效果。

一类用于细胞膜成像的小分子荧光探针合成路线如下：

用于细胞膜成像的荧光探针具体合成步骤如下：

(1)中间体Flour-COOH的合成：将间苯二酚溶于酸催化剂中，搅拌情况下向反应体系中加入偏苯酸酐，升温到80℃-100℃搅拌过夜。点板监测，待反应完毕后，停止反应。待反应液降至室温后，将其倒入冰水中，搅拌，过滤，滤饼用水和二氯甲烷洗涤，真空干燥得到羧基荧光素混合物Flour-COOH。其中间苯二酚、偏苯酸酐的质量比为1:0.5-1，间苯二酚与酸催化剂的质量与体积比为1:4-8(g/mL)。

所述酸催化剂为甲磺酸、硫酸或磷酸中的一种，反应时间以点板检测为基准，直到原料基本反应完全，停止反应。

(2)细胞膜荧光探针的合成：称取5/6位羧基荧光素混合物、缩合试剂于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入无水DMF和DIPEA，室温搅拌30min后，加入烷基胺后继续室温搅拌6h，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-15：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得黄色固体。其中，5/6位羧基荧光素与缩合试剂、的质量比为1:1.5-2，无水DMF与DIPEA、烷基胺的体积比为1：0.05-1：0.05-2，5/6位羧基荧光素与无水DMF的质量与体积比为40-60:1(mg/mL)。

优选的，缩合试剂为HATU、HBTU、DCC或EDC。

本发明公开了一种荧光探针在细胞膜成像中的应用，该探针具有高度的细胞膜非渗透性，同时可以快速的插入到细胞膜磷脂双分子层中(加入染料到成像所用时间为10min)，同时长时间共聚焦成像(达到三十分钟以上)，插入前后高的荧光对比度，体外达到56倍的增强，从而实现快速、清晰的细胞膜免洗成像。

本发明有优点和有益效果：

本发明提供了一种新型的用于细胞膜成像的荧光探针，该荧光探针具有高亮度、高信噪比等优势，可以进行快速、清晰的细胞膜成像。

本发明提供用于细胞膜成像的荧光探针具有高度的细胞膜非渗透性，同时可以快速的插入到细胞膜磷脂双分子层中(加入染料到成像所用时间为10min)，同时长时间共聚焦成像(达到三十分钟以上)，插入前后高的荧光对比度，体外达到56倍的增强，从而实现快速、清晰的细胞膜免洗成像。

附图说明

图1实施例1得到的探针Fluor-16C的核磁氢谱图

图2实施例1得到的探针Fluor-16C的高分辨质谱图

图3实施例1得到的探针Fluor-16C在PBS以及加表面活性剂的紫外吸收图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。

图4实施例1得到的探针Fluor-16C在PBS以及加表面活性剂吐温-80的荧光发射图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。

图5实施例1得到的探针Fluor-16C在Hela细胞的免洗成像图，染料成像浓度为1μM。

具体实施方法：

实施例1

细胞膜小分子荧光探针Fluor-16C的合成方法。

中间体羧基荧光素的合成：

将2g的间苯二酚溶于10mL甲磺酸中，搅拌情况下向反应体系中加入1.5g的偏苯酸酐，升温到90℃搅拌过夜。点板监测，待反应完毕后，停止反应。待反应液降至室温后，将其倒入冰水中，搅拌，期间有大量橙黄色固体生成，过滤，滤饼用水和二氯甲烷洗涤，真空干燥箱烘干得到2.2g的羧基荧光素混合物Flour-COOH，产率69％。

细胞膜荧光探针Fluor-16C的合成：

称取400mg的5/6位羧基荧光素混合物、740mg的HATU于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入10ml的无水DMF和0.74ml的DIPEA，室温搅拌30min后，加入1.60ml十六胺后继续室温搅拌6h，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝15：1作为洗脱剂，减压溶剂得380mg的黄色固体Fluor-16C，产率58％，探针Fluor-16C的核磁氢谱如图1所示。

经检测，产物结构如上式所示，实施例1中得到的探针Fluor-16C的高分辨质谱如图2所示，具体数据为：高分辨质谱理论值C

实施例2

细胞膜荧光探针Fluor-12C的合成：

称取400mg的5/6位羧基荧光素混合物、740mg的HATU于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入10ml的无水DMF和0.74ml的DIPEA，室温搅拌30min后，加入1.21ml十二胺后继续室温搅拌6h，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝15：1作为洗脱剂，减压溶剂得362mg的黄色固体Fluor-12C，产率63％。

经检测，产物结构如上式Fluor-12C所示。

实施例3

细胞膜荧光探针Fluor-8C的合成：

称取400mg的5/6位羧基荧光素混合物、740mg的HATU于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入10ml的无水DMF和0.74ml的DIPEA，室温搅拌30min后，加入0.87ml正辛胺后继续室温搅拌6h，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10：1作为洗脱剂，减压溶剂得334mg的黄色固体Fluor-8C，产率64％。

经检测，产物结构如上式Fluor-8C所示。

实施例4

取实施例1中得到的细胞膜荧光探针Fluor-16C，溶解于DMSO中配置成2mM的母液。取20μL的母液溶于4mL PBS溶液中，配置成10μM的测试液，进行吸收和发射光谱测试。然后加入表面活性剂吐温-80于测试体系中，使其终浓度达到80μM，进行吸收和发射光谱测试。

图3和图4分别为实施例1中得到的细胞膜荧光探针Fluor-16C在PBS以及加入表面活性剂吐温-80中的吸收和荧光发射图，其中吸收为499nm，发射波长为529nm，加入表面活性剂吐温-80后，其荧光增强了56倍，具有明显的荧光增强响应效果。

实施例5

取实施例1得到的荧光探针Flour-16C加入到HeLa细胞培养皿中，染料终浓度为1μM。孵育10min后进行共聚焦成像。

图5即荧光探针Flour-16C在贴壁的Hela细胞膜成像图，有个清晰的细胞膜成像效果，其细胞膜与培养基的荧光强度比为15倍。