治疗癌症的方法

骨髓细胞白血病1(Mcl-1)是BCL-2蛋白家族的重要抗凋亡成员和细胞存活的主要调节因子。已经在多种癌症类型中观察到MCL1基因的扩增和/或Mcl-1蛋白的过表达，并且通常涉及肿瘤发展。事实上，MCL1是人类癌症中最常被扩增的基因之一。在许多恶性肿瘤中，Mcl-1是关键的存活因子，并且已经显示其介导对多种抗癌剂的耐药性。

Mcl-1通过与促凋亡蛋白(如Bim、Noxa、Bak和Bax)结合并中和其死亡诱导活性来促进细胞存活。因此，Mcl-1抑制会释放这些促凋亡蛋白，通常导致依赖于Mcl-1而存活的肿瘤细胞中的细胞凋亡的诱导。

与Mcl-1一样，Bf1-1也属于抗凋亡蛋白的BCL-2家族。

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)代表在结合至细胞周期蛋白调节配偶体上时变得有活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的家族。CDK/细胞周期蛋白复合物被首先鉴定为细胞周期进程的调节因子。CDK/细胞周期蛋白复合物也涉及转录和mRNA的处理。CDK9/PTEFb(正性转录延伸因子b)主要在Ser-2位点磷酸化RNA聚合酶II(RNAP II)大亚基的羧基末端结构域(CTD)，调节转录延伸。抑制CDK9和转录抑制导致短寿命mRNA转录物和相关蛋白(包括Mcl-1和c-myc)的快速耗竭，导致诱导高度依赖这些存活蛋白的癌细胞的细胞凋亡。

对如下方法存在需求，这些方法用来确定哪些癌症、从而确定哪些患者易受改变抗凋亡蛋白(例如像Mcl-1和Bfl-1)水平的治疗的影响。

在一方面，提供了治疗患者中Mcl-1依赖性癌症的方法，该方法包括通过获得或已经获得该患者的生物样品；并进行或已进行测定以测量Bfl-1的表达水平来确定该癌症是否为Bfl-1阳性；以及如果该癌症是Bfl-1阳性，则向该患者施用CDK9的抑制剂，从而增加癌症细胞凋亡；其中施用CDK9的抑制剂后，Bfl-1阳性癌症癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性癌症癌症细胞凋亡的增加要大，和/或施用Mcl-1抑制剂后，Bfl-1阳性癌症癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性癌症癌症细胞凋亡的增加要少。

在另一个方面，提供了CDK9的抑制剂用于治疗Mcl-1依赖性癌症的用途，其中该癌症已被确定为Bfl-1阳性。

在另一个方面，提供了Mcl-1抑制剂用于治疗Mcl-1依赖性癌症的用途，其中该癌症已被确定为Bfl-1阴性。

其他特征、目的和优点将从说明书和附图以及权利要求中显而易见。

图1A-1B展示了CDK9抑制与Mcl-1抑制相比对一些淋巴瘤细胞系的不同反应。

图2显示，与对Mcl-1抑制的敏感性相比，Bf1-1表达与对CDK9抑制的相对较高敏感性相关。

图3A-3D显示，Bfl-1是不稳定蛋白，并且其表达受瞬时CDK9抑制的调节。

图4A-4B显示，表达Bfl-1的淋巴瘤细胞系依赖于多种Bcl-2家族蛋白以存活。

图5A-5C显示，AZD4573在ABC-DLBCL细胞系中展示稳健的抗肿瘤活性。

本文描述了治疗Mcl-1依赖性癌症的方法。这些方法通常涉及识别与其他Mcl-1依赖性癌症相比，那些对CDK9抑制敏感性增加和/或对Mcl-1抑制敏感性降低的Mcl-1依赖性癌症。

不希望受到特定机制的束缚，在一些Mcl-1依赖性癌症中，完全的细胞凋亡反应可能需要抑制和/或耗竭不止一种抗凋亡蛋白。因为CDK9的抑制可以减少包括Mcl-1在内的其他抗凋亡蛋白(例如像Bfl-1)的表达，所以一些Mcl-1依赖性癌症对CDK9的抑制剂的敏感性可以高于对Mcl-1抑制剂的敏感性。

术语“治疗(treat、treating、treatment)”是指至少部分地减轻、抑制、预防和/或改善症状、障碍、或疾病(如癌症)。术语“癌症的治疗”或“癌细胞的治疗”包括体外治疗和体内治疗两者(包括在温血动物(如人类)中)。癌细胞的治疗的有效性能以多种方式进行评估，这些方式包括但不限于：抑制癌细胞增殖(包括逆转癌症生长)；促进癌细胞死亡(例如，通过促进细胞凋亡或另一种细胞死亡机制)；改善症状；治疗响应的持续时间；延缓疾病的发展；和延长存活。

也可以关于与治疗相关的副作用的性质和程度来评估治疗。此外，有效性可以通过生物标志物(如已知与特定生物学现象相关的蛋白的表达水平或磷酸化水平)来评估。有效性的其他评估方式是本领域技术人员已知的。

如本文使用的，“Mcl-1依赖性癌症”是指Mcl-1耗竭或抑制引起足以证明临床有益效果的癌细胞凋亡增加的癌症。细胞凋亡可以通过多种方法进行评估(如细胞死亡、裂解的胱天蛋白酶的增加、或本领域中已知的其他方法)。

如本文使用的，“Bfl-1阳性”是指癌症、癌细胞或癌细胞系表达Bfl-1蛋白。相反，“Bfl-1阴性”是指癌症、癌细胞或癌细胞系不表达Bfl-1蛋白。对于给定的癌症、癌细胞或癌细胞系，可以通过例如蛋白质印迹来确定Bfl-1的表达状态。

如本文使用的，术语“CDK9的抑制剂”是指能够抑制CDK9(并且可选地，能够抑制一种或多种其他CDK)的化合物。抑制包括CDK9在内的一种或多种CDK的化合物是CDK9的非选择性抑制剂，即使该化合物的主要目标不是CDK9。例如，迪那西利(dinaciclib)抑制多个CDK(包括CDK9)。因此，如本文中作为术语使用的，迪那西利是CDK9的非选择性抑制剂。CDK9的选择性抑制剂是抑制CDK9的化合物，并且对其他CDK具有很少或没有抑制活性。因此，如本文使用的“CDK9的抑制剂”包括CDK9的非选择性抑制剂和选择性抑制剂两者。

CDK9的抑制剂包括例如AZD4573、BAY-1251152、BAY-1143572、CYC065、阿沃西地(alvocidib)、AT7519、沃卢西利(voruciclib)、洛尼西利(roniciclib)、和迪那西利。CDK9的选择性抑制剂包括AZD4573、BAY-1251152、和BAY-1143572。CDK9的非选择性抑制剂包括CYC065、阿沃西地、AT7519、沃卢西利、洛尼西利、和迪那西利。

AZD4573(选择性CDK9抑制剂)也称为(1S，3R)-3-乙酰胺基-N-(5-氯-4-(5，5-二甲基-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺，具有以下式：

并且描述于例如WO 2017/001354中(通过援引以其全文并入)。

如本文使用的，术语“Mcl-1抑制剂”是指能够通过与Mcl-1结合而抑制Mcl-1的化合物。如本文使用的，术语“Mcl-1抑制剂”排除了通过例如限制Mcl-1蛋白的表达间接影响Mcl-1的化合物。因此，如本文使用的术语，CDK9的抑制剂不会被认为是Mcl-1抑制剂。Mcl-1抑制剂的一个说明性实例是AZD5991：

如描述于美国专利第9,840,518号中(通过援引以其全文并入)。

Mcl-1依赖性的癌细胞系对如Mcl-1抑制剂和CDK9的抑制剂等治疗的敏感性可以变化。在一组Mcl-1依赖性癌细胞系中，出乎意料地发现，与Bfl-1阴性细胞系相比，Bfl-1阳性细胞系趋于显示降低的对Mcl-1抑制的敏感性、增加的对CDK9抑制的敏感性、或者两者。因此，与Mcl-1的抑制剂相比，Bfl-1阳性细胞系对CDK9的抑制剂具有更高的相对敏感性。以这种方式，Bfl-1可以用来区分不同的Mcl-1依赖性癌症以识别那些可能对CDK9的抑制剂敏感的Mcl-1依赖性癌症(即使其对Mcl-1抑制剂不敏感)。

在一个实施例中，提供了治疗患者中Mcl-1依赖性癌症的方法，该方法包括通过获得或已经获得患者的生物样品，并且进行或者已经进行测定来测量Bfl-1的表达水平来确定该癌症是否为Bfl-1阳性；以及如果该癌症是Bfl-1阳性，则向该患者施用CDK9的抑制剂，从而增加癌症细胞凋亡；其中施用CDK9的抑制剂后，Bfl-1阳性癌症癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性癌症癌症细胞凋亡的增加要大，和/或施用Mcl-1抑制剂后，Bfl-1阳性癌症癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性癌症癌症细胞凋亡的增加要少。

在一个实施例中，提供了增加Mcl-1依赖性癌症中癌症细胞凋亡的方法，该方法包括通过获得或已经获得患者的生物样品，并且进行或者已经进行测定来测量Bfl-1的表达水平来确定该癌症是否为Bfl-1阳性；以及如果该癌症是Bfl-1阳性，则向该患者施用CDK9的抑制剂，从而增加癌症细胞凋亡；其中施用CDK9的抑制剂后，Bfl-1阳性癌症癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性癌症癌症细胞凋亡的增加要大，和/或施用Mcl-1抑制剂后，Bfl-1阳性癌症癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性癌症癌症细胞凋亡的增加要少。

在一个实施例中，提供了降低Mcl-1依赖性癌症中一种或多种抗凋亡蛋白水平的方法，该方法包括通过获得或已经获得患者的生物样品，并且进行或者已经进行测定来测量Bfl-1的表达水平来确定该癌症是否为Bfl-1阳性；以及如果该癌症是Bfl-1阳性，则向该患者施用CDK9的抑制剂，从而增加癌症细胞凋亡；其中施用CDK9的抑制剂后，Bfl-1阳性癌症癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性癌症癌症细胞凋亡的增加要大，和/或施用Mcl-1抑制剂后，Bfl-1阳性癌症癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性癌症癌症细胞凋亡的增加要少。

在上述实施例的每一个中，所述方法可以进一步包括如果癌症为Bfl-1阴性，则向患者施用Mcl-1抑制剂。CDK9的抑制剂可以是CDK9的选择性抑制剂。CDK9的抑制剂可以是AZD4573。癌症可选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、小慢性淋巴细胞白血病、华氏巨球蛋白血症(

在一个实施例中，提供了CDK9的抑制剂用于治疗Mcl-1依赖性癌症的用途，其中该癌症已被确定为Bfl-1阳性。CDK9的抑制剂可以是CDK9的选择性抑制剂。CDK9的抑制剂可以是AZD4573。

在一个实施例中，提供了Mcl-1抑制剂用于治疗Mcl-1依赖性癌症的用途，其中该癌症已确定为Bfl-1阴性。Mcl-1抑制剂可以是AZD5991。

在一个实施例中，提供了治疗患者中淋巴瘤的方法，该方法包括通过获得或已经获得患者的生物样品，并且进行或者已经进行测定来测量Bfl-1的表达水平来确定该淋巴瘤是否为Bfl-1阳性；以及如果该淋巴瘤是Bfl-1阳性，则向患者施用CDK9的抑制剂，从而增加癌症细胞凋亡；其中施用CDK9的抑制剂后，Bfl-1阳性淋巴瘤癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性淋巴瘤癌症细胞凋亡的增加要大，和/或施用Mcl-1抑制剂后，Bfl-1阳性淋巴瘤癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性淋巴瘤癌症细胞凋亡的增加要少。

在一个实施例中，提供了治疗患者中活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)的方法，该方法包括通过获得或已经获得患者的生物样品，并且进行或者已经进行测定来测量Bfl-1的表达水平来确定该癌症是否为Bfl-1阳性；以及如果该淋巴瘤是Bfl-1阳性，则向患者施用CDK9的抑制剂，从而增加癌症细胞凋亡；其中施用CDK9的抑制剂后，Bfl-1阳性淋巴瘤癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性淋巴瘤癌症细胞凋亡的增加要大，和/或施用Mcl-1抑制剂后，Bfl-1阳性淋巴瘤癌症细胞凋亡的增加比Bfl-1阴性淋巴瘤癌症细胞凋亡的增加要少。

实例1：与Mcl-1抑制相比，淋巴瘤模型的子集显示对CDK9抑制的增强的敏感性

与Mcl-1抑制相比，淋巴瘤细胞系的子集显示对CDK9抑制的增强的敏感性。在6小时的胱天蛋白酶激活测定中，用选择性CDK9抑制剂(AZD4573)或选择性Mcl-1抑制剂(AZD5991)处理33个淋巴瘤细胞系(如图2A所示)。基于胱天蛋白酶EC

方法：将33个弥漫性大B细胞(DLBCL)和套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系接种到用10点、1/2对数滴定预添加AZD4573或AZD5991的384孔板中并孵育6小时。孵育后，按照制造商的方案，使用Caspase-Glo 3/7(美国普洛麦格公司(Promega))测量裂解的胱天蛋白酶。使用基因数据库(GeneData)筛选器和Spotfire分析数据。

结果显示在图1A-1B：淋巴瘤模型对CDK9和Mcl-1抑制剂的药理反应中。图1A是比较一组33个细胞系上AZD4573和AZD5991胱天蛋白酶pEC

实例2：表达Bfl-1的淋巴瘤模型对CDK9抑制高度敏感，而对Mcl-1抑制较不敏感

评估了Bcl2家族成员的蛋白表达以帮助理解为什么淋巴瘤模型的子集与Mcl-1抑制相比对CDK9抑制具有增强的敏感性。在评估的淋巴瘤细胞系(n＝33)的超过20％中鉴定Bfl-1表达，其中大多数表达细胞系属于ABC-DLBCL淋巴瘤亚型。当基于没有表达Bfl-1(n＝25)对细胞系进行聚类时，AZD5991与AZD4573之间的几何平均胱天蛋白酶EC

方法：并行产生来自33个淋巴瘤细胞系的细胞裂解物，以评估促存活Bcl2家族成员的蛋白表达。使用BCA蛋白测定试剂盒对细胞裂解物的蛋白浓度进行归一化处理，并根据标准方案进行蛋白质印迹。Bfl-1表达的阳性细胞系对照(TMD8)被用来对该组中的其他细胞系进行归一化。AZD4573和AZD5991各自的中值和几何平均胱天蛋白酶EC

结果显示在图2A-2B：Bfl-1蛋白在淋巴瘤模型中的表达中。图2A显示了33个淋巴瘤细胞系中Bfl-1蛋白表达的评估。条颜色代表淋巴瘤亚型。通过蛋白质印迹法检测，穿过虚线的条为阳性Bfl-1表达。该比例与TMD8细胞系对照的表达有关。图2B显示33个淋巴瘤模型中AZD4573和AZD5991的胱天蛋白酶几何平均和中值EC

实例3：Bfl-1在淋巴瘤细胞系中是由瞬时AZD4573处理调控的不稳定的蛋白

由于发现Bfl-1表达与CDK9抑制敏感性的增强呈正相关，因此，推测CDK9抑制在淋巴瘤细胞系中除了靶向Mcl-1外，还靶向Bfl-1。将ABC-DLBCL细胞系OCILY10用AZD4573的连续稀释物处理，并且免疫印迹检测其下游靶蛋白。近端CDK9生物标志物(pSer2-RNAP2)被AZD4573以剂量依赖的方式抑制。当AZD4573的浓度抑制近端CDK9生物标志物时，发现了Mcl-1和Bfl-1蛋白的等效降低。通过用环己酰亚胺处理OCILY10细胞证实Bfl-1是不稳定蛋白，表明Bfl-1的半衰期小于1小时(与Mcl-1相似)。其他Bcl2家族蛋白的半衰期均大于9小时。

在用100nM AZD4573处理的OCILY10细胞中也观察到CDK9抑制的时间依赖性响应。向细胞给药后30分钟，pSer2-RNAP2的表达被抑制＞80％，而Mcl1和Bfl1mRNA的表达在2小时降至同等水平，随后在4小时，Mcl-1和Bfl-1蛋白的表达降低。在6小时时检测到裂解的胱天蛋白酶。用AZD4573处理6h后，较长寿蛋白Bc12、Bcl-xL和Bcl-W的表达保持相对不变。我们在另外的ABC-DLBCL细胞系(TMD8)中观察到AZD4573处理后Bfl-1和Mcl-1的相似结果。

方法：将ABC-DLBCL细胞系OCILY10用9pt、1/2对数剂量反应的AZD4573处理6h，并收获细胞以用于产生蛋白裂解物。还将这些细胞用在100nM的AZD4573在6小时内的不同时间点进行处理。在每个时间点(0、0.5、1、2、4、6小时)收获细胞，分别用于mRNA分离或产生蛋白裂解物。将mRNA转化为cDNA，并且使用Mcl1和Bcl2a1引物按照标准方案进行PCR序列扩增。使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白裂解物的蛋白浓度进行归一化，并根据标准方案进行蛋白质印迹。为了确保达到预期的靶接合，针对CDK9(pSer2-RNAPolII)的近端生物标志物，以及Mcl-1和Bfl-1来检测印记。为了测定诱导细胞凋亡的时间，评估了裂解的胱天蛋白酶-3。上样对照(黏着斑蛋白)也用于归一化。

并行产生来自33个DLBCL和MCL淋巴瘤细胞系的细胞裂解物，以评估促存活Bcl2家族成员的蛋白表达。使用BCA蛋白测定试剂盒对细胞裂解物的蛋白浓度进行归一化处理，并根据标准方案进行蛋白质印迹。使用来自TMD8细胞的阳性对照细胞裂解物，采用对照以确保蛋白质印迹测定中蛋白(GAPDH)的相等上样和相等表达。

为估计Bcl2家族蛋白的半衰期，用10μg/mL的环己酰亚胺处理OCILY10细胞以中止新蛋白合成。在环己酰亚胺处理后不同的时间点(0、1、3、6、9、24小时)收获1e^6个细胞，用于产生蛋白裂解物。

结果显示在图3A-3D。淋巴瘤细胞系中通过AZD4573处理对Bfl-1的抑制中：图3A：将OCILY10细胞用剂量反应的AZD4573处理6小时，并后用蛋白质印迹进行评估。图3B：对于指定的时间点，将OCILY10细胞用10μg/mL的环己酰亚胺处理，并进行免疫印迹以检测Bcl2家族蛋白表达。图3C：用100nM AZD4573处理后在OCILY10细胞中Bfl-1转录本和蛋白调节随时间变化的动力学。图3D：来自TMD8细胞(用100nM AZD4573处理指定的时间点，并评估Mcl-1、Bfl-1和裂解的胱天蛋白酶的蛋白调节)的免疫印迹数据。

实例4：表达Bfl-1的淋巴瘤细胞系依赖于多种Bcl-2家族蛋白以存活

如以下描述确定淋巴瘤细胞对Bfl-1的单基因依赖性(使用siRNA)。在OCILY10和TMD8细胞系中，敲除＞80％的靶向Bfl-1的siRNA后，内源性细胞凋亡生物标志物裂解的PARP的表达相对于打乱的对照没有增加。然而，当将Bfl-1敲低细胞用AZD5991处理并再评估裂解的胱天蛋白酶时，在OCILY10和TMD8细胞系中均实现最大水平的细胞凋亡(从平均45％上升到超过90％)，表型模拟了响应于经由AZD4573进行瞬时CDK9抑制实现的最大胱天蛋白酶激活的相似幅度。

方法：OCILY10和TMD8细胞在对数生长期生长，并以1x10^6个细胞/mL在12孔板(Dharmacon B-005000)中在无血清siRNA递送培养基中铺板。将靶向Bfl-1或打乱的阴性对照(NTC)的siRNA SMARTpool以0.1或0.5μM添加到各自的孔中持续24小时(DharmaconBcl2a1-597，NTC-D-001910-01)。将2mL细胞培养基添加到所有转染的孔中，并转移到6孔板中持续另外的48小时。收集转染的细胞，通过蛋白质印迹评估Bfl-1蛋白敲低及裂解的胱天蛋白酶-3。还将转染后的细胞接种于用8点滴定预添加AZD4573或AZD5991的384孔板上并孵育6小时。按照制造商的方案，使用Caspase-Glo 3/7(美国普洛麦格公司)测量板的裂解的胱天蛋白酶激活。

结果显示在图4A-4B。淋巴瘤模型中Bfl-1依赖性中：图4A：免疫印迹显示转染Bfl-1siRNA后，OCILY10和TMD8细胞裂解物中Bfl-1和裂解的PARP的表达。图4B：图表显示，在Bfl-1敲低条件下，对于AZD5991处理OCILY10和TMD8细胞系中的胱天蛋白酶激活呈剂量依赖性增加。

实例5：AZD4573在ABC-DLBCL细胞系中展示稳健的抗肿瘤活性

评估CDK9抑制对Bfl-1体内表达的作用。与Mcl-1抑制相比，ABC-DLBCL异种移植物OCILY10和TMD8的AZD4573间歇给药引起稳健的肿瘤消退(TGl分别为198％和184％)。AZD4573介导的抗肿瘤活性与pSer2-RNAPII、Mcl-1和Bfl-1的药效学降低有关，其次与胱天蛋白酶激活有关。

方法：将AZD4573以二甲基乙酰胺(DMA)/聚乙二醇400(PEG400)/1％w/v吐温80溶液2/30/68进行配制，并以15mg/kg腹腔内(ip)给药，第1天和第2天中以2小时间隔BID给药后停止给药5天。

将AZD5991在30％HPBCD(羟基-丙基-β-环糊精)中以注射用水配制用于静脉内使用，调节pH为9.0-9.5，直到浓度高达20mg/mL(基于亲本形式)。以60mg/kg的剂量每周一次尾静脉注射AZD5991。

将5x10

研究期间，每周记录两次肿瘤体积(通过卡尺测量)、动物体重和肿瘤状况。使用以下公式计算肿瘤体积：长度(mm)x宽度(mm)

药效学测量是按照肿瘤分离的标准方案进行的。使用BCA蛋白测定试剂盒对分离的肿瘤的蛋白裂解物进行归一化。运行免疫印迹并检测pSERII-RNAPII和Bcl2家族蛋白的表达。上样对照(GAPDH)用于确定相等的蛋白上样。

结果显示在图5A-5B中：AZD4573在Bfl-1表达淋巴瘤异种移植物中的体内抗肿瘤活性。图5A：在OCILY10和TMD8 ABC-DLBCL异种移植物模型中，AZD4573处理导致完全肿瘤消退。图5B：3个给药周期后，分别达到的AZD4573和AZD5991疗效的汇总表。图5C：急性AZD4573处理后OCILY10和TMD8模型中Bfl-1的药效学调节。

其他实施例在以下权利要求的范围内。