一种测定化妆品中牛胆酸的方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种测定化妆品中牛胆酸的方法。

背景技术

牛胆酸在《国际化妆品原料标准中文名称目录（2015年版）》及《国家食品药品监督管理总局关于发布已使用化妆品原料名称目录的通告（2014年第11号）》中都是允许使用的原料，它是一种含硫的非蛋白氨基酸，易溶于水，化学性质稳定。研究发现，牛胆酸具有抗氧化作用等生物学效应，有研究证实牛胆酸具有赋活肌肤细胞的能力，可源源不断地提供年轻肌肤快速与持久的能量补充与多重保护；同时它也具有提高肌肤免疫力，抵抗外界环境对肌肤的侵袭的功效。目前，市面上销售的多款化妆品产品明确标注添加了牛胆酸作为其功效成分。

牛胆酸的测定方法主要有薄层层析法、氨基酸自动分析法、气相色谱法和高效液相色谱法等，其中高效液相色谱法因其快速高效、灵敏度高、重现性好及准确度高等特点，被广泛应用在食品和生物组织中牛胆酸的测定中，但关于应用高效液相色谱测定化妆品中牛胆酸的相关报道较少。因此，开发一种快速、灵敏度高的液相色谱分析方法，对于化妆品中牛胆酸的检测分析具有十分重要的意义。

发明内容

针对缺少关于化妆品中牛胆酸的高效液相检测方法的现状，本发明提供了一种化妆品中牛胆酸的检测方法，用乙腈水溶液提取化妆品中的牛胆酸，正己烷除杂，取上清液用丹磺酰氯衍生反应，衍生物经C

本发明的技术方案如下：

一种测定化妆品中牛胆酸的方法，包括以下步骤：

（1）提取：称取适量试样，加入乙腈水溶液，超声提取；冷却至室温后，加入乙腈水溶液饱和的正己烷，充分混合后静置，用吸管将上层正己烷絮凝状物质仔细吸净弃去；下层溶液中再加入乙腈水饱和的正己烷，充分混合后静置，弃去上层正己烷；定容、混匀、离心，上清液备用；

（2）衍生化：步骤（1）得到的溶液加入碳酸钠缓冲溶液、丹磺酰氯溶液，室温避光衍生反应，加入盐酸甲胺溶液涡旋混合，以终止反应，避光静置至沉淀完全；取上清液经微孔滤膜过滤，待测；

（3）测定：将试液和标准工作溶液的衍生液采用高效液相色谱法进行分析测定；

（4）绘制标准曲线，外标法定量。

所述步骤（1）乙腈水溶液中乙腈、水的体积比为1:9。

所述的步骤（3）的高效液相色谱仪参考条件为：

色谱柱：C

流动相：乙腈：20 mmol/L乙酸铵溶液=30:70（体积比）；

流速：1.0 mL/min；

柱温：35 ℃；

进样体积：20 μL；

检测波长：254 nm。

本发明的有益效果：

（1）提供了一种液相色谱测定化妆品中牛胆酸的方法，相较于分光光度计法、薄层层析法及氨基酸自动分析法等，具有分析速度快、灵敏度高、准确性好等显著优点。

（2）本发明能够应用于多种化妆品中牛胆酸的检测，方法普适性好。

（3）在空白基质中添加适量标准品，按照本标准建立的方法检测分析，根据信噪比确定牛胆酸的方法检出限为50 mg/kg（图5a），定量限为150 mg/kg（图5b）。

附图说明

图1为标准样品衍生液液相色谱图；

图2为不同流动相条件下的色谱图（a：乙腈：水=30:70，b：乙腈：乙酸铵=30:70）；

图3 为牛胆酸衍生物的紫外吸收光谱图；

图4为不同波长下牛胆酸衍生物标准溶液的色谱图（a. 216 nm，b. 254 nm，c.331 nm）；

图5为空白基质中检出限加标和定量限加标色谱图（a. 检出限，b. 定量限）。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1 液相色谱条件的确定

1.色谱柱的选择

高纯硅胶C

2.流动相的选择

试验分别选取了乙腈-乙酸铵溶液、甲醇-乙酸铵溶液、乙腈-水和甲醇-水作为流动相，考察不同流动相组成对目标物的出峰时间、峰形及响应强度的影响。结果发现：同一目标物浓度和相同流动相比例的情况下，用甲醇洗脱样品时，目标峰的保留时间大大延长，且甲醇本身粘度比乙腈要大，系统压力高，所以选择用乙腈作为流动相进行洗脱。此外我们比较了相同流动相比例下分别用乙腈-水和乙腈-20 mmol/L乙酸铵作为流动相时牛胆酸的出峰时间、峰型和响应值，具体色谱图见图2。从图2中可以看出当流动相为乙腈-水时，目标峰的出峰时间较流动相为乙腈-20 mmol/L乙酸铵的时候早，但目标峰周围干扰大，且流动相为乙酸铵的时候目标峰峰型较好。综合考虑选择乙腈-20 mmol/L乙酸铵作为流动相。

3.检测波长的选择

由于牛胆酸衍生物在紫外区均有吸收，故选择紫外检测器进行检测。从二极管阵列检测器在（210-400）nm 波长范围下的扫描光谱图（图3）中可以看出，牛胆酸衍生物在216nm、248 nm和331 nm处有三个特征吸收峰，其中216 nm处吸收最强，其次是248 nm。不同波长下牛胆酸衍生物的色谱图见图4，如果提取波长设定在216 nm附近，干扰峰会很多，而当提取波长为331 nm时，信号响应较弱，综合考虑，最终我们选择254 nm作为牛磺酸的检测波长。

4.柱温的选择

在一定条件下，柱温对牛胆酸衍生物的分离也有影响，我们考察了25-40℃范围内柱温对牛胆酸衍生物的影响，发现随着柱温的升高，样品的保留时间要提前，峰面积也发生一定的变化，但变化不明显。升高柱温一般会使理论塔板数增加，峰宽变得窄小，从而可以获得较低的检测限，但同时柱温过高会影响色谱柱的使用期限，最终确定柱温为35℃。

实施例2 前处理方法的确定

1.样品称样量

化妆品样品成分复杂，在提取目标待测物时，其他杂质也随之溶出，干扰牛胆酸的检测，故取样量不易太大，因此确定取样量为0.5 g。

2.提取液和提取方式的选择

考虑牛胆酸的理化性质并结合试验室常用试剂及其毒性的大小，分别选择了水、甲醇水混合溶液（体积比为1:9）和乙腈水混合溶液（体积比为1:9）作为提取溶液进行实验，具体实验数据见表1。结果表明，在相同的空白化妆品中做添加回收试验时，以1:9的乙腈：水为提取液时牛胆酸目标待测物的回收率高于以1:9的甲醇：水及纯水作为提取液时的回收率。

用乙腈：水=1:9为提取液，分别用振荡和超声提取25 min进行了比较。试验结果表明，超声提取的回收率略高于振荡提取，因此选用超声提取25 min。

表1 不同提取液下目标物的回收率

实施例3

一种液相色谱测定化妆品中牛胆酸的方法，包括以下步骤：

（1）称取试样0.5 g（精确至0.1 mg），置于锥形瓶中，加入约20 mL乙腈水溶液（乙腈：水=1：9），充分混合，超声提取25 min。冷却至室温，加入10 mL乙腈水饱和的正己烷，充分混合后静置，用吸管将上层正己烷絮凝状物质仔细吸净弃去。在下层溶液中再加入10 mL乙腈水饱和的正己烷，充分混合后静置，弃去上层正己烷。转入25 mL容量瓶中，用乙腈水溶液（乙腈：水=1：9）定容至刻度，充分混匀。样液于6000 r/min下离心5 min，取上清液备用。上清液在4 ℃暗处保存放置24 h内稳定。

（2）试液衍生化：

准确吸取1.00 mL所得上清液到10 mL具塞玻璃试管中，加入1.00 mL碳酸钠缓冲溶液（pH 9.5，80 mmol/L），1.00 mL丹磺酰氯溶液（1.5 mg/mL），充分混合，室温避光衍生反应2 h（1 h后需摇晃1次），加入0.10 mL盐酸甲胺溶液（20 mg/L）涡旋混合，以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液经有机相微孔滤膜过滤后上机测定。衍生液在4 ℃以下可避光保存48 h。

另取1.00 mL标准工作液，与试液同步进行衍生。

（3）仪器参考条件

色谱柱：C

流动相：乙腈：20 mmol/L乙酸铵溶液=30:70（体积比）。

流速：1.0 mL/min。

柱温：35 ℃。

进样体积：20 μL。

检测波长：254 nm。

（4）标准曲线的制作

将标准工作溶液的衍生液按仪器参考条件进行测定，以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

（5）试样溶液的测定

将试样溶液的衍生液按按仪器参考条件进行测定，外标法定量。试样溶液中被测物的响应值均应在标准曲线的线性范围内，超出线性范围则应使用流动相稀释后再进行分析。

（6）分析结果的表述

试样中牛胆酸的含量按式（1）计算：

式中：

X—试样中牛胆酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

c —由标准曲线得到的试样溶液中牛胆酸浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V —试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；

n —试样的稀释倍数；

m —试样质量，单位为克（g）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

（7）精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（8）检出限和定量限

本发明中牛胆酸的方法检出限为50 mg/kg，定量限为150 mg/kg。

上述所用溶液如下：

碳酸钠缓冲溶液（pH 9.5）（80 mmol/L）：称取0.424 g无水碳酸钠。加入40 mL水溶解，用1 mol/L盐酸溶液调pH至9.5，用水定容至50 mL。该溶液在室温下3个月内稳定。

丹磺酰氯溶液（1.5 mg/mL）：称取0.15 g丹磺酰氯，用乙腈解并定容至100 mL。临使用前现配。

盐酸甲胺溶液（20 mg/L）：称取2.0 g盐酸甲胺，用水溶解并定容至100 mL。该溶液保存在4 ℃下3个月内稳定。

乙腈水溶液（乙腈：水=1：9）：量取100 mL乙腈，加水900 mL，充分混匀。

乙腈水饱和正己烷：取200 mL正己烷于250 mL分液漏斗中，加入适量10 %乙腈水溶液，剧烈振荡，静置分层后，弃去下层乙腈-水层即得。

乙酸铵溶液（0.01 mol/L）：称取0.77 g乙酸铵，加入适量水溶解，用水定容至1000mL，经0.22 μm水相微孔滤膜过滤后备用。

牛胆酸标准储备溶液（1.0 mg/mL）：准确称取适量牛胆酸标准品（精确至0.1 mg），用水溶解配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。2 ℃~8 ℃保存，有效期7 d。

牛胆酸标准工作溶液：将牛胆酸标准储备液用水依次稀释成0 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、50.0 μg/mL的系列标准溶液。使用前配制。

实施例4

实施例3的线性关系考察

将标准储备溶液配制成一系列浓度的标准工作溶液：0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、50.00 μg/mL，进行衍生处理后，按照标准的色谱条件进样分析测定峰面积，以色谱峰的峰面积为纵坐标，对应的溶液浓度为横坐标作图，绘制标准曲线，得到线性方程和相关系数（表2）。结果表明，牛胆酸在0.50~50.00μg/mL 浓度范围内线性关系良好。

表2牛胆酸的线性关系

实施例5

实施例3的精密度考察

选取牛胆酸低、中、高三组浓度加入空白基质中，对其日内精密度和日间精密度进行考察，结果见表3。

表3方法的精密度（

实施例6

实施例3的回收率考察

根据本标准的规定，分别在液体类、乳类、膏霜类化妆品中添加浓度水平分别为150 mg/kg、300 mg/kg、500 mg/kg的牛胆酸标准溶液，按本标准建立的方法处理分析检测，计算回收率。由表4 结果可知，在液体类、乳类、膏霜类化妆品中牛胆酸的回收率均较好，回收率在82.7%～97.7%之间。

表4 化妆品中牛胆酸的回收率结果（n=6）

实施例7

实施例3的检出限和定量限考察

在空白基质中添加适量标准品，按照本标准建立的方法检测分析，根据信噪比确定牛胆酸的方法检出限为50 mg/kg（图5a），定量限为150 mg/kg（图5b）。