具有异源刺突蛋白的H52 IBV疫苗

序列表

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发明背景

禽冠状病毒传染性支气管炎病毒(IBV)是巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科的原型γ冠状病毒。传染性支气管炎病毒主要感染鸡的上呼吸道上皮，导致呼吸系统疾病，通常并发继发细菌病原体感染(Cook et al.2012.Avian Pathol.41:239-250)。一些IBV毒株还影响肾小管、输卵管和部分胃肠道，导致这些器官系统中的病理性病变和临床体征。所述病毒广泛存在于商业家禽和庭院家禽中。由于其高基因组变异性，IBV被划分为多种基因型、血清型和保护型。IBV目前被认为是家禽业中经济上最相关的病毒病原体之一。

传染性支气管炎病毒是一种包膜病毒，具有27.6kb的正向单链RNA基因组(Cavanagh 2007.Vet.Res.38:281-297)。病毒基因组的前三分之二包含一个大编码区(也称为基因1)，分为两个开放读框1a和1b，其编码参与RNA复制、编辑和转录的15种非结构蛋白。病毒基因组的最后三分之一编码结构蛋白：刺突蛋白(S，由基因2编码)，包膜蛋白(E，由基因3c编码)，膜蛋白(M，由基因4编码)，核壳蛋白(N，由基因6编码)。蛋白质S、E和M是病毒包膜的一部分，而蛋白质N与病毒RNA一起形成核糖核蛋白核心。冠状病毒刺突蛋白决定了宿主物种向性(Kuo et al.2000.J.Virol.74:1393-1406)。其是一种二聚体或三聚体跨膜蛋白，被蛋白水解成两个亚基S1和S2。高度糖基化的S1 结构域形成刺突蛋白的“头部”，包含与宿主细胞表面上的2,3-连接的唾液酸相互作用的受体结合域(Promkuntod etal.2014.Virology.448:26-32)。S2结构域包含胞外域 (ectodomain)的其余部分(“茎干”)、跨膜结构域和位于细胞质中的胞内域。

迄今为止，最广泛使用的减毒活IBV疫苗株是在1960年代在荷兰通过对Massachusetts样IBV毒株进行连续传代而开发的(Bijlenga et al.2004；Avian Pathol.33:550-557)。然而，自1970年代以来，出现了新的IBV血清型，传统的Massachusetts 样疫苗对其没有提供足够的保护(Cook et al.2012.Avian Pathol.41:239-250)。因此，仍需要针对其它IBV血清型的新型且高效的IBV疫苗。

IBV Beaudette(Geilhausen et al.1973.Arch Gesamte Virusforsch.:40(3)(1973),pp. 285-290)和H120(G.Bijlenga et al.2004.Avian Pathol.:33(6)；pp.550-557)是减毒的IBV。但是，减毒可能会导致免疫原性丧失。

此外，已经产生重组IBV。Zhou et al.2016(Arch Virol.；161:3179–3187)公开了具有Beaudette(Massachusetts基因型)刺突蛋白的H120(Massachusetts基因型)IBV。Hodgson et al.2004(J Virol 78:13804–13811)公开了具有M41(Massachusetts基因型)刺突蛋白的Beaudette(Massachusetts基因型)IBV。此外，Armesto et al.2011(PLoS One:6(8):e24352)公开了具有来自4/91(4/91基因型)的异源刺突蛋白的IBV Beaudette(Massachusetts基因型)。

然而，Zhou et al.2016和Hodgson et al.2004公开的重组IBV均不能被视作具有异源刺突蛋白的IBV，因为IBV和插入的刺突蛋白均来自相同的基因型/血清型(Massachusetts)。再者，所有提及的疫苗均基于Beaudette的骨架或具有来自Beaudette的刺突蛋白。

此外，尽管已经在数十年前已经描述了Beaudette以及已知使用Beaudette的重组方法已超过十年，但是尚无基于Beaudette的疫苗和这种重组疫苗(具有异源刺突蛋白) 可商购。基于Beaudette的重组IBV不适合作为疫苗。Wei et al 2014(Apl MicrobiolBiotechnol 98)公开了具有H120的S1亚基的Beaudette IBV。

Ellis et al 2018(J.Virol.92(23))、Hodgson et al(J.Virol.78(24))和Armesto et al. 2011(PLoS One:6(8):e24352)均公开了具有M41或4/91刺突蛋白的Beaudette IBV。然而， Ellis et al 2018(J.Virol.92(23))描述了重组Beaudette，其具有来自M41或QX的异源S1 亚基组合Beaudette刺突蛋白S2亚基的嵌合刺突蛋白，其不能为S1同源性攻击提供足够的保护(“用表达毒性毒株M41或QX的S1即BeauR-M41(S1)和BeauR-QX(S1)的rIBV 单次接种无特定病原体的鸡，基于纤毛活动性和临床体征提供不完全的抵抗同源攻击的保护作用”；摘要)。进一步地，Ellis et al 2018(J.Virol.92(23))描述了全长S基因(来自 M41的S1和S2)仅提供抵抗同源血清型IBV攻击的部分保护作用(第12页)，提示IBV Beaudette毒株不适合作为重组IBV疫苗的骨架。Hodgson et al(J.Virol.78(24))进一步公开了Baudette毒株“也被认为是较差免疫原性”，因此，“其从未被用作疫苗毒株”(第13802 页，左栏，第二段)。因此，需要分别产生新型高效IBV疫苗和重组IBV疫苗。此外，需要高效的IBV疫苗载体。

发明详述

在描述本发明的各方面之前，必须注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种抗原”时包括多种抗原，提及“病毒”时是指本领域技术人员已知的一种或多种病毒及其等同物，等等。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述优选的方法、装置和材料。为了描述和公开出版物中报道的可以与本发明一起使用细胞系、载体和方法学的目的，本文提及的所有出版物均通过引用以其全部内容并入本文。本文任何内容都不能被解释为承认本发明无权由于发明在先而先于这些披露。

本发明解决了现有技术中固有的问题，并在现有技术中提供了明显的进步。

通常，本发明提供了编码异源IBV S(刺突)蛋白或其片段的H52 IBV(传染性支气管炎病毒)。

术语“H52 IBV”为是本领域技术人员熟知。术语“IBV”是指传染性支气管炎病毒。术语“H52”定义特定的IBV毒株。H52毒株为本领域技术人员熟知且属于Massachusetts 基因型。IBV株通常通过刺突蛋白S1亚基的编码序列加以区分(Valastro et al.2016.InfectGenet Evol.39:349-364)，但也可以通过其完整核苷酸序列或特定蛋白如刺突蛋白、核壳蛋白、包膜(E)蛋白或膜(M)糖蛋白的序列加以区分。由于刺突蛋白决定了IBV的宿主向性和抗原性，因此IBV基因型通过刺突蛋白亚基1的编码序列进行分类。或者，IBV毒株可以通过其血清型加以区分。血清型分类涉及用中和抗体处理病毒。

此外，在施加至年轻的鸡后，可以通过更高的致病性将H52和H120区分开。

如何获得H52 IBV是本领域技术人员的常识。H52 IBV毒株可以商购，例如示例的Nobilis IB H52(MSD Animal Health)，AviPro IB H52(Lohmann Animal Health GmbH&Co.KG)，Bronchovac(Ceva)等。此外，McDonald et al.1980(Avain Pathology 9:245-259)公开H52 IBV可以通过Central Veterinary Laboratory Rotterdam获得，Kusters(J.genVirol 68:343-352)公开了H52 IBV可以通过荷兰的Poultry Health Institute Dorn(现在是GD Animal Health)获得，然后Chen et al.2007(Avian Pathology 36(4):269-274)公开H52 IBV 可以通China Institute of Veterinary Drug Control获得。此外，H52 IBV作为疫苗株已经使用数十年(Bijlenga et al.2004,Avian Pathology 33(6):550-557)，因此可以野外分离。分离H52 IBV毒株和鉴定H52 IBV毒株的方法为本领域技术人员熟知。例如，H52 IBV 毒株的鉴定可以如Zwaagstra et al.1992(J.Clin.Microbiol.30(1):79-84)，Handberg et al. 1999(Avian Pathology 28:327-335)或Callison et al.2006(Journal of Virological Methods 138:60-65)所述。Zwaagstra et al.1992和Handberget al.1999例如公开了Massachusetts 特异性引物(分别针对S和N蛋白)用于RT-PCR和测序以及用于比较的参考序列。此外，已经对H52 IBV进行了测序，可获得基因组序列，例如EU817497。因此，病毒基因组可以通过合成其序列产生，及可以通过应用反向遗传系统产生。

术语“刺突蛋白”是指为本领域技术人员熟知的IBV的一种特定蛋白质。刺突蛋白是抗体和保护性免疫反应的主要诱导物。此外，刺突(S)蛋白通过结合宿主细胞的细胞受体以及还通过介导与宿主细胞的病毒-细胞膜融合而促进IBV进入细胞。此外，其确定了病毒毒株的组织和细胞向性。

术语“异源S(刺突蛋白)”是指已经导入H52 IBV中的刺突蛋白或其片段来自与H52IBV不同的基因型或血清型。因为H52是Massachusetts基因型和血清型，所以异源刺突蛋白是非Massachusetts基因型或血清型。

术语“蛋白质”、“氨基酸”和“多肽”可互换使用。术语“蛋白质”是指由天然存在的氨基酸及其衍生物组成的氨基酸序列。天然存在的氨基酸为本领域熟知，在生物化学的标准教科书中进行了描述。在氨基酸序列内，氨基酸通过肽键连接。此外，将氨基酸序列的两个末端称为羧基末端(C-末端)和氨基末端(N-末端)。术语“蛋白质”包括基本上纯化的蛋白质或另外包含其它蛋白质的蛋白质制品。此外，该术语还涉及蛋白质片段。而且，其包括化学修饰的蛋白质。这种修饰可以是人工修饰或天然存在的修饰，例如磷酸化、糖基化、肉豆蔻基化等。

进一步地，本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含编码异源S(刺突)蛋白或其片段的H52 IBV(传染性支气管炎病毒)。

此外，本发明还提供了包含本文所述的IBV(传染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物。进一步地，本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含编码异源S(刺突)蛋白或其片段的H52 IBV(传染性支气管炎病毒)。

术语“免疫原性组合物”是指包含至少一种抗原的组合物，其在给予所述免疫原性组合物的宿主体内引发免疫应答。这种免疫应答可以是对本发明的免疫原性组合物的细胞和/或抗体介导的免疫应答。优选地，所述免疫原性组合物诱导免疫应答，更优选地赋予针对IBV感染的一种或多种临床体征的保护性免疫。宿主也称作“对象”。优选地，本文描述或提及的任何宿主或对象是禽类或家禽。

通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多种作用：特异性针对本发明免疫原性组合物中包含的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞的产生或激活。优选地，宿主将显示保护性免疫应答或治疗反应。

“保护性免疫应答”或“保护性免疫”通过感染的宿主通常表现出的临床体征减少或消失、感染的宿主较快的康复时间和/或感染持续时间缩短或者组织或体液或排泄物中病原体效价降低而证实。

如果在宿主表现出保护性免疫应答，由此对新感染的抵抗力增强和/或疾病的临床严重性降低，则将免疫原性组合物描述为“疫苗”。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV具有如EU817497所示的核苷酸序列(SEQ ID NO:78)或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

术语“核酸”或“核酸序列”或“核苷酸序列”是指包括DNA分子、RNA分子、cDNA 分子或衍生物的多核苷酸。该术语涵盖单链和双链多核苷酸。本发明的核酸包括分离的多核苷酸(即分离自其自然环境)和遗传修饰的形式。此外，还包括化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰的多核苷酸，例如糖基化或甲基化的多核苷酸，或人工修饰的多核苷酸，例如生物素化的多核苷酸。此外，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指任何核酸。术语“核酸”和“多核苷酸”也具体包括由除了五个生物学存在的碱基(腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基组成的核酸。

术语“RNA”是指任何核糖核酸。该术语涵盖单链和双链RNA。本发明的RNA包括分离的RNA(即分离自其自然环境)和遗传修饰的形式。此外，还包括化学修饰的RNA，包括天然存在的修饰的RNA，例如甲基化RNA，或人工修饰的RNA，例如生物素化的 RNA。术语“RNA”也具体包括由除了四个生物学存在的核苷酸/碱基(腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基组成的RNA。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有刺突(S)蛋白，所述刺突蛋白具有如AF352315所示氨基酸序列(SEQ ID NO:79)或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

必须理解，所述刺突蛋白或核酸序列可用于确定任何IBV毒株是否源于H52。但是，由于将H52 IBV用作骨架，并且H52刺突蛋白或核酸序列由异源刺突蛋白或其片段置换，因此具有异源刺突蛋白的最终IBV不包含任何H52刺突蛋白或仅剩余一部分H52 刺突蛋白。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有刺突(S)蛋白，所述刺突蛋白具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或与其具有至少95％、 96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、 99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有核壳(N)蛋白，所述核壳蛋白具有如AY044185所示氨基酸序列(SEQ ID NO:80)或与上述序列至少之一具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、 99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有核壳(N)蛋白，所述核壳蛋白具有如AF352310所示氨基酸序列(SEQ ID NO:81)或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有核壳(N)蛋白，所述核壳蛋白具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或与其具有至少95％、 96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、 99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有包膜(E)蛋白，所述包膜蛋白具有如AF317210所示氨基酸序列(SEQ ID NO:82)或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有包膜(E)蛋白，所述包膜蛋白具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或与其具有至少95％、 96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、 99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有膜糖蛋白(M)，所述膜糖蛋白具有如AF286185所示氨基酸序列(SEQ ID NO:83)或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，所述H52 IBV毒株具有膜糖蛋白(M)，所述膜糖蛋白具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或与其具有至少95％、 96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、 99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

术语“相同性”或“序列相同性”为本领域已知，是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，即参考序列和待与参考序列进行比较的指定序列之间的关系。在将指定序列与参考序列进行最佳比对以产生最高程度的序列相似性后，通过序列比较确定序列相同性，通过序列字符串之间的匹配而确定。基于这种比对，可以在逐个位置的基础上确定序列相同性，例如如果在某位置上核苷酸或氨基酸残基是相同的，则在该特定位置所述序列是“相同的”。将这种位置相同性的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数，以得出序列相同性百分比。序列相同性可以通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于在Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.,ed.,Oxford UniversityPress,New York(1988),Biocomputing:Informatics和Genome Projects,Smith, D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer, Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些方法，所述教导通过引用并入本文。确定序列相同性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。确定序列相同性的方法编撰在确定指定序列之间的序列相同性的可公开获得的计算机程序中。这种程序的示例包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.,etal.,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.et al.,J.Molec. Biol.,215:403-410(1990))。BLASTX程序可公开得自NCBI和其它来源(BLAST Manual, Altschul,S.et al.,NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.et al.,J.Molec. Biol.,215:403-410(1990)，所述教导通过引用并入本文)。这些程序使用默认的缺口权重以最佳比对序列，以在指定序列和参考序列之间产生最高水平的序列相同性。例如，多核苷酸具有与参考核苷酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％“序列相同性”的核苷酸序列，是指指定的多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，除了指定的多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸的至多15个、优选至多10个、甚至更优选至多5个点突变之外。换句话说，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考核苷酸序列中至多15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸可以缺失或被另一核苷酸取代，或者参考序列中全部核苷酸的至多15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸可以插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置，散布在参考序列中各个核苷酸之间，或者在参考序列内的一个或多个连续基团中。类似地，具有与参考氨基酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％序列相同性的氨基酸序列的多肽，是指指定的多肽的氨基酸序列与参考序列相同，除了指定的多肽序列可包括参考氨基酸酸序列的每100个氨基酸的至多15个、优选至多10个、甚至更优选至多5个氨基酸改变之外。换句话说，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％序列相同性的指定多肽序列，参考序列中至多15％、优选至多10％、甚至更优选至多5％的氨基酸残基可以缺失或被另一氨基酸取代，或者参考序列中全部氨基酸数目的至多15％、优选至多10％、甚至更优选至多5％的氨基酸可以插入参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何位置，散布在参考序列中各个残基之间，或者在参考序列内的一个或多个连续基团中。优选地，不相同的残基位置的保守氨基酸取代不同。但是，在确定序列相同性时不包括保守取代作为匹配项。

术语“相同性”、“序列相同性”和“相同性百分比”在本文可互换使用。为了本发明的目的，在此定义了为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分比，将序列为最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一个氨基酸序列或核酸中导入缺口以与第二个氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置上的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置由与第二个序列中相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的相同性百分比是序列共享的相同位置数目的函数(即相同性％＝相同位置数目/位置总数(即重叠位置)×100)。优选地，两个序列具有相同的长度。

可以在所比较的两个序列的全长上或在两个序列的片段上进行序列比较。通常，在比较的两个序列的全长上进行比较。然而，序列相同性可以在例如20、50、100或更多个连续的氨基酸残基的区域进行比较。

技术人员将意识到可利用不同的计算机程序确定两个序列之间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的相同性百分比的确定。在一个优选的实施方案中，使用如下算法确定两个氨基酸或核酸序列之间的相同性百分比：Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法，所述算法已经并入Accelrys GCG软件包中的GAP程序(可得自http://www.accelrys.com/products/gcg/)，使用 Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为 1、2、3、4、5或6。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数会产生略有不同的结果，但是两个序列的总体相同性百分比不会显著改变。

本发明的蛋白质序列或核酸序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，例如以鉴别其它家族成员或相关序列。这种搜索可以使用BLASTN和BLASTP 程序(version 2.0)进行，所述程序如Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10所述。可以使用BLASTP程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用Gapped BLAST程序，如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述。当使用 BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTP和BLASTN)的默认参数。见NationalCenter for Biotechnology Information主页 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

如本文所用，应特别理解术语“与SEQ ID NO:X的序列相同”等同于术语“在SEQ IDNO:X的长度与SEQ ID NO:X的序列相同”或者与术语“在SEQ ID NO:X的序列全长与 SEQ IDNO:X相同”。在本文中，“X”是选自1-85的任何整数，由此“SEQ ID NO:X”表示本文提及的任何SEQ ID NO。

IBV毒株

IBV毒株可以通过血清型和基因型分类。血清型分类涉及用中和抗体处理病毒，而基因型分类通常涉及检验S1(刺突)蛋白的序列。然而，本领域技术人员熟知不同的IBV 毒株。传染性支气管炎病毒最早于1930年代在美国发现。第一个鉴别的IBV血清型是马萨诸塞(Massachusetts)型，但除最初鉴别的Massachusetts型之外，在美国还确定了其它几种血清型，包括阿肯色(Arkansas)和特拉华(Delaware)。

IBV毒株Beaudette是Massachusetts型，是在鸡胚中至少传代150代而产生的。IBV毒株Beaudette最初是由Beaudette和Hudson分离(J.Am.Vet.Med.A.90,51-60,1937)，并在鸡胚中传代。除了Beaudette之外的其它Massachusetts型IBV毒株是H120、H52 和M41。H120毒株传代120代。

IBV QX被描述为IBV的毒性地方分离株，最初是在中国分离的。但是，该病毒已传播到欧洲，并已在西欧部分地区发现，主要在荷兰，但在德国、法国、比利时、丹麦和英国也已发现。另外，QX基因型或血清型已经在亚洲和非洲的一些国家中描述。

通常称作793B的IBV 4/91在90年代初期首次在英国报道，现在已经传播到世界的许多部分。CR88是属于该血清型的减毒毒株且作为疫苗可以商购获得。

在1990年代后期，在意大利分离出了命名为“Italien-02”或“Italy-02”的毒株。这些分离株之一的序列分析发表于2002年(NCBI-BLAST，编号AJ457137)。然而，研究表明，这种Italian-02毒株在欧洲很普遍，除IBV变异株4/91以外，其已成为在英国、西班牙、法国和荷兰最主要的基因型之一。

自1996年以来，称为Q1的一种新的传染性支气管炎病毒(IBV)基因型在中国流行，并于2011年在意大利首次报道。Q1与增加的死亡率、肾脏病变和腺胃炎有关。

此外，在欧洲也鉴定出了毒株D274、B1648/D8880、D1466、V1397和Arkansas。

如何获得任何IBV毒株是本领域技术人员的常识。IBV毒株可以商购，得自科研机构，也可以将基因组合成为互补DNA，因为已经对IBV毒株进行了测序并且已经公布了序列，因此可以使用。此外，可以从野外分离出IBV毒株。分离IBV毒株和鉴定IBV 毒株的方法为本领域技术人员熟知。Valter Leonardo de Quadros 2011(Dissertation,Das

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源刺突蛋白是非Massachusetts基因型或血清型。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自具有选自以下一组的基因型或血清型的IBV：Arkansas(例如Arkansas 99)，Brazil(例如 BR-1，BR-2，23/2013，IBV/Brasil/351/1984)，California(例如California1734/04，California99)，Connecticut，Delaware(例如Delaware 98)，Dutch(例如D207，D212，D274，D3128，D3896，D8880，D1466)，Florida，Georgia(例如Georgia GA-07，GA-08，GA-12， GA-13)，Gray，Holte，Iowa(例如Iowa 97和Iowa 69)，Italy(例如Italy 02)，JMK，LDT3， Maine(例如Maine 209)，Pennsylvania(例如Pennsylvania 1220/98，Pennsylvania Wolg/98)，PL84084，Qu(例如Qu-mv)，QX(例如GB341/96)，Q1，SE 17，变体2(例如IS/1494/06， IBV/Ck/EG/CU/4/2014，gammaCoV/Ck/Poland/G052/2016)和4/91(793B、CR88)。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自选自如下基因型或血清型的IBV：4/91，QX，Q1，Italy 02，Arkansas，Conneticut，Georgia，LDT3，PL84084，变体2和Brazil。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自选自如下基因型或血清型的IBV：4/91，QX，Q1，Arkansas，变体2和Brazil。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，4/91毒株选自如下一组：Spain/98/328，Spain/92/35，IR-3654-VM，FR-CR88061-88，FR-85131-85，UK- 1233-95，UK/3/91，Spain/00/336，UK/7/91，4/91-致病性，4/91减毒，IB4-91和 CR88。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，QX毒株选自如下一组：FR-L1450T-05，FR-L1450L-05，NL-L1449T-04，NL-L1449K-04，IBV/Ck/SP/170/09， IBV/Ck/SP/79/08，IBV/Ck/SP/248/09，HBN，IBVQX，LX4，BJQ，CK/CH/LGD/03和 GB341/96。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，Q1毒株选自如下一组：CK/CH/LDL/98I，CK/CH/LSD/08-10，J2，Q1，AR08ER22，AR08BA21和Chile-295- 10。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，Arkansas毒株选自如下一组：Ark99，ArkGA，ArkDPI，AL/5364/00，ARKDPI11，AL/0803/01，AL/7149/00， ArkDPI101，AL/1221/01，AL/1793/01和AL/4614/98。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，变体2毒株选自如下一组： IS/1494/06，IBV/Ck/EG/CU/4/2014，gammaCoV/Ck/Poland/G052/2016，Eg/ CLEVB-2/IBV/012，D1344/2/4/10_EG，TR8和IB VAR2-06。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，Brazil毒株选自如下一组： BR-1，BR-2，23/2013和IBV/Brasil/351/1984。

根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自4/91基因型或血清型。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自4/91基因型或血清型，其与SEQ ID NO:5或6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％序列相同性。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自QX基因型或血清型，其与SEQ ID NO:7或8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％序列相同性。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自Q1基因型或血清型，其与SEQ ID NO:9或10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％序列相同性。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自Arkansas基因型或血清型，其与SEQ ID NO:11或12具有至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自变体2基因型或血清型，其与SEQ ID NO:13或14具有至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％序列相同性。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段来自Brazil基因型或血清型，其与SEQ ID NO:15或16具有至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％序列相同性。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白或其片段选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S蛋白是全长刺突蛋白。

本发明的实验数据表明可以使用刺突蛋白序列的片段如刺突蛋白的胞外域。然而，也可以使用全长刺突蛋白序列。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S(刺突)蛋白的片段的长度为至少500、750、1000或1077个氨基酸。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S(刺突)蛋白的片段的长度为从N末端的至少500、750、1000或1077个氨基酸。

术语“N末端”为本领域技术人员熟知。N末端也称作氨基末端、NH2-末端、N-末端或胺末端。当从信使RNA翻译蛋白质时，其是从N末端至C末端产生的。因此，N末端是包含所述胺基(-NH2)的氨基酸链(蛋白质或多肽)的起点。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S(刺突)蛋白的片段的长度为至少1000个氨基酸。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S(刺突)蛋白的片段是刺突蛋白的胞外域。

术语“胞外域”为本领域技术人员熟知。刺突蛋白包含不同的功能部分，即信号序列、胞外域、跨膜结构域和胞内域(从N端到C端)。因此，在切割信号序列后，刺突蛋白的 N-末端始于胞外域。IBV刺突蛋白胞外域的长度约为1077个氨基酸，取决于IBV毒株在长度上相差几个氨基酸。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换同源S蛋白或其片段。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换天然存在的S蛋白或其片段。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换H52 IBV中的S蛋白或其片段。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，IBV是减毒的。

术语“减毒的”是指与野生型分离株相比具有降低的毒性的病原体。在本发明中，减毒的IBV是其中毒性已降低从而不引起IBV感染的临床体征但能够在靶动物中诱导免疫应答的毒株，但也可指与未减毒IBV感染或未接受减毒病毒的“对照组”动物相比，减毒IBV感染的动物中临床体征的发生或严重度降低。在本文中，术语“减少/降低”是指与如上所定义的未减毒的IBV感染的对照组相比，减少至少10％、优选25％、甚至更优选50％、再更优选60％、甚至更优选70％、再更优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、最优选100％。因此，减毒的IBV毒株是适合掺入包含修饰的活IBV的免疫原性组合物中的毒株。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，IBV是灭活的。

任何常规的灭活方法都可用于本发明的目的。因此，可以通过本领域技术人员已知的化学和/或物理处理方法进行灭活。优选的灭活方法包括加入环化的二乙烯亚胺(BEI)，包括加入已被环化成二乙烯亚胺(BEI)的2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)溶液。优选的其它化学灭活剂包括但不限于Triton X-100，脱氧胆酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，β-丙内酯，硫柳汞，苯酚和甲醛(福尔马林)。但是，灭活也可以包括中和步骤。优选的中和剂包括但不限于硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠等。

优选的福尔马林灭活条件包括福尔马林浓度为约0.02％(v/v)–2.0％(v/v)，更优选为约0.1％(v/v)–1.0％(v)/v)，还更优选约0.15％(v/v)–0.8％(v/v)，甚至更优选约0.16％(v/v)– 0.6％(v)/v)，最优选的是约0.2％(v/v)-0.4％(v/v)。温育时间取决于IBV的抗性。通常，进行灭活程序直至在合适的培养系统中检测到无IBV生长。

优选地，本发明的灭活IBV是福尔马林灭活的，优选地使用本文上述浓度。

可使用已知技术将本发明的灭活IBV掺入脂质体中，例如Nature 1974,252,252-254 或Journal of Immunology,1978,120,1109-13中所述。在本发明的另一个实施方案中，本发明的灭活IBV可以与合适的生物化合物例如多糖、肽、蛋白质等或其组合缀合。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，IBV是遗传工程化的。

术语“遗传工程化的”是指已经通过使用“反向遗传学”方法突变的IBV。优选地，本发明的IBV已经进行遗传工程化。反向遗传学技术涉及制备合成的重组病毒RNA。然而，“反向遗传学”技术为本领域技术人员熟知。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，IBV是重组IBV。

如本文所用，术语“重组”涉及RNA基因组(或RNA序列，cDNA序列或蛋白质)，其具有不是相应RNA基因组(或RNA序列，cDNA序列或蛋白质)天然存在的任何修饰。例如，如果RNA基因组(或RNA序列，cDNA序列或蛋白质)包含例如通过人为干预人工导入的插入、缺失、倒位、重定位或点突变，则认为其是“重组的”。因此，RNA基因组序列(或RNA序列，cDNA序列或蛋白质)与与其自然相关的全部或部分序列(或RNA 序列，cDNA序列或蛋白质)不相关。关于病毒使用的术语“重组”是指通过人工操作病毒基因组产生的病毒。术语“重组病毒”包括遗传修饰的病毒。

在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面，IBV是嵌合的。

术语“嵌合的”是指包含来自另一冠状病毒、优选来自另一IBV毒株的一个或多个核苷酸序列的IBV。例如，编码异源S(刺突)蛋白或其片段的IBV H52是嵌合IBV。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，所述免疫原性组合物是疫苗。术语“疫苗”已经在本文别处进行了描述。然而，如果宿主表现出保护性免疫应答，由此对新感染的抵抗力增强和/或疾病的临床严重性降低，则将免疫原性组合物描述为“疫苗”。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，所述免疫原性组合物包含药学可接受的载体。

术语“药学可接受的载体”包括任何及所有的溶剂、分散介质、包被剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫刺激剂及其组合。

“稀释剂”可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等。

在本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。

优选地，免疫原性组合物还包含蔗糖明胶稳定剂。

优选地，所述药学可接受的载体是壳聚糖。

壳聚糖是一种来自甲壳动物(如虾、蟹)、昆虫和其他无脊椎动物体内甲壳素的天然脱乙酰多糖。最近，Rauw等人在2009年(Vet Immunol Immunop 134:249-258)证明壳聚糖增强了新城疫活疫苗的细胞免疫反应，促进了其保护作用。此外，Wang等人，2012 年(ArchVirol(2012)157:1451-1461)显示了壳聚糖作为佐剂用于减毒活体流感疫苗潜力的结果。

优选地，免疫原性组合物可以进一步包括一种或多种其他免疫调节剂，例如白细胞介素、干扰素或其他细胞因子。在本发明范围内有用的佐剂和添加剂的数量和浓度可以由熟练的技术人员容易地确定。

在某些方面，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。本文所用的"佐剂"可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷例如Quil A、QS-21(剑桥生物技术公司，Massachusetts剑桥)、 GPI-0100(药物制剂股份有限公司，亚拉巴马州伯明翰)，油包水乳液，水包油乳液，水包油包水乳液。该乳液尤其可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，如角鲨烷或角鲨烯；由烯类，特别是异丁烯或癸烯的低聚物产生的油。含有直链烷基的酸或醇的酯，特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯) 或丙二醇二油酸酯。支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。该油与乳化剂结合使用，形成乳状液。乳化剂最好是非离子表面活性剂，特别是山梨糖醇、甘露糖醇(如脱水甘露醇油酸酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，它们可以选择性地乙氧基化，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是Pluronic 产品，特别是L121。参见Hunter等人，《佐剂的理论和实际应用》(埃德·斯图尔特-图尔， D.E.S.)，约翰·威利父子出版公司，农业行业标准,第51-94页(1995年)和托德等，《疫苗15:564-570》(1997年)。典型的佐剂是《疫苗设计，亚单位和佐剂方法》第147页中描述的SPT乳液，编辑者是M.Powell和M.Newman，普莱南出版社，1995年，以及同一本书第183页中描述的MF59乳液。

佐剂的另一个实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别是与糖类或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。这些化合物被称为卡波姆 (carbomer)(Phameuropa卷8，第二期，1996年6月)。本领域的技术人员还可以参考美国专利第2,909,462号，该专利描述了此类丙烯酸聚合物与具有至少3个羟基，最好不超过8个羟基的多羟基化合物交联，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基取代。优选的基团是那些含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其他乙烯基不饱和基团。不饱和基团本身可以含有其他取代基，如甲基。以卡波普 (Carbopol)为名销售的产品(BFGoodrich，美国俄亥俄州)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，可以提及卡波普974P、934P和971P。最常用的是卡波普971P。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中，有共聚物EMA(孟山都公司)，其是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物溶解于水产生酸性溶液，其将被中和，优选中和至生理pH，以便制备将要掺入免疫原性、免疫学或疫苗组合物的佐剂溶液。

进一步合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(RIBI公司)、Block共聚物(CytRx，亚特兰大乔治亚州)、SAF-M(Chiron，加利福尼亚州埃梅里维尔)、单磷酸脂质A、Avridine脂质胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他形式)的热不稳定内毒素，霍乱毒素，IMS 1314 或鼠酰胺基二肽，或天然存在的或重组的细胞因子或其类似物，或内源性细胞因子释放的刺激物，等等。

预计佐剂的添加量为每剂约100微克至约10毫克，优选为每剂约100微克至约10毫克，更优选为每剂约500微克至约5毫克，甚至更优选为每剂约750微克至约2.5毫克，最优选为每剂约1毫克。另外，佐剂的浓度按最终产品的体积计算可以是约0.01 至50％，优选约2％至30％，更优选约5％至25％，更优选约7％至22％，最优选浓度为 10％至20％。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面，免疫原性组合物在有需要的对象中有效治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。术语"治疗和/或预防"、"临床症状"和"有需要"已在其他地方定义。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面中，免疫原性组合物保护免受异源刺突蛋白的基因型或血清型的IBV毒株的攻击。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一特定方面中，免疫原性组合物保护免受4/91、 QX、Q1、Arkansas、变体2或Brazil基因型毒株的攻击。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，所述免疫原性组合物保护免受 4/91基因型毒株的攻击。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，所述免疫原性组合物被配制为用于单剂施用。

单剂的体积已在本文其他地方定义。

此外，已经表明，在给予这种单剂的本发明免疫组合物后，一个剂量的本发明免疫组合物是有效的。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，该免疫原性组合物经皮下、肌内、口服、卵内、通过喷雾、通过饮用水或通过滴眼剂施用。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，所述免疫原性组合物包括每剂 1至10log

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，所述免疫原性组合物包括每剂 2至5log

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，所述免疫原性组合物包括每剂 2至4log

试剂盒

如果需要，组合物可以存在于包装或配药装置中，所述包装或配药装置包含一个或多个包含活性成份的单位剂型。例如，包装可以包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可附有施用说明书，优选地用于给对象，尤其是家禽施用。与这类容器有关的可以是一须知，它按管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构的规定的形式撰写，该须知反映了管理机构对人体用药的制备、使用或销售的许可。

因此，本发明提供了一种包含本文所述的IBV或免疫原性组合物的试剂盒。

在根据本发明的试剂盒的一个具体方面，该试剂盒还包含用于治疗和/或预防禽类疾病的说明书。

在根据本发明的试剂盒的一个具体方面，试剂盒还包括治疗和/或预防家禽疾病的说明书。

在根据本发明的试剂盒的一个具体方面中，试剂盒还包括用于治疗和/或预防IB(传染性支气管炎)的说明书。

此外，本发明提供了用于免疫对象的方法，包括向该对象施用如本文所述的免疫原性组合物。

术语“免疫”是指通过向待免疫的对象施用免疫原性组合物进行主动免疫，从而引起针对包含在这种免疫原性组合物中的抗原的免疫应答。

优选地，免疫导致群体中特定IBV感染的发生率降低或由特定IBV感染引起或与之相关的临床体征严重程度的降低。

此外，用本文提供的免疫原性组合物对有需要的对象进行免疫，结果是防止对象被 IBV感染。甚至更理想的是，免疫的结果是对IBV感染产生有效的、持久的免疫应答。可以理解，所述时间段将持续超过1个月，优选超过2个月，优选超过3个月，更优选超过4个月，更优选超过5个月，更优选超过6个月。应该理解的是，免疫不一定对所有被免疫的对象都有效。然而，该术语要求群体的很大一部分对象被有效免疫。

优选地，在这种情况下设想一群对象，其通常将产生通常由IBV感染引起或与IBV感染相关的临床体征，即未经免疫。该群体的对象是否被有效免疫可以由本领域技术人员进一步确定。优选地，与未免疫或用本发明之前可获得的免疫原性组合物免疫但随后被特定IBV感染的对象相比，如果某一群体的至少33％、至少50％、至少60％、至少 70％、至少80％、至少90％、更优选至少95％、最优选100％的对象的临床体征在发生率或严重程度上减少了至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少 40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，且最优选100％，则该免疫应有效。。

此外，本发明提供了在有需要的对象中治疗或预防由IBV引起的临床体征的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。

术语"治疗或预防"是指减少群体中特定IBV感染的发生率，或减少由特定IBV感染引起或与之相关的临床体征的严重程度。因此，“治疗或预防”一词也指接受有效量的本文提供的免疫原性组合物的一组对象，与未接受这种免疫原性组合物的一组对象相比，减少群体中感染特定IBV的对象数量(＝减少特定IBV感染的发生率)，或减轻通常与IBV 感染相关或由IBV感染引起的临床体征的严重性，或减少特定IBV感染后的病毒脱落，或防止或减少产蛋母鸡在感染特定IBV后的减蛋。

“治疗或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物给有需要或可受益于这种治疗/预防的对象或对象群体施用。术语“治疗”指一旦对象或该群体的至少一些对象已经感染了这种IBV并且其中这些对象已经显示由这种IBV感染引起或与之相关的一些临床体征，施用有效量的免疫原性组合物。术语"预防"是指在对象感染IBV之前，或至少在该对象或一组对象中没有任何对象显示由该IBV感染引起或与之相关的任何临床体征的情况下，给对象进行施用。术语“预防”和“防止”在本申请中可互换使用。

如本文所用，术语“有效量”是指但不限于在对象中引发或能够引发免疫应答的抗原量。这样的有效量能够减少群体中特定IBV感染的发生率或降低特定IBV感染的临床体征的严重性。

优选的是，与未接受治疗或接受本发明之前可用的免疫原性组合物治疗但随后被特定IBV感染的对象相比，临床症状的发生率或严重程度至少减少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选100％。

本文所使用的术语“临床体征”是指对象感染IBV的体征。感染的临床体征取决于所选择的病原体。这种临床体征的例子包括但不限于呼吸窘迫、肾炎、输卵管炎(salphingitis)、产蛋异常、羽毛蓬乱、抑郁、生长率下降和食欲下降。呼吸窘迫的体征包括呼吸体征，包括气喘，咳嗽，打喷嚏，气管罗音，鼻和眼分泌物，气管病变和气管内的纤毛停滞 (ciliostasis)。肾炎的迹象包括肾脏病变和水样腹泻。产蛋异常的迹象包括减蛋、蛋的尺寸较小、蛋壳较差、蛋的内部质量下降、蛋的蛋白较薄以及输卵管内的纤毛停滞。但是，临床体征还包括但不限于可直接从活体动物观察到的临床体征。可从活体动物上直接观察到的临床体征的例子包括鼻腔和眼部分泌物、咳嗽、气喘、打喷嚏、气管啰音、褶皱的羽毛、结膜炎、体重降低、生长率下降、食欲下降、脱水、水样腹泻、跛行、昏睡、消瘦和不爱动等等。

优选的是，与未接受治疗或接受本发明之前可用的免疫原性组合物治疗但随后被特定IBV感染的对象相比，接受治疗的对象的临床症状在发生率或严重程度上减轻指的是纤毛停滞的减轻、罗音的减轻、落蛋的减轻、肾脏病变的减轻、水样腹泻的减轻、减少体重降低、病毒载量降低、病毒脱落减少，或其组合。

本文所使用的术语"需要"或"有需要的"是指给施用/治疗与加强或改善健康或临床体征或对接受本发明的免疫原性组合物的对象的健康有任何其他积极的医药作用有关。

术语"减少"或"减少"或"减轻或"降低"在本申请中可以互换使用。术语"减少"是指，与未接受治疗(未免疫)但随后被特定IBV感染的对象相比，临床体征减少至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选100％。

此外，与相同物种的未免疫对照组的对象相比，本发明提供了在需要的对象中减少纤毛停滞的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。

如实施例所示，本文提供的免疫原性组合物已被证明在减少纤毛停滞方面是有效的。

术语“纤毛停滞”是指纤毛在气管中的运动减少。因此，可以通过检查气管环的内层以确定纤毛的运动来确定纤毛停滞。如何确定气管内纤毛的运动，是本领域技术人员的一般知识。

优选地，与相同物种的未免疫对照组的对象相比，从攻击或感染后的第10天开始，更优选地从攻击或感染后的第5天开始，更优选地从攻击或感染后的第4天开始，更优选地，从攻击或感染后的第3天开始，并且最优选地，在用IBV攻击或感染后的第1 天或第2天开始，纤毛的运动不减少。

术语“纤毛停滞减少”是指与相同物种的未免疫对照组的对象相比，纤毛停滞减少至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选100％。如何测量纤毛停滞的降低，是本领域技术人员的一般知识。

在本发明的一个方面，所述对象是禽类(avian)。

术语“禽类”对于本领域技术人员是众所周知的。术语“禽类”包括所有鸟类，包括家禽。

在本发明的一个方面，所述对象是家禽(poultry)。

术语“家禽”对于本领域技术人员是众所周知的。术语“家禽”包括鸡(chicken)，火鸡 (turkey)，鹌鹑(quail)，野鸡(pheasant)，珍珠鸡(guineafowl)，鹅(goose)和鸭(duck)。此外， "鸡"一词包括肉鸡、产蛋鸡，和两者的繁殖鸡，也被称为种鸡。

在本发明的一个方面，所述对象选自鸡，火鸡，鹌鹑或野鸡。

在本发明的一个方面，所述对象是鸡。

在本发明的一个方面，免疫原性组合物施用一次。

理解单剂为仅施用一次。如实施例所示，本文提供的免疫原性组合物已被证明在给有需要的对象施用单剂后具有疗效。

每只家禽的剂量体积取决于接种途径和家禽的年龄。

通常，在任何年龄，滴眼剂疫苗以每剂1至100μl的体积施用。优选地，滴眼剂疫苗的单剂的总体积在约5μl至70μl之间，更优选的是在约20μl至50μl之间，优选单剂 20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl或50μl。优选的是，滴眼剂疫苗的单剂总体积在约5μl至70μl之间，更优选的是在约20μl至50μl之间，优选单剂20μl、25μl、30μl、 35μl、40μl、45μl或50μl。

对于日龄家禽，喷雾疫苗可包含25至1000μl的剂量体积。优选地，喷雾疫苗的单剂总体积在约50μl至5000μl之间，更优选在约75μl至2000μl之间，更优选在约100μl 至1000μl之间，甚至更优选在约200μl至900μl之间，更优选地，在约300μl和800μl 之间，甚至更优选在约400μl和700μl之间，优选单剂400μl，425μl，450μl，475μl，500μl， 525μl，550μl，575μl，600μl，625μl，650μl，675μl或700μl。最优选单剂的总体积为400μl、 450μl、500μl、550μl、600μl、650μl或700μl。

用于卵内接种的疫苗可以包含50至100μl，优选50μl的剂量体积。优选地，用于卵内疫苗的单剂的总体积为约10μl至250μl，更优选为约15μl至200μl，甚至更优选为约20μl至150μl，甚至更优选为约30μl。100μl，甚至更优选在约30μl至75μl之间，并且优选单剂30μl，35μl，40μl，45μl，50μl，55μl，60μl，65μl，70μl或75μl。最优选地，单剂的总体积为40μl，45μl，50μl，55μl或60μl。

用于肌肉内或皮下接种的疫苗或一剂饮用水疫苗可含有体积为30μl至1000μl的剂量。优选地，单剂的总体积在约30μl到1000μl之间，更优选在约50μl到500μl之间，更优选在约75μl到250μl之间，甚至更优选在约100μl到200μl之间，最优选单剂100μl、 110μl、120μl、125μl、130μl、135μl、140μl、145μl、150μl、160μl，170μl、175μl、180μl、190μl，155μl或200μl。

在本发明的一个方面，免疫原性组合物以两个或多个剂量施用。

然而，免疫原性组合物可以以两个或更多个剂量施用，在施用第二剂量(加强剂)之前施用第一剂量。

在两次施用方案的优选方面中，第一和第二剂量的免疫原性组合物以相同的量施用。优选地，每个剂量为上述指定的优选量。除了第一和第二剂量方案外，替代实施方案还包括其他后续剂量。例如，可以在这些方面施用第三、第四或第五剂量。优选的是，随后的第三、第四和第五个剂量方案的施用量与第一剂量相同，并且各剂量之间的时间范围与上述第一和第二剂量之间的时间一致。

优选的是，疫苗的第一次施用是在三周龄内进行的，更优选的是在一周龄内进行，最优选的是在一天龄通过下述方法进行。第二次施用可在20周龄内，优选在16-18周龄内，更优选在6-12周龄内进行。示例性地，在1-10天龄时进行初始(第一)接种，并且在6-12或16-18周龄时使用活疫苗或灭活疫苗进行第二接种(增强)。更优选地，在一日龄时进行初始(第一)接种，并且在6-12周龄或16-18周龄时使用活疫苗或灭活疫苗进行第二接种(增强)。

在使用卵内疫苗的情况下，优选当胚胎在15到19天时进行第一次施用，优选在第17天、18天或19天，最优选在第18天。第二次施用可在出生后的前三周内进行，最好在出生后的前10天内进行。

在本发明的一个方面中，所述免疫原性组合物经皮下、肌肉内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或经由滴眼剂施用。

免疫原性组合物优选局部或全身施用。常规使用的合适施用途径是口服或肠外施用，例如鼻内、静脉内、皮内、经皮、肌肉内、腹腔内、皮下以及吸入、卵内、通过喷雾、通过饮用水或通过滴眼剂。然而，根据化合物的性质和作用方式，免疫原性组合物也可以通过其他途径施用。例如，这样的其他途径包括经皮、静脉、血管内、动脉内、鼻腔内、胸腔内、气管内、心内、腹腔内、腹膜内、髓内、腹膜外、直肠内和阴道内。然而，最优选地，免疫原性组合物经皮下，肌内，口服，卵内，通过喷雾，通过饮用水或通过滴眼剂施用。

活IBV疫苗优选通过滴眼剂，鼻内，肌内或皮下单独施用。

更优选地，使用大量施用方法，包括饮用水和气雾剂疫苗接种。还优选的是疫苗作为胚胎疫苗(所谓的卵内疫苗)的用途，如下文进一步描述。

例如，肉鸡可以在一日龄或1-3周龄时接种疫苗，特别是对于MDA水平高的肉鸡。产蛋鸡或繁殖鸡最初可在1-10日龄接种疫苗，并在7-12或16-18周龄用疫苗加强。

卵内施用

如上所述，本发明还提供了一种IBV疫苗，该疫苗可以通过卵内途径安全施用，同时能够诱发保护性免疫应答。卵内施用对于本领域技术人员是众所周知的，并且本领域技术人员可以不用费力就可以进行卵内施用。疫苗的卵内施用涉及将疫苗施用于包含在蛋中的禽胚胎(关于卵内疫苗接种的综述参见：Ricks等，兽医进展.495-515,1999)。疫苗可以被注射到鸡蛋的任何合适的隔间(如尿囊液、卵黄囊、羊膜、空气细胞或进入胚胎)，如本领域所描述的(Sharma；Am.J.Vet.Res.45 1619-1623，1984)。优选地，疫苗在壳(气室)膜和绒膜尿囊膜下方施用。

优选地，将疫苗在胚胎发育的后期阶段，通常是在孵化期的最后四分之一，最好是孵化前3-4天，注射到胚胎卵中。最好是在胚胎15至19天大时进行，最好是在第17、 18或19天，最理想的是在第18天大时。随后，将接种过的胚卵转移到孵化器中进行孵化。卵内施用的过程可以使用现有技术中描述的机器人注射工艺进行自动化。

通常用于家禽孵化后疫苗接种的常规疫苗不能用于卵内疫苗接种，因为晚期胚胎对所检查的大多数疫苗病毒高度敏感。然而，国际专利申请WO 01/64244披露，IBV疫苗可以用于卵内施用，但必须以非常低的剂量应用。此外，Wakenell等人，1986(Am.J.Vet. Res.，47 933-938)公开了在组织培养物中传代IB疫苗病毒使该病毒对胚胎无致病性。

在本发明的一方面，所述免疫原性组合物通过滴眼剂施用。

通常，用于孵化后施用的活疫苗包括减毒IBV，其浓度为每剂10

用于卵内施用的活疫苗通常包含体积为50至100μl，优选50μl的10

优选地，本发明的免疫原性组合物包括本发明的IBV，其量为每剂约1至约10log

在本发明的一方面，该免疫原性组合物包含每剂1至10log

在本发明的一方面，该免疫原性组合物包含每剂2至5log

在本发明的一方面，所述免疫原性组合物包含每剂2-4log

在本发明的一个方面，免疫原性组合物在对象的一周龄内、三日龄内、两日龄内或一日龄内施用。

优选的是，待免疫的对象为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20或21日龄。更优选地，所述要免疫的对象是1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13或14日龄。最优选地，所述要被免疫的对象是1、2、3、 4、5、6或7日龄。

然而，必须理解的是，在对对象接种几天后，家禽的免疫系统确实需要几天才能建立针对IBV感染的免疫力。因此，最好是在对象出生后的头24小时内进行免疫接种。

在本发明的一个方面，免疫原性组合物是在对象出生后的第一天内施用。如实施例所示，本文提供的免疫组合物在给1日龄的家禽施用时已被证明是安全和有效的。

在本发明的一个方面，所述方法导致与相同物种的未处理对照组的对象相比，选自以下组的功效参数的改善：预防或减少纤毛停滞，预防或减少罗音，预防或减少减蛋，预防或减少肾脏病变，预防或减少水样腹泻，减少体重降低，病毒载量降低，病毒脱落减少或其组合。

术语"治疗和/或预防"已在其他地方定义，其中术语"预防"和"防止"或"避免"在本申请中可互换使用。此外，“脱落”一词也已在其他地方定义。

术语“减少”、"降低"、“减轻”或“变低”是指与同一物种的非免疫对照组的对象相比，功效参数(纤毛停滞，罗音，减蛋，肾脏病变，水样腹泻，体重降低，病毒载量，病毒脱落)减少至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％并且最优选100％。如何测量功效参数的改善是本领域技术人员的常识。

术语“病毒载量”对于本领域技术人员是众所周知的。术语病毒载量可与本文的病毒滴度互换使用。病毒载量或病毒滴度是活性病毒感染严重程度的量度，并且可以通过本领域技术人员已知的方法确定。测定可以基于对病毒蛋白的检测，如通过抗体与病毒蛋白结合并进一步检测，或者，通过扩增方法如RT-PCR检测病毒RNA。通过核酸扩增方法监测血浆中与病毒相关的病毒RNA是一个广泛使用的参数，用于评估逆转录病毒疾病的状态和进展，并评估预防和治疗干预的有效性。举例来说，病毒载量或病毒滴度可以通过估计所涉及的体液中病毒的活体数量来计算，如每毫升血浆中的RNA拷贝数。

术语"纤毛停滞"对于该领域的技术人员来说是众所周知的。气管的表面覆盖着特殊的上皮细胞，内衬着众多的，活动的，呈毛状的结构，称为纤毛。术语“纤毛停滞”包括纤毛的减少或丧失和/或纤毛活性的丧失或部分丧失。本领域技术人员无需过度劳动即可确定纤毛停滞。

术语“罗音”对于本领域技术人员来说是众所周知的。然而，术语“罗音”包括气管罗音并且是指从支气管发出的声音。本领域技术人员可以无需过度劳动确定罗音。

术语“减蛋(egg drop)”对于该领域技术人员是众所周知的。术语“减蛋”包括产蛋量减少。

在本发明的一个方面，与相同物种的未治疗对照组的对象相比，治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。

在本发明的一个方面，与相同物种的未治疗对照组的对象相比，治疗或预防导致肾脏病变的预防或减少。

在本发明的一个方面，与相同物种的未处理对照组的对象相比，治疗或预防导致减蛋的预防或减少。

本发明进一步提供了用于治疗用途的如本文所述的IBV或免疫原性组合物。

本发明进一步提供了用作免疫原或疫苗的如本文所述的IBV或免疫原性组合物。

本发明还提供了用作药物的如本文所述的IBV或免疫原性组合物。

本发明进一步提供了本文所述的IBV或免疫原性组合物在制备药物中的用途。

本发明进一步提供了本文所述的IBV或免疫原性组合物在治疗和/或预防对象中的 IBV感染中的用途。

本发明进一步提供了一种免疫原性组合物，包括编码异源S(刺突)蛋白或其片段的 H52 IBV(传染性支气管炎病毒)，其中所述H52 IBV包括核壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白或膜糖蛋白(M)，其具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、AY044185(SEQ ID NO 80)、AF352310(SEQ ID NO 81)、AF317210(SEQ ID NO 82)或AF286185(SEQ ID NO:83)所示氨基酸序列或与其具有至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、 99.98％或99.99％的序列相同性的序列，并且，其中异源S蛋白或其片段选自4/91、QX、 Q1、Arkansas、变体2和Brazil的基因型或血清型，或选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、 99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面，异源S蛋白是全长刺突蛋白。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面，异源S(刺突)蛋白的片段从N端开始至少有500、750、1000或1077个氨基酸的长度。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面，异源S(刺突)蛋白的片段是刺突蛋白的胞外域。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面，IBV是减毒的。

本发明进一步提供了一种制备用于治疗和/或预防对象中IBV感染的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：

a.)提供包含刺突(S)蛋白、核壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白或膜糖蛋白(M)的H52 IBV，其具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、AF352315 (SEQ ID NO79)、AY044185(SEQ ID NO 80)、AF352310(SEQ ID NO 81)、AF317210(SEQ ID NO 82)或AF286185(SEQ ID NO:83)所示的氨基酸序列或与其具有至少95％，96％， 97％，98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％，99.95％，99.98％或99.99％的序列相同性的序列；以及

b.)提供异源S蛋白或其片段，其选自4/91、QX、Q1、Arkansas、变体2和Brazil 的基因型或血清型列表，或选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或16所示氨基酸序列或与其具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％， 98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％，99.95％，99.98％或99.99％的序列相同性的序列；以及

c.)用b)所述的异源S(刺突)蛋白或其片段替换a)的H52 IBV的刺突蛋白或其片段，以获得具有异源S蛋白或其片段的H52 IBV；以及

d.)获得具有异源S蛋白或其片段的所述H52 IBV；以及

e.)加入药学可接受的载体。

术语“获得”包括具有异源S蛋白或其片段的所述IBV H52的收获、分离、纯化和/或配制(例如完成、灭活和/或混合)。

术语“收获”是指从转染或感染的细胞或细胞系中收集或回收具有异源S蛋白或其片段的所述IBV H52。可以使用本领域已知的任何常规方法，例如任何分离方法。本领域中众所周知的方法包括离心或过滤，例如使用具有一定孔径的半透膜。

术语“分离”包括具有异源S蛋白或其片段的所述IBV H52的分离步骤。本领域技术人员已知从转染或感染的细胞或细胞系中分离的方法。这些方法包括物理和/或化学方法，包括但不限于冻融循环，超声处理等。

从分离物中"纯化"具有异源S蛋白或其片段的所述IBV H52的方法是本领域技术人员已知的，例如通过在《蛋白质纯化方法--一种实用方法》(E.L.V.Harris and S.Angel,eds., IRL Press at Oxford University Press)。这些方法包括但不限于通过离心和/或过滤、沉淀、尺寸排除(凝胶过滤)色谱、亲和色谱、金属螯合物色谱、离子交换色谱、共价色谱、疏水相互作用色谱等进行分离。载体可以纯化的纯形式获得，或者不含或基本上不含其他细胞材料或培养基等。在所述分离和/或纯化之后，抗原表现出至少80％，优选80％-90％，更优选90％-97％，最优选超过97％的纯度，直至没有任何污染的绝对纯形式。

根据另一方面，如本文所用的“获得”还可以包括作为最终配制过程的一部分的进一步完成步骤，如添加缓冲剂、灭活、中和步骤等。

在根据本发明制备免疫原性组合物的方法的另一个具体方面，异源S(刺突)蛋白的片段是刺突蛋白的胞外域。

在根据本发明的免疫原性组合物的另一特定方面中，所述药学上可接受的载体选自溶剂，分散介质，涂层，稳定剂，稀释剂，防腐剂，抗菌剂和抗真菌剂，等渗剂，吸附延迟剂，佐剂，免疫刺激剂及其组合。

在根据本发明制备免疫原性组合物的方法的另一具体方面，异源S蛋白是全长刺突蛋白。

本发明进一步涉及包含编码部分H52 IBV(传染性支气管炎病毒)基因组的核酸的质粒，所述基因组包括异源IBV S(刺突)蛋白或其片段，所述质粒例如pUC57-s H52 rIBVCR88 S Ecto供体质粒(SEQ ID NO:21)。

条款

本文还描述了以下条款：

1.编码异源IBV S(刺突)蛋白或其片段的H52 IBV(传染性支气管炎病毒)。

2.包含编码异源S(刺突)蛋白或其片段的H52 IBV(传染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物。

3.包含条款1的IBV(传染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物。

4.条款1至3中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中H52 IBV具有或由其组成或包含如EU817497(SEQ ID NO 78)所示的核苷酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、 98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

5.条款1至4中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中H52 IBV具有或由其组成或包含刺突(S1)蛋白，所述刺突蛋白具有如AF352315所示的氨基酸序列(SEQ ID NO 79) 或与其具有至少95％，96％，97％，98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％，99.95％，99.98％或99.99％序列相同性的序列。

6.IBV或第1至5条中任一条的免疫原性组合物，其中H52 IBV毒株具有或由其组成或包含刺突(S)蛋白，所述刺突蛋白具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列或与其具有至少95％，96％，97％，98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％， 99.95％，99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

7.条款1至6中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中H52 IBV具有或由其组成或包含核壳(N)蛋白，所述核壳(N)蛋白具有AY044185(SEQ ID NO 80)或AF352310(SEQ ID NO81)所示氨基酸序列或与其具有至少95％，96％，97％，98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％，99.95％，99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

8.条款1至7中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中H52 IBV具有或由其组成或包含核壳(N)蛋白，所述核壳(N)蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与其具有至少95％，96％，97％，98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％， 99.95％，99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

9.条款1至8中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中H52 IBV具有或由其组成或包含包膜(E)蛋白，所述包膜(E)蛋白具有AF317210所示氨基酸序列(SEQ ID NO 82) 或与其具有至少95％，96％，97％，98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％， 99.9％，99.95％，99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

10.条款1至9中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中H52 IBV具有或由其组成或包含包膜(E)蛋白，所述包膜(E)蛋白具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或与其具有至少95％，96％，97％，98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％，99.95％，99.98％或99.99％序列相同性的序列。

11.条款1至10中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中H52 IBV具有或由其组成或包含膜糖蛋白(M)，所述膜糖蛋白(M)具有如AF286185(SEQ ID NO 83)所示氨基酸序列或与其具有至少95％，96％，97％，98％，99％，99.2％，99.5％，99.6％，99.7％， 99.8％，99.9％，99.95％，99.98％或99.99％的序列相同性的序列。

12.条款1-11中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中H52 IBV具有或由其组成或包含膜糖蛋白(M)蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或者与其具有至少 95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、 99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的序列。

13.条款1-12中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源刺突为非Massachusetts基因型或血清型。

14.条款1-13中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自具有选自以下基因型或血清型的IBV：Arkansas(例如Arkansas 99)，Brazil(例如BR-1，BR-2，23/2013，IBV/Brasil/351/1984)，California(例如California1734/04，California99)， Connecticut，Delaware(例如Delaware 98)，Dutch(例如D207，D212，D274，D3128， D3896，D8880，D1466)，Florida，Georgia(例如Georgia GA-07，GA-08，GA-12，GA-13)， Gray，Holte，Iowa(例如Iowa 97和Iowa 69)，Italy(例如Italy 02)，JMK，LDT3，Maine (例如Maine 209)，Pennsylvania(例如Pennsylvania 1220/98，PennsylvaniaWolg/98)， PL84084，Qu(例如Qu-mv)，QX(例如GB341/96)，Q1，SE 17，变体2(例如IS/1494/06， IBV/Ck/EG/CU/4/2014，gammaCoV/Ck/Poland/G052/2016)和4/91(793B、CR88)。

15.条款1-14中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自选自如下基因型或血清型的IBV：4/91，QX，Q1，Italy 02，Arkansas，Conneticut，Georgia，LDT3，PL84084，变体2或Brazil。

16.条款1-15中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自选自如下基因型或血清型的IBV：4/91，QX，Q1，Arkansas，变体2和Brazil。

17.条款16的IBV或免疫原性组合物，其中4/91毒株选自：Spain/98/328，Spain/92/35， IR-3654-VM，FR-CR88061-88，FR-85131-85，UK-1233-95，UK/3/91， Spain/00/336，UK/7/91，4/91-致病性，4/91减毒，IB4-91和CR88。

18.条款16的IBV或免疫原性组合物，其中QX株选自：FR-L1450T-05，FR-L1450L-05，NL-L1449T-04，NL-L1449K-04，IBV/Ck/SP/170/09，IBV/Ck/SP/79/08， IBV/Ck/SP/248/09，HBN，IBVQX，LX4，BJQ，CK/CH/LGD/03和GB341/96。

19.条款16的IBV或免疫原性组合物，其中Q1株选自：CK/CH/LDL/98I， CK/CH/LSD/08-10，J2，Q1，AR08ER22，AR08BA21和Chile-295-10。

20.条款16的IBV或免疫原性组合物，其中所述Arkansas株选自：Ark99，ArkGA，ArkDPI，AL/5364/00，ARKDPI11，AL/0803/01，AL/7149/00，ArkDPI101，AL/1221/01，AL/1793/01和AL/4614/98。

21.条款16的IBV或免疫原性组合物，其中变体2毒株选自：IS/1494/06， IBV/Ck/EG/CU/4/2014，gammaCoV/Ck/Poland/G052/2016，Eg/CLEVB-2/IBV/012， D1344/2/4/10_EG，TR8和IB VAR2-06。

22.条款16的IBV或免疫原性组合物，其中所述Brazil毒株选自BR-1，BR-2，23/2013 和IBV/Brasil/351/1984。

23.条款1-22中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自4/91基因型或血清型。

24.条款1-23中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:5或6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的4/91基因型或血清型，或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:5或6所示氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的序列组成。

25.条款1-24中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:7或8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的QX基因型或血清型，或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:7 或8所示氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列组成。

26.条款1-25中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:9或10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的Q1基因型或血清型，或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:9 或10所示氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列组成。

27.条款1-26中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:11或12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的Arkansas基因型或血清型，或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:11或12所示氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列组成。

28.条款1-27中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:13或14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的变体2基因型或血清型，或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:13或14所示氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、 99.98％或99.99％的序列相同性的序列组成。

29.条款1-28中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:15或16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的Brazil基因型或血清型，或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:15或16所示氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、 99.98％或99.99％的序列相同性的序列组成。

30.条款1-29中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白或其片段选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。

31.条款1-30中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白是全长刺突蛋白。

32.条款1-31中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白的片段的长度为至少500、750、1000或1077个氨基酸。

33.条款1-32中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白的片段的长度为从N末端开始至少500、750、1000或1077个氨基酸。

34.条款1-33中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白的片段的长度为至少1000个氨基酸。

35.条款1-34中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白是刺突蛋白的胞外域。

36.条款1-35中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换同源S蛋白或其片段。

37.条款1-36中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换天然存在的S蛋白或其片段。

38.条款1-37中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换H52的S蛋白或其片段。

39.条款1-38中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。

40.条款1-39中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是灭活的。

41.条款1-40中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是经遗传工程化的。

42.条款1-41中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是重组IBV。

43.条款2-42中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗。

44.条款2-43中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。

45.条款44的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。

46.条款2-45中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在有需要的对象中有效治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。

47.条款2-46中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物保护免受异源刺突蛋白的血清型的IBV毒株攻击。

48.条款2-47中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物保护免受4/91、 QX、Q1、Arkansas、变体2或Brazil基因型毒株攻击。

49.条款2-48中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物保护免受4/91 基因型毒株攻击。

50.条款2-49中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被配制为用于单剂施用的形式。

51.条款2-50中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是经皮下、肌内、口服、卵内、通过喷雾、通过饮用水或滴眼剂施用。

52.条款2-51中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含1-10log

53.条款2-52中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2-5log

54.条款2-53中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2-4log

55.一种试剂盒，其包含条款1-54中任一项的IBV或免疫原性组合物。

56.根据条款55的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类疾病的说明书。

57.根据条款55的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于治疗和/或预防家禽疾病的说明书。

58.根据条款55的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于治疗和/或预防IB的说明书。

59.一种免疫对象的方法，包括给所述对象施用根据条款2-54中任一项的免疫原性组合物。

60.一种在有需要的对象中治疗或预防由IBV引起的临床体征的方法，包括给对象施用治疗有效量的条款2-54中任一项的免疫原性组合物。

61.一种与相同物种的未免疫对照组相比在有需要的对象中减少纤毛停滞的方法，所述方法包括给对象施用治疗有效量的根据条款2-54中任一项的免疫原性组合物。

62.条款2-54中任一项的免疫原性组合物，其用于免疫对象的方法，所述方法包括给对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。

63.条款2-54中任一项的免疫原性组合物，其用于在有需要的对象中治疗或预防由 IBV导致的临床体征的方法，所述方法包括给对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。

64.条款2-54中任一项的免疫原性组合物，其用于在有需要的对象中减少纤毛停滞的方法，所述方法包括给对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。

65.条款59-64中任一项的方法或用途，其中所述对象是禽类。

66.条款59-65中任一项的方法或用途，其中所述对象是家禽。

67.条款59-66中任一项的方法或用途，其中所述对象选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。

68.条款59-67中任一项的方法或用途，其中所述对象是鸡。

69.条款59-68中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物施用一次。

70.条款59-69中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物施用两剂或更多剂。

71.条款59-70中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物通过皮下、肌内、口服、卵内注射、通过喷雾、通过饮用水或滴眼剂施用。

72.条款59-71中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物通过滴眼剂施用。

73.条款59-72中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含1-10log

74.条款59-73中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2-5log

75.条款59-74中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2-4log

76.条款59-75中任一项的方法或用途，其中将免疫原性组合物在对象年龄的第一周内、前三天内、前两天内或在第一天内给对象施用。

77.条款59-76中任一项的方法或用途，其中将所述免疫原性组合物在对象年龄的第一天内给对象施用。

78.条款59-77中任一项的方法或用途，其中所述方法导致与相同物种未处理对照组对象相比选自如下的功效参数得以改善：预防或减少纤毛停滞，预防或减少罗音，预防或减少减蛋，预防或减少肾脏病变，预防或减少水性腹泻，预防或减轻体重降低，降低病毒载量，减少病毒脱落或其组合。

79.条款59-78中任一项的方法或用途，其中与相同物种未处理对照组对象相比，所述治疗或预防导致预防或减少纤毛停滞。

80.条款59-79中任一项的方法或用途，其中与相同物种未处理对照组对象相比，所述治疗或预防导致预防或减少肾脏病变。

81.条款59-80中任一项的方法或用途，其中所述治疗或预防与相同物种未处理对照组对象相比导致预防或减少减蛋。

82.条款1-54中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用于治疗用途。

83.条款1-54中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作免疫原或疫苗。

84.条款1-54中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作药物。

85.条款1-54中任一项的IBV或免疫原性组合物在生产药物中的用途。

86.条款1-54中任一项的IBV或免疫原性组合物在治疗和/或预防对象IBV感染中的用途。

87.一种免疫原性组合物，其包含编码异源S(刺突)蛋白或其片段的H52 IBV(传染性支气管炎病毒)，其中所述H52 IBV包含核壳(N)蛋白蛋白、包膜(E)蛋白或膜糖蛋白(M)，其具有或包含或由如下序列组成：如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、 AY044185(SEQ ID NO 80)、AF352310(SEQ ID NO 81)、AF317210(SEQ ID NO 82)或 AF286185(SEQID NO:83)所示的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％、 99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的序列，及其中异源S蛋白或其片段选自如下基因型或血清型：4、91，QX，Q1， Arkansas，变体2和Brazil，或者选自如下氨基酸序列：SEQ ID NO:5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15或16，或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的序列，或者异源S蛋白或其片段包含或由以下氨基酸序列组成： SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，或者与其具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、 99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列相同性的序列。

88.条款87的免疫原性组合物，其中所述异源S蛋白是全长刺突蛋白。

89.条款87的免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白的片段长度为从N末端开始至少500、750、1000或1077个氨基酸。

90.条款87或89的免疫原性组合物，其中所述异源S(刺突)蛋白的片段是所述刺突蛋白的胞外域。

91.条款92-95中任一项的免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。

92.一种制备用于治疗和/或预防对象中IBV感染的免疫原性组合物的方法，其包括：

a.)提供包含刺突(S)蛋白、核壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白或膜糖蛋白(M)的H52 IBV，其具有或包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO： 3、SEQID NO：4、AF352315(SEQ ID NO 79)、AY044185(SEQ ID NO 80)、AF352310 (SEQ ID NO81)、AF317210(SEQ ID NO 82)或AF286185(SEQ ID NO:83)，或者与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列；及

b.)提供异源S蛋白或其片段，其选自4/91、QX、Q1、Arkansas、变体2和Brazil 的基因型或血清型，或选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或 16所示氨基酸序列或者与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列，或提供异源S蛋白或其片段，其包含或由SEQ ID NO:5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16所示氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、 99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％的序列相同性的序列组成；及

c.)用b)的所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换a)的H52 IBV的刺突蛋白，以使H52IBV具有异源S蛋白或其片段；及

d.)获得具有异源S蛋白或其片段的所述H52 IBV；及

e.)加入药物可接受的载体。

93.条款92的方法，其中所述异源S(刺突)蛋白的片段是所述刺突蛋白的胞外域。

94.条款92或93的方法，其中所述药物可接受的载体选自溶剂，分散介质，包被剂，稳定剂，稀释剂，防腐剂，抗菌和抗真菌剂，等渗剂，吸附延迟剂，佐剂，免疫刺激剂及其组合。

95.条款92或94任一项的方法，其中所述异源S蛋白是全长刺突蛋白。

附图简述

图1与重组野生型病毒CR88和H52相比，H52 rIBV CR88 S ecto的卵内复制动力学。数据点代表每个时间点5个样本的平均值。误差线表示标准偏差。

图2纤毛停滞评分概述计算一只动物的10个环的10个单独分数的总和，在图中用一个点表示。最大纤毛停滞对应的分数为40，而没有纤毛停滞的对应分数为0。使用GraphPad Prism和常规的单向ANOVA检验计算均值和显著性(p<0.0007)。

图3肾脏组织RT-qPCR结果概述。每只禽类动物以一个数据点表示。

图4鼻拭子洗脱液RT-PCR结果概述。每只单个鸟表示为一个数据点。

图5纤毛停滞评分概述计算一只动物的10个环的10个单独分数的总和，在图中用一个点表示。最大纤毛停滞对应的分数为40，而没有纤毛停滞的对应分数为0。使用GraphPad Prism和常规的单向ANOVA检验计算均值和显著性(p<0.0001)。

序列概览

SEQ ID NO:1：H52 IBV刺突(S)蛋白。

SEQ ID NO:2：H52 IBV核壳(N)蛋白。

SEQ ID NO:3：H52 IBV包膜(E)蛋白。

SEQ ID NO:4：H52 IBV膜糖蛋白(M)。

SEQ ID NO:5和6：来自4/91基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。

SEQ ID NO:7和8：来自QX基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。

SEQ ID NO:9和10：来自Q1基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。

SEQ ID NO:11和12：来自Arkansas基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。

SEQ ID NO:13和14：来自变体2基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。

SEQ ID NO:15和16：来自Brazil基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。

SEQ ID NO:17：IBV CR88刺突蛋白核酸编码序列。

SEQ ID NO:18：IBV H52刺突蛋白胞外域核酸编码序列。

SEQ ID NO:19：pUC57-s H52 rIBV供体质粒。

SEQ ID NO:20：IBV CR88刺突蛋白胞外域核酸编码序列。

SEQ ID NO:21：pUC57-s H52 rIBV CR88 S Ecto供体质粒。

SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:77：引物。

SEQ ID NO:78：EU817497(H52 IBV核苷酸序列)

SEQ ID NO:79：AF352315(H52 IBV S蛋白氨基酸序列)

SEQ ID NO:80：AY044185(H52 IBV N蛋白氨基酸序列)

SEQ ID NO:81：AF352310(H52 IBV N蛋白氨基酸序列)

SEQ ID NO:82：AF317210(H52 IBV E蛋白氨基酸序列)

SEQ ID NO:83：AF286185(H52 IBV M蛋白氨基酸序列)

SEQ ID NO:84和85：引物

实施例

以下阐述的实施例是示例说明本发明的具体实施方案。这些实施例仅是示例，不应理解为限制本发明的范围或基本原理。

实施例1：重组IBV H52的产生，其中H52刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列由异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列置换

供体质粒的构建

详细描述了用CR88胞外域替换H52刺突蛋白胞外域的例子：IBV CR88刺突蛋白核酸编码序列(SEQ ID NO：17)由商业供应商合成。它被用作模板以取代van Beurden等人(Virol J.2017；14(1)：109)描述的在pUC57-s IBV-5-1b-S-SIR-3T供体质粒中的IBV H52刺突蛋白胞外域核酸编码序列(SEQ ID NO：18)，下文称为pUC57-s H52 rIBV供体质粒(SEQ ID NO：19)。SEQ ID NO：19的碱基1717至4941被替换为对应的IBV CR88刺突蛋白胞外域核酸编码序列(SEQ ID NO：20)，其分别对应于SEQ ID NO 15的碱基55 至3285。这样生成pUC57-s H52 rIBV CR88 S Ecto供体质粒(SEQ ID NO：21)，其中IBV CR88刺突蛋白胞外域由碱基1717至4947编码。为此，pUC57-s H52 rIBV供体质粒(SEQ ID NO：19)使用接近H52刺突蛋白编码序列的独特限制性酶切位点5'(EcoRV)和3'(PmlI) 进行消化以线性化质粒并去除H52刺突蛋白和侧翼序列。QIAquick凝胶提取试剂盒 (Qiagen)用于纯化对应于pUC57-s IBV H52骨架而没有H52刺突蛋白编码序列的条带。利用

表1由NEB用NEBuilder在线工具设计的吉布森组装引物，用于产生PCR产物以组装pUC57-s H52 rIBV CR88 S Ecto供体质粒。

靶向RNA重组及重组IBV的拯救

对于产生重组IBV，采用如van Beurden等人所述的靶向RNA重组的方法(VirolJ.2017；14(1)：109)。简而言之，如所描述的产生了H52鼠源化(m)IBV。为了生成H52 rIBVCR88 S Ecto，用H52 mIBV感染LR7细胞，并用从pUC57-s H52 rIBV CR88 S Ecto供体质粒产生的体外转录物进行电穿孔，然后将其注射到8天大的含胚胎的SPF鸡蛋中 (VALOBioMedia)。在37.5℃和60％湿度下孵育9天后，通过QIAamp病毒RNA mini 试剂盒(Qiagen)和使用带有Platinum

表2挽救后鉴定重组IBV的引物

表3确认H52 rIBV CR88 S Ecto中供体区序列的测序引物

H52重组IBV的生成和表征，其中H52刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列被另一种IBV基因型的刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列取代

应用与产生H52 rIBV CR88 S Ecto所述的方法相同的方法来产生和表征重组H52IBV，其中刺突蛋白编码序列(SEQ ID NO：19的碱基1663至5151)或H52刺突蛋白胞外域编码序列(SEQ ID NO：19的碱基1717至4941)替换为表4中列出的血清型和基因型的IBV刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列。

表4用于具有异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的H52 rIBV供体质粒的Gibson组装的引物

表2和3中的引物用于鉴定和测序不同的重组病毒，并在必要时针对相应的刺突蛋白序列进行修改。

实施例2：卵内复制动力学

为八个八天龄的含胚鸡蛋接种了10

与重组野生型病毒H52和CR88相比，H52 rIBV CR88 S Ecto在早期时间点观察到稍微相似的复制动力学。但是，在32小时后，所有病毒都达到了可比的ct值。接种后 32小时所有胚胎均存活，而在感染后48小时的时间点，所有样品的所有剩余胚均死亡。因此，与野生型病毒相比，H52 rIBV CR88 Secto的复制被认为同样有效(参见图1)。

实施例3：疫苗和攻击病毒的制备

为了证实具有异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的H52 rIBV在鸡中的效力，将等份的病毒原液解冻，在1xPBS中稀释10倍，通过将100μl每种稀释液接种到5个8天龄含胚鸡蛋中以确定50％的胚感染剂量(EID

将基因型和血清型793B、QX、Q1、Ark、变体2和Brazil的攻击病毒在10天龄的含胚SPF鸡蛋中繁殖。接种后24小时，将鸡蛋转移至4℃至少2小时。收集尿囊液，等份并储存在-80℃。如上述确定病毒效价。通过用1xPBS稀释将效价设定为10

实施例4：疫苗效力的确定

将受精的SPF鸡蛋在鸡蛋孵化器中在99.7°F和50％湿度下每小时转动一次孵育18天。在孵化的第18天，对鸡蛋进行透光检查，将受精鸡蛋转移到孵化器中，在99°F和 70％湿度下孵育直至孵出。将没有临床体征或变形的鸡随机分配为各个治疗组中，移至单独的隔离器中。至少两只鸡用作严格的阴性对照(SNC)组，将五只鸡纳入攻击对照(CC) 组，将每组至少十只鸡接种具有异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的重组IBV，随后进行攻击。将动物在符合当地和国家关于动物福利建议要求的饲养条件下饲养。光照方案调整为每天16小时光照。随意提供饲料和水。转移到隔离器后，通过滴眼剂(总体积50μl，每只眼25μl)为鸡(1天龄))接种10

对于IBV特异性RT-qPCR分析，将肾脏组织切片加热至室温，然后转移至单独的2ml Precellys管中，分别填充培养基和PBS。用

表5：气管环中纤毛停滞评分

实施例5：编码异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的重组IBV H52的效力

本项研究的目的是证明用编码异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的重组IBV H52(Mass基因型)进行疫苗接种能够赋予抵抗刺突蛋白同源攻击毒株攻击的保护作用。

研究分析了编码IBV CR88(4/91基因型)刺突蛋白胞外域的重组IBV H52(Mass基因型)是否能够赋予抵抗强毒性793B毒株(4/91基因型)攻击的保护作用，其被认为是编码的IBV CR88刺突蛋白胞外域的同源攻击物，是IBV H52骨架的异源攻击物。每天观察所有鸡的临床体征。接种或攻击后无临床体征记录。在1天龄时用H52 rIBV CR88 S Etco 接种的反向滴定确定在接种后第21天应用793B攻击病毒的效价分别为10

表6：在接种后28天和攻击后7天的纤毛停滞保护作用评分概览。通过将每组各只鸡的总得分相加，然后将组总分除以动物数量，计算出每组平均纤毛停滞得分(最高得分为40，最低得分为0)。如果10个环中有不少于9个显示出正常的纤毛活动性，则认为该动物没有受到影响。

严格阴性对照组的所有动物均表现出正常的纤毛运动，而攻击对照组的80％动物的纤毛停滞均为阳性。相反，接种H52 rIBV CR88 S Etco的动物中有82％受保护。此外，与攻击对照组动物相比，接种H52 rIBV CR88 S Etco的动物肾脏和鼻拭子的病毒载量降低(图3和图4)。

此外，分析了编码IBV QX刺突蛋白的重组IBV H52是否能够赋予针对强毒D388 QX毒株攻击的保护作用，认为其是编码的IBV QX刺突蛋白的同源攻击物，及是IBV H52骨架的异源攻击物。每天观察所有鸡的临床体征。接种或攻击后无临床体征记录。在1天龄时用CH52 rIBV QX S接种的反向滴定法确定的效价为10

表7：在接种后28天和攻击后7天纤毛停滞保护作用评分概览。通过将每组各只鸡的总得分相加，然后将组总分除以动物数量，计算出每组平均纤毛停滞得分(最高得分为40，最低得分为0)。如果10个环中有不少于9个显示出正常的纤毛活动性，则认为该动物没有受到影响。

严格阴性对照组的所有动物均表现出正常的纤毛运动，而攻击对照组的所有动物的纤毛停滞均为阳性。相反，接种H52 rIBV QX S或QX疫苗的动物100％受保护。

其他具有异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的H52 rIBV也获得了相似的结果。

这个结果突显了IBV 4/91作为有效的骨架产生具有异源刺突蛋白的重组IBV的适用性，特别是当与现有技术中IBV Beaudette骨架的数据相比时示出极佳结果。

序列表

<110> 勃林格殷格翰动物保健有限公司

<120> 具有异源刺突蛋白的H52 IBV疫苗

<130> 01-3344

<160> 85

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 1162

<212> PRT

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Ser Gly Tyr Tyr Asn Phe Asn Phe Ser Phe Leu Ser Ser Phe Gln Tyr

290 295 300

Val Glu Ser Asn Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Lys Cys Gly Phe

305 310 315 320

Arg Pro Glu Ser Ile Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val

325 330 335

Ser Leu Ala Tyr Gly Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe

340 345 350

His Gly Arg Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Asn Gly Pro Thr

355 360 365

Leu Cys Lys Gly Val Tyr Ser Gly Glu Leu Thr Arg Ser Tyr Gln Cys

370 375 380

Gly Leu Leu Val Phe Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr

385 390 395 400

Ser Thr Lys Pro Ile Val Leu Thr Gln His Asn Tyr Asn Asn Ile Thr

405 410 415

Leu Asp Arg Cys Val Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly

420 425 430

Phe Ile Thr Asn Val Thr Glu Ser Ala Ala Ala Phe Asn Tyr Leu Glu

435 440 445

Asp Gly Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Ile Phe

450 455 460

Val Val Gln Gly Glu Tyr Gly Phe Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys

465 470 475 480

Glu Asp Val Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Leu Val Gly

485 490 495

Ile Leu Thr Ser Ile Asn Gln Thr Gly Ser Gln Ser Ile Glu Asn Gln

500 505 510

Phe Tyr Val Lys Leu Thr Asn Gly Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Val

515 520 525

Ser Glu Asn Val Thr Ser Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Lys Phe Cys

530 535 540

Ile Lys Pro Asp Gly Ser Leu Ser Thr Ile Val Pro Lys Glu Leu Glu

545 550 555 560

Gln Phe Val Ala Pro Leu Leu Asn Val Thr Glu His Val Leu Ile Pro

565 570 575

Asp Ser Phe Asn Leu Thr Val Thr Asp Glu Tyr Ile Gln Thr Arg Met

580 585 590

Asp Lys Val Gln Ile Asn Cys Leu Gln Tyr Val Cys Gly Asn Ser Phe

595 600 605

Glu Cys Arg Lys Leu Phe Gln Gln Tyr Gly Pro Val Cys Asp Asn Ile

610 615 620

Leu Ser Val Val Asn Ser Val Gly Gln Lys Glu Asp Met Glu Leu Leu

625 630 635 640

Ser Phe Tyr Ser Ser Thr Lys Pro Ser Gly Ile Ser Gln Pro Leu Phe

645 650 655

Asn Asn Phe Ser Thr Gly Asp Phe Asn Ile Ser Leu Leu Leu Thr Ser

660 665 670

Pro Ser Ser Pro Ser Gly Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Thr

675 680 685

Ser Val Glu Ser Val Gly Leu Pro Thr Asp Glu Ala Tyr Lys Lys Cys

690 695 700

Thr Ser Gly Pro Leu Gly Phe Val Lys Asp Leu Val Cys Ala Arg Glu

705 710 715 720

Tyr Asn Gly Leu Leu Val Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ala Glu Met Gln

725 730 735

Thr Met Tyr Thr Ser Ser Leu Val Ala Ser Met Ala Leu Gly Gly Ile

740 745 750

Thr Ala Ala Gly Ala Ile Pro Phe Ala Thr Gln Leu Gln Ala Arg Ile

755 760 765

Asn His Leu Gly Ile Thr Gln Ser Leu Leu Met Lys Asn Gln Glu Lys

770 775 780

Ile Ala Ala Ser Phe Asn Arg Ala Ile Gly His Met Gln Glu Gly Phe

785 790 795 800

Lys Ser Thr Ser Leu Ala Leu Gln Gln Ile Gln Asp Val Val Asn Lys

805 810 815

Gln Ser Ala Ile Leu Thr Glu Thr Met Ala Ser Leu Asn Lys Asn Phe

820 825 830

Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Gln Asp Ile Tyr Gln Gln Leu Asp Val

835 840 845

Ile Gln Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg Ile Ile Thr Gly Arg Leu Ser

850 855 860

Ser Leu Ser Val Leu Ala Ser Ala Lys Gln Ser Glu Tyr Ile Ala Val

865 870 875 880

Ser Gln Gln Arg Ala Leu Ala Thr Gln Lys Ile Asn Glu Cys Val Lys

885 890 895

Ser Gln Ser Thr Arg Tyr Ser Phe Cys Gly Asn Gly Arg His Val Leu

900 905 910

Thr Ile Pro Gln Asn Ala Pro Asn Gly Ile Val Phe Ile His Phe Thr

915 920 925

Tyr Thr Pro Glu Ser Phe Val Asn Val Thr Ala Ile Val Gly Phe Cys

930 935 940

Val Lys Pro Pro Asn Ala Ser His Tyr Ala Ile Val Pro Val Asn Gly

945 950 955 960

Arg Gly Ile Phe Ile Gln Val Asn Gly Thr Tyr Tyr Ile Thr Ser Arg

965 970 975

Asp Met Tyr Met Pro Arg Asn Ile Thr Ala Gly Asp Ile Val Thr Leu

980 985 990

Thr Ser Cys Gln Ala Asn Tyr Val Ser Val Asn Lys Thr Val Ile Ser

995 1000 1005

Thr Phe Val Glu Asp Asp Asp Phe Asp Phe Asp Asp Glu Leu Ser

1010 1015 1020

Lys Trp Trp Asn Asp Thr Lys His Glu Leu Pro Asp Phe Asp Glu

1025 1030 1035

Phe Asn Tyr Thr Ile Pro Val Leu Asn Ile Ser Asn Glu Ile Asp

1040 1045 1050

Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Gly Leu Asn Asp Ser Leu Ile Asp

1055 1060 1065

Leu Glu Thr Leu Ser Ile Leu Lys Thr Tyr Ile Lys Trp Pro

1070 1075 1080

<210> 17

<211> 3495

<212> DNA

<213> 禽类传染性支气管炎病毒

<400> 17

atgttggaca aaccgctttt actagtgact ctttggtatg cactatgtag tgctttgctc 60

tatgataata atacttacgt ttactactac caaagtgcct ttaggcctgg tccaggttgg 120

cacctatatg ggggtgctta tgcagtagat agggttttta atgaaaccaa caatgcaggc 180

agtgcatctg attgcactgc tggtactttt tatgaaagcc ataatatttc tgcttcttct 240

gtagccatga cagtaccaca taatggtatg tcttggtcag cttcacaatt ttgtacagct 300

cattgtaact tctcagactt tacagtgttc gttacgcatt gttttaaaaa tcaactcggt 360

agttgtccct tgacaggtat gattcctcag aatcatattc gtatttctgc tatgagagat 420

ggagttttgt tttataactt aacagttagc gtatctaaat accctagatt taaatcgctt 480

caatgtgtta gcaattctac atctgtctat gtaaatggtg accttgtttt cacttctaat 540

gaaacttctt acgttacggg tgcaggcgtt tattttaaaa gtggtgggcc tgtaacttat 600

aaagttatga aagaagttaa agccctagcc tactttatta atggtaccgc acaagaggtt 660

attttatgtg ataactcacc tagaggtttg cttgcatgtc agtataacac tggtaatttt 720

tcagatggat tctacccttt tactaatcat tctttagtta aggataggtt tattgtatat 780

cgagaaagta gcactaacac tactttaaag ttaactaatt tcagttttac taatgtaagt 840

aatgcttctc ctaattcagg tggcgttgat actttccaat tatatcaaac aagtactgct 900

caggatggtt attataattt taatttatca tttctgagta gttttgtgta taaaccatct 960

gattttatgt atgggtcata ccacccacat tgtaagttta gaccagagaa tattaataat 1020

ggcttatggt ttaattcatt atctgtgtca cttacttacg gacccattca aggtggttgt 1080

aagcaatctg tttttagtaa tagagcaact tgttgctatg cttattctta tcaagggcct 1140

agtagatgta agggtgttta tagaggggag ctaacgcaat actttgaatg tggacttcta 1200

gtttacgtaa ctaagagtga tggctctcgt atacaaacta gaagtgaacc actggtgtta 1260

actcaatata attataacaa cattacttta aataagtgtg ttgagtataa tatatatggt 1320

agggttggtc aaggttttat tactaatgta actgaagcaa ctgctaatta tagttatcta 1380

gcagatggtg gtttagctat tttagatacc tcaggagcca tagacatatt tgttgttcaa 1440

ggtgcatatg gtcttaatta ttataaggtt aatccctgtg aagatgttaa ccaacagttt 1500

gtagtgtctg gtggcaactt agttggcatt cttacatctc ataatgaaac aggttctgaa 1560

tctattgaga accagtttta catcaaactc actaacggaa cacgtcgctc tagacgttct 1620

gttactggga atgttacaaa ttgcccttat gttagttatg gcaagttttg tataaaacca 1680

gatggttctt tatctataat agtaccacaa gaattagaac agtttgtggc gcctttattc 1740

aatgttactg agcatgtgct catacctgat agttttaatt taactgtcac agatgagtac 1800

atacaaactc gtatggataa ggttcaaatt atttgccttc agtatgtttg tggtaattct 1860

attgaatgca gaaagttgtt tcagcagtat ggacctgttt gtgataatat attgtctgtt 1920

gtaaatggtg taggtcaaag agaggatatg gaacttttaa gtttctattc ttctactaaa 1980

cctagtggtt acaatacacc aatttttaat aatgttagca ctggtgactt taatatttcg 2040

ctcctactaa caccacctaa tagtcctact gggcgctctt ttattgaaga tcttctcttt 2100

acaagtgtag aatctgttgg attaccaact gatgaagagt ataaaaagtg tacagcagga 2160

cctttaggtt ttgttaaaga ccttgtttgt gctagagagt ataatggttt gctcgttctg 2220

cctcctatta ttactgcgga aatgcaaacc atgtatacta gttctttagt agcctctatg 2280

gctttaggtg gcattactgc agctggtgct ataccttttg ctacacaact gcaggccaga 2340

attaaccatt tgggtattac taattctctt ttgttgaaaa accaagaaaa aattgctgct 2400

tcctttaata aggccatcgg tcatatgcag gaagggttta aaagtacttc tctagcatta 2460

caacagattc aagatgttgt taataaacag agttctattc ttacagagac tatgcaatca 2520

cttaataaaa attttggtgc tatttcctct gtaattcaag acatttacca gcaactagat 2580

gctattcagg cagatgctca ggttgatcgt cttattacag gtagactctc ttcactatct 2640

gttttagctt ctgctaaaca ggcagagtat catagagtgt cacaacagcg tgagttggcc 2700

actcagaaaa ttaatgagtg tgttaagtct cagtctaata ggtattcatt ttgtggtaat 2760

ggtagacatg ttctaaccat accacagaat gcacccaatg gcatagtgtt tatacacttt 2820

acatacactc cagagagttt tgttaatgtt acggcaatag tagggttttg cgtaaaccca 2880

gctaatgcta gtcattatgc aatagtgcct gttaatggca ggggtgtttt tatagaagtt 2940

aatggtagtt actatatcac tgctcgtgat atgtatatgc caagagatat tactgcagga 3000

gacatagtca ctttgacttc ttgtcaagca aactatgtta atgtaaataa aaccgtcatt 3060

aacacttttg tggaagatga cgattttgat ttttatgatg aattgtcaaa atggtggaat 3120

gatactaagc atgagctacc agattttgat gaattcaatt ataccgttcc agttttaaat 3180

attagtaatg aaattgacag aattcaacag gttattcagg gattaaatga ttccctaata 3240

gaccttgaaa cactctcaat tctcaaaact tatattaaat ggccttggta tgtgtggctt 3300

gccattgcat tccttaccat tatttttatt ctggtacttt gttggatatt tttcatgacc 3360

ggttgttgcg gttgttgttg tggatgcttt ggtatcatac cgttaatgag taagtgtggt 3420

aagaaatctt cttactacac gacttttgat aatgatgtgg taacttaaca atacagacct 3480

aaaaagtctg tttaa 3495

<210> 18

<211> 3225

<212> DNA

<213> 禽类传染性支气管炎病毒

<400> 18

gctttgtatg actcgagttc ttacgtgtac tactaccaaa gtgccttcag accacctgat 60

ggttggcatt tacatggggg tgcgtatgcg gttgttaata tttctagtga atctaataat 120

gcaggctctt catctgggtg tactgttggt attattcatg gtggtcgtgt tgttaatgct 180

tcttctatag ctatgacggc accgtcatca ggtatggctt ggtctagcag tcagttttgt 240

actgcatact gtaacttttc agatactaca gtgtttgtta cacattgtta taaacatggt 300

gggtgtccta taactggcat gcttcaacag cattctatac gtgtttctgc tatgaaaaat 360

ggccagcttt tctataattt aacagttagt gtagctaagt accctacttt taaatcattt 420

cagtgtgtta ataatttaac atccgtatat ttaaatggtg atcttgttta cacctctaat 480

gagaccacag atgttacatc tgcaggtgtt tattttaaag ctggtggacc tataacttat 540

aaagttatga gagaagttag agccctggct tattttgtta atggtactgc acaagatgtt 600

attttgtgtg atgggtcacc tagaggcttg ttagcatgcc agtataatac tggcaatttt 660

tcagatggct tttatccttt tactaatagt agtttagtta agcagaagtt tattgtctat 720

cgtgaaaata gtgttaatac tacttttacg ttacacaatt tcacttttca taatgagact 780

ggcgccaacc caaatcctag tggtgtccag aatattcaaa cttaccaaac acaaacagct 840

cagagtggtt attataattt taatttttcc tttctgagta gttttgttta taaggagtct 900

aattttatgt atggatctta tcacccaagt tgtaatttta gactagaaac tattaataat 960

ggtttgtggt ttaattcact ttcagttagt attgcttacg gtcctcttca aggtggttgc 1020

aagcaatctg tctttagtgg tagagcaacc tgttgttatg cttactcata tggaggtcct 1080

ttgctgtgta aaggtgttta ttcaggtgag ttagatcata attttgaatg tggactgtta 1140

gtttatgtta ctaagagcgg tggctctcgt atacaaacag ccactgaacc gccagttata 1200

actcaacaca attataataa tattacttta aatacttgtg ttgattataa tatatatggc 1260

agaactggcc agggttttat tactaatgta accgactcag ctgttagtta taattatcta 1320

gcagacgcag gtttggctat tttagataca tctggttcca tagacatctt tgtcgtacaa 1380

agtgaatatg gtcttaatta ttataaggtt aacccttgcg aagatgtcaa ccagcagttt 1440

gtagtttctg gtggtaaatt agtaggtatt cttacttcac gtaatgagac tggttcccag 1500

cttcttgaga atcagtttta catcaaaatc actaatggaa cacgtcgttt tagacgttct 1560

attactgaaa gtgttgaaaa ttgcccttat gttagttatg gtaagttttg tataaaacct 1620

gatggcagta ttgccacaat agtaccaaaa cagttagaac agtttgtggc acctttactt 1680

aatgttactg aaaatgtgct catacctaac agttttaatt taactgttac agatgagtac 1740

atacaaactc ggatggataa ggtccaaatt aattgcctgc agtatatttg tggcaattct 1800

ctggagtgca gaaatttgtt tcaacaatat ggtcctgttt gcgacaacat attgtctgta 1860

gtaaatagtg ttggtcaaaa agaagatatg gaacttttga atttctattc ttctactaag 1920

ccggctggtt ttaatacacc agttcttagt aatgttagca ctggtgagtt taatattact 1980

ctttttttaa caacgcctag tagtcctaga aggcgttctt ttattgaaga ccttctattt 2040

acaagtgttg aatctgttgg attaccaaca gatgacgcat acaaaaattg cactgcaggt 2100

cctttaggct ttctgaaaga ccttgcatgt gctcgtgaat ataatggttt gcttgtgttg 2160

cctcctatta taacagcaga aatgcaaact ttgtatacaa gctctctagt agcttctatg 2220

gcttttggtg gtattactgc agctggtgct ataccttttg ccacacaact gcaggctaga 2280

attaatcact tgggtattac ccagtcactt cttttgaaga atcaagaaaa aattgctgct 2340

tcctttaata aggccatcgg tcatatgcag gaaggtttta gaagtacatc tttagcatta 2400

caacaaattc aagatgttgt taataagcag agtgctattc ttactgagac tatggcatca 2460

cttaataaaa attttggtgc catttcttct gtgattcaag aaatctacca gcaacttgac 2520

gccatacaag caaatgctca agtggatcgt cttataactg gtagattgtc atcactttct 2580

gttttagcat ctgctaagca ggcggagtat attagagtgt cacaacagcg tgagttagct 2640

actcagaaga ttaatgagtg tgttaagtca cagtccatta ggtactcctt ttgtggtaat 2700

ggacgacatg ttttaaccat accgcaaaat gcacctaatg gtatagtgtt tatacacttt 2760

tcttacactc cagatagttt tgttaatgtt actgcaatag tgggtttttg tgtaaagcca 2820

gctaatgcta gtcagtatgc aatagtaccc gctaatggta ggggtatttt tatacaagtt 2880

aatggtagtt actacatcac tgcacgagat atgtatatgc caagagctat tactgcagga 2940

gatatagtta cgcttacttc ttgtcaagca aattatgtaa gtgtaaataa gaccgtcatt 3000

actacattcg tagacaatga tgattttgat tttaatgacg aattgtcaaa atggtggaat 3060

gatactaagc atgagctacc agactttgac aaattcaatt acacagtacc tatacttgac 3120

attgatagtg aaattgatcg tattcaaggc gttatacagg gtcttaatga ctctctaata 3180

gaccttgaaa aactttcaat actcaaaact tatattaagt ggcct 3225

<210> 19

<211> 11398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有IBV的质粒序列

<400> 19

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420

tgcgtcgaga tcggccgccc gggtaatacg actcactata gggacttaag atagatatta 480

atatatatct attgcactag ccttgcgcta gatttcaaac ttaacaaaac ggacttaaat 540

acctacagct ggtccccata ggtgttccat tgcagtgcac tttagtgccc tggatggcac 600

ctggccacct gtcaggtttt tgttgttaaa atatcattgt tgctggtatc actgcttgtt 660

ttgccgtgtc tcactttata catccgttgc ttgggctacc tagtatccag cgtcctacgg 720

gcgccgtggt cggttcgagt gcgaaggacc tctggttcat ctagcggtag gcgggtgtgt 780

ggaagtagcg cttcagacgt actggttctg ttgcgtgaaa cgcggggtca cctcccccca 840

catacctcta agggcttttg agcctagcgt tgggctacgt tctcgcacaa ggtcggctat 900

acgacgtttg tagggggtag tgccaaacaa cccctgaggt gacaggttct ggtggtgttt 960

cgaaaacaac aatgtgtgtg ccgcataata tgcgcgttat gcattttgga gcaggtagtg 1020

ataaaggagt ggcgcctggt agtactgttc ttaaacagtg gctccccgaa ggaacactcc 1080

ttgtcgataa tgatattgta gattatgttt ctgacgcaca cgtttctgtg ctttcagatt 1140

gcaataaata taagacagag cacaagtttg atcttgtgat atctgatatg tatacagaca 1200

atgattcaaa aagaaagcat gaaggcgtga tagccaataa tggcaatgat gacgtcttca 1260

tatacctttc aagttttcta cgcaataatt tggctctggg aggcagtttt gctgtaaaat 1320

taacagagac aagttggcat gagagtttat atgacattgc acaggattgt gcatggtgga 1380

caatgttttg tacagcagtg aatgcatctt cttcagaagc attcctgatt ggtgttaatt 1440

acttgggtgc aagtgcaaag gttaaagtta gtggaaaaac actgcacgca aattatatat 1500

tttggaggaa ttgtaattat ttacaaacct ctgcttatag tatatttgat gttgctaagt 1560

ttgatttgag attgaaagca acgccagttg ttaatcttaa gactgaacaa aagacagact 1620

tagtctttaa tttgataaag tgtggtaagt tactggtaag agatgttggt aacacctctt 1680

ttactagtga ctcttttgtg tgcactatgt agtgctgctt tgtatgactc gagttcttac 1740

gtgtactact accaaagtgc cttcagacca cctgatggtt ggcatttaca tgggggtgcg 1800

tatgcggttg ttaatatttc tagtgaatct aataatgcag gctcttcatc tgggtgtact 1860

gttggtatta ttcatggtgg tcgtgttgtt aatgcttctt ctatagctat gacggcaccg 1920

tcatcaggta tggcttggtc tagcagtcag ttttgtactg catactgtaa cttttcagat 1980

actacagtgt ttgttacaca ttgttataaa catggtgggt gtcctataac tggcatgctt 2040

caacagcatt ctatacgtgt ttctgctatg aaaaatggcc agcttttcta taatttaaca 2100

gttagtgtag ctaagtaccc tacttttaaa tcatttcagt gtgttaataa tttaacatcc 2160

gtatatttaa atggtgatct tgtttacacc tctaatgaga ccacagatgt tacatctgca 2220

ggtgtttatt ttaaagctgg tggacctata acttataaag ttatgagaga agttagagcc 2280

ctggcttatt ttgttaatgg tactgcacaa gatgttattt tgtgtgatgg gtcacctaga 2340

ggcttgttag catgccagta taatactggc aatttttcag atggctttta tccttttact 2400

aatagtagtt tagttaagca gaagtttatt gtctatcgtg aaaatagtgt taatactact 2460

tttacgttac acaatttcac ttttcataat gagactggcg ccaacccaaa tcctagtggt 2520

gtccagaata ttcaaactta ccaaacacaa acagctcaga gtggttatta taattttaat 2580

ttttcctttc tgagtagttt tgtttataag gagtctaatt ttatgtatgg atcttatcac 2640

ccaagttgta attttagact agaaactatt aataatggtt tgtggtttaa ttcactttca 2700

gttagtattg cttacggtcc tcttcaaggt ggttgcaagc aatctgtctt tagtggtaga 2760

gcaacctgtt gttatgctta ctcatatgga ggtcctttgc tgtgtaaagg tgtttattca 2820

ggtgagttag atcataattt tgaatgtgga ctgttagttt atgttactaa gagcggtggc 2880

tctcgtatac aaacagccac tgaaccgcca gttataactc aacacaatta taataatatt 2940

actttaaata cttgtgttga ttataatata tatggcagaa ctggccaggg ttttattact 3000

aatgtaaccg actcagctgt tagttataat tatctagcag acgcaggttt ggctatttta 3060

gatacatctg gttccataga catctttgtc gtacaaagtg aatatggtct taattattat 3120

aaggttaacc cttgcgaaga tgtcaaccag cagtttgtag tttctggtgg taaattagta 3180

ggtattctta cttcacgtaa tgagactggt tcccagcttc ttgagaatca gttttacatc 3240

aaaatcacta atggaacacg tcgttttaga cgttctatta ctgaaagtgt tgaaaattgc 3300

ccttatgtta gttatggtaa gttttgtata aaacctgatg gcagtattgc cacaatagta 3360

ccaaaacagt tagaacagtt tgtggcacct ttacttaatg ttactgaaaa tgtgctcata 3420

cctaacagtt ttaatttaac tgttacagat gagtacatac aaactcggat ggataaggtc 3480

caaattaatt gcctgcagta tatttgtggc aattctctgg agtgcagaaa tttgtttcaa 3540

caatatggtc ctgtttgcga caacatattg tctgtagtaa atagtgttgg tcaaaaagaa 3600

gatatggaac ttttgaattt ctattcttct actaagccgg ctggttttaa tacaccagtt 3660

cttagtaatg ttagcactgg tgagtttaat attactcttt ttttaacaac gcctagtagt 3720

cctagaaggc gttcttttat tgaagacctt ctatttacaa gtgttgaatc tgttggatta 3780

ccaacagatg acgcatacaa aaattgcact gcaggtcctt taggctttct gaaagacctt 3840

gcatgtgctc gtgaatataa tggtttgctt gtgttgcctc ctattataac agcagaaatg 3900

caaactttgt atacaagctc tctagtagct tctatggctt ttggtggtat tactgcagct 3960

ggtgctatac cttttgccac acaactgcag gctagaatta atcacttggg tattacccag 4020

tcacttcttt tgaagaatca agaaaaaatt gctgcttcct ttaataaggc catcggtcat 4080

atgcaggaag gttttagaag tacatcttta gcattacaac aaattcaaga tgttgttaat 4140

aagcagagtg ctattcttac tgagactatg gcatcactta ataaaaattt tggtgccatt 4200

tcttctgtga ttcaagaaat ctaccagcaa cttgacgcca tacaagcaaa tgctcaagtg 4260

gatcgtctta taactggtag attgtcatca ctttctgttt tagcatctgc taagcaggcg 4320

gagtatatta gagtgtcaca acagcgtgag ttagctactc agaagattaa tgagtgtgtt 4380

aagtcacagt ccattaggta ctccttttgt ggtaatggac gacatgtttt aaccataccg 4440

caaaatgcac ctaatggtat agtgtttata cacttttctt acactccaga tagttttgtt 4500

aatgttactg caatagtggg tttttgtgta aagccagcta atgctagtca gtatgcaata 4560

gtacccgcta atggtagggg tatttttata caagttaatg gtagttacta catcactgca 4620

cgagatatgt atatgccaag agctattact gcaggagata tagttacgct tacttcttgt 4680

caagcaaatt atgtaagtgt aaataagacc gtcattacta cattcgtaga caatgatgat 4740

tttgatttta atgacgaatt gtcaaaatgg tggaatgata ctaagcatga gctaccagac 4800

tttgacaaat tcaattacac agtacctata cttgacattg atagtgaaat tgatcgtatt 4860

caaggcgtta tacagggtct taatgactct ctaatagacc ttgaaaaact ttcaatactc 4920

aaaacttata ttaagtggcc ttggtatgtg tggctagcca tagcttttgc cactattatc 4980

ttcatcttaa tattaggatg ggttttcttc atgactgggt gttgtggttg ttgttgtgga 5040

tgctttggca ttatgcctct aatgagtaag tgtggtaaga aatcttctta ttacacgact 5100

tttgataacg atgtggtaac tgaacaatac agacctaaaa agtctgttta atgatccaaa 5160

gtcccactag tttcttaata gtattaattt tgctttggtg taaacttgta ctaagttgtt 5220

ttagagagtt tattattgcc cttcaacaac taacacaagt tttactccaa attatcgata 5280

gtaatttaca gtctagactg accctttggc acagtctaga ctaatgttaa acttagaagc 5340

aattattgaa accggtgatc aagtgattca aaaaatcagt ttcaatttac agcatatttc 5400

aagtgtatta aacacagaag tatttgaccc ctttgactat tgttattaca gaggaggtaa 5460

tttttgggaa atagagtcag ctgaagattg ttcaggtgat gatgaattta ttgaataagt 5520

cgctagagga gaatggaagt tttctaacgg cactttacat atttgtagga tttttagcat 5580

tttatcttct aggtagagca cttcaagcat ttgtacaggc tgctgatgct tgttgtttat 5640

tttggtacac gtggttagta attccaggag ttaagggtac agcctttgta tacaagtata 5700

catatggtag aaaacttaac aattcggaat tagaagcagt tgttgttaac gagtttccta 5760

agaacggttg gaataataaa aatccagcaa attttcaaga tgtccaacga aacaaattgt 5820

actcttgact ttgaacagtc agttgagctt tttaaagagt ataatttatt tataactgca 5880

ttcttgttgt tcttaaccat aatacttcag tatggttatg caacgcgtag taagtttatt 5940

tatatactta aaatgatagt gttatggtgc ttttggcccc ttaacattgc agtaggtgta 6000

atttcatgta tatacccacc aaacacagga ggtcttgtcg cagcgataat acttactgtg 6060

tttgcgtgtc tttcttttgt aggttattgg atccagagta ttagactctt taagcggtgt 6120

agatcttggt ggtcatttaa cccagaatct aacgccgtag gttcaatact cctaactaat 6180

ggtcaacaat gtaattttgc tatagagagt gtgccgatgg tgctttctcc tattataaag 6240

aatggtgttc tttattgtga gggtcagtgg cttgctaaat gtgaaccaga ccacttgcct 6300

aaagacatat ttgtatgcac accagataga cgtaatatct atcgtatggt gcagaaatac 6360

actggtgacc aaagcggaaa taagaaaagg tttgctacat ttgtctatgc aaagcagtca 6420

gtagacactg gcgagctaga aagtgtagca acaggtggaa gtagccttta cacataaatg 6480

tgtgtgtgta gagagtattt aaaattattc ttcaatagtg cctctatttt aagagcgcgg 6540

aagagtattt gttttgagga tattaatata aatcctcttt gttttgtact ctctttacaa 6600

gagttattat ttaagcaaca gtttttcctt tcctttgttt ggaagaaagt tgttgttaat 6660

ggtgtagaat tccaagtaga aaatggaaaa gtccactacg aaggaaaccc cattttccaa 6720

aaaggttgtt gtaggttgtg gtcccattat aagaaggatt aaatggatta aaccacctac 6780

actacttact tgtaataagg gcgtttggac ttacaagcgc ttaacaaata cagacgatga 6840

aatggctgac tagttttgga agagcagtta tttcttgtta taaagcccta ctattaactc 6900

agttaagagt attagatagg ttaattttag atcacggacc aaagcgagtc ttaacgtgtg 6960

gtaggcgagt gcttttatct caattagatt tagtttatag gttggcatat acgcccaccc 7020

aatcgctggt atgaataata gtaaagataa tccttttcgc ggagcaatag caagaaaagc 7080

gcgaatttat ctgagagaag gattagagtg tgtttacttt cttaacaaag caggacaagc 7140

agagccttgt cccgcgtgta cctccctagt atttcagggg aaaacttgtg aggaacacac 7200

agataataat aatcttttgt catggcgagc ggtaagacaa ctgggaagac agacgcccca 7260

gcgccagtca tcaaactagg agggccaaaa ccacctaaag ttggttcttc tggaaatgct 7320

agctggtttc aagcactaaa agccaagaag ttaaattcac ctcctcctaa gtttgaaggt 7380

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tattacactg gaacaggacc agccgctgac ctgaattggg gtgatagcca agatggtata 7560

gtgtgggttt ctgcaaaggg tgctgatact aaatctagat ctaaccaggg tacaagggat 7620

cctgataagt ttgaccaata cccgctacga ttctcagatg gaggacctga tggtaatttc 7680

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cctggttata aggttgatca agtatttggt ccccgtacta aaggtaagga gggaaatttt 7980

ggtgatgaca agatgaatga ggagggtatt aaggatgggc gcgttacagc aatgctcaac 8040

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gataattatg tgaaaatttg tgatcagtgt gtcgatggtg tagggactcg gccaaaagac 8220

gatgaaccga gaccaaagtc acgcccaaat tcaagacctg ctacaagaac aagttctcca 8280

gcgccaagac aacagcgtca aaagaaggag aagaagtcaa agaagcagga tgatgaagta 8340

gataaggcat tgacctcaga tgaggagagg aacaatgcac agctggaatt tgatgatgaa 8400

ccgaaagtga ttaactgggg ggattcagca cttggagaga atgagttgta aagctagatt 8460

tccaacttaa catcatggac gtgcgtatgc tgtttttccc tactatagac tttttagcat 8520

attatttttt gctatttgta tggtttatta caggtgaaga ttgtatgtat ttgttgtaca 8580

ctcgtatgtt ctatattatg ttttctgtag ttgttattag tgttgttctt gttcttactc 8640

tactgttctc ttttctttat tttagagtat caataagaat caaggaagat aggcatgtag 8700

tttgattacc tacatgtcta tcgccaggga aatgtctaat ctgtctactt agtagcctgg 8760

aaacgaacgg tagaccctta gattttaatt tagtttaatt tttagtttag tttaagttag 8820

tttagagtag gtataaagaa gccagtgccg gggccacgcg gagtacgatc gagggtacag 8880

cactaggacg cccactaggg gaagagctaa attttagttt aagttaagtt taattggcta 8940

agtatagtta aaatttatag gctagtatag agttagagca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9000

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9060

aaaaaaaaaa aaaaaaaaag tttaaactta attaagaatt cccttggctc gagttcgaaa 9120

tcggatgccg ggaccgacga gtgcagaggc gtgcaagcga gcttggcgta atcatggtca 9180

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 9240

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 9300

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 9360

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 9420

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 9480

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 9540

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 9600

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 9660

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 9720

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 9780

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 9840

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 9900

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 9960

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 10020

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 10080

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 10140

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 10200

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 10260

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 10320

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 10380

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 10440

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 10500

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 10560

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 10620

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 10680

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 10740

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 10800

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 10860

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 10920

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 10980

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 11040

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 11100

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 11160

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 11220

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 11280

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 11340

accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 11398

<210> 20

<211> 3231

<212> DNA

<213> 禽类传染性支气管炎病毒

<400> 20

ttgctctatg ataataatac ttacgtttac tactaccaaa gtgcctttag gcctggtcca 60

ggttggcacc tatatggggg tgcttatgca gtagataggg tttttaatga aaccaacaat 120

gcaggcagtg catctgattg cactgctggt actttttatg aaagccataa tatttctgct 180

tcttctgtag ccatgacagt accacataat ggtatgtctt ggtcagcttc acaattttgt 240

acagctcatt gtaacttctc agactttaca gtgttcgtta cgcattgttt taaaaatcaa 300

ctcggtagtt gtcccttgac aggtatgatt cctcagaatc atattcgtat ttctgctatg 360

agagatggag ttttgtttta taacttaaca gttagcgtat ctaaataccc tagatttaaa 420

tcgcttcaat gtgttagcaa ttctacatct gtctatgtaa atggtgacct tgttttcact 480

tctaatgaaa cttcttacgt tacgggtgca ggcgtttatt ttaaaagtgg tgggcctgta 540

acttataaag ttatgaaaga agttaaagcc ctagcctact ttattaatgg taccgcacaa 600

gaggttattt tatgtgataa ctcacctaga ggtttgcttg catgtcagta taacactggt 660

aatttttcag atggattcta cccttttact aatcattctt tagttaagga taggtttatt 720

gtatatcgag aaagtagcac taacactact ttaaagttaa ctaatttcag ttttactaat 780

gtaagtaatg cttctcctaa ttcaggtggc gttgatactt tccaattata tcaaacaagt 840

actgctcagg atggttatta taattttaat ttatcatttc tgagtagttt tgtgtataaa 900

ccatctgatt ttatgtatgg gtcataccac ccacattgta agtttagacc agagaatatt 960

aataatggct tatggtttaa ttcattatct gtgtcactta cttacggacc cattcaaggt 1020

ggttgtaagc aatctgtttt tagtaataga gcaacttgtt gctatgctta ttcttatcaa 1080

gggcctagta gatgtaaggg tgtttataga ggggagctaa cgcaatactt tgaatgtgga 1140

cttctagttt acgtaactaa gagtgatggc tctcgtatac aaactagaag tgaaccactg 1200

gtgttaactc aatataatta taacaacatt actttaaata agtgtgttga gtataatata 1260

tatggtaggg ttggtcaagg ttttattact aatgtaactg aagcaactgc taattatagt 1320

tatctagcag atggtggttt agctatttta gatacctcag gagccataga catatttgtt 1380

gttcaaggtg catatggtct taattattat aaggttaatc cctgtgaaga tgttaaccaa 1440

cagtttgtag tgtctggtgg caacttagtt ggcattctta catctcataa tgaaacaggt 1500

tctgaatcta ttgagaacca gttttacatc aaactcacta acggaacacg tcgctctaga 1560

cgttctgtta ctgggaatgt tacaaattgc ccttatgtta gttatggcaa gttttgtata 1620

aaaccagatg gttctttatc tataatagta ccacaagaat tagaacagtt tgtggcgcct 1680

ttattcaatg ttactgagca tgtgctcata cctgatagtt ttaatttaac tgtcacagat 1740

gagtacatac aaactcgtat ggataaggtt caaattattt gccttcagta tgtttgtggt 1800

aattctattg aatgcagaaa gttgtttcag cagtatggac ctgtttgtga taatatattg 1860

tctgttgtaa atggtgtagg tcaaagagag gatatggaac ttttaagttt ctattcttct 1920

actaaaccta gtggttacaa tacaccaatt tttaataatg ttagcactgg tgactttaat 1980

atttcgctcc tactaacacc acctaatagt cctactgggc gctcttttat tgaagatctt 2040

ctctttacaa gtgtagaatc tgttggatta ccaactgatg aagagtataa aaagtgtaca 2100

gcaggacctt taggttttgt taaagacctt gtttgtgcta gagagtataa tggtttgctc 2160

gttctgcctc ctattattac tgcggaaatg caaaccatgt atactagttc tttagtagcc 2220

tctatggctt taggtggcat tactgcagct ggtgctatac cttttgctac acaactgcag 2280

gccagaatta accatttggg tattactaat tctcttttgt tgaaaaacca agaaaaaatt 2340

gctgcttcct ttaataaggc catcggtcat atgcaggaag ggtttaaaag tacttctcta 2400

gcattacaac agattcaaga tgttgttaat aaacagagtt ctattcttac agagactatg 2460

caatcactta ataaaaattt tggtgctatt tcctctgtaa ttcaagacat ttaccagcaa 2520

ctagatgcta ttcaggcaga tgctcaggtt gatcgtctta ttacaggtag actctcttca 2580

ctatctgttt tagcttctgc taaacaggca gagtatcata gagtgtcaca acagcgtgag 2640

ttggccactc agaaaattaa tgagtgtgtt aagtctcagt ctaataggta ttcattttgt 2700

ggtaatggta gacatgttct aaccatacca cagaatgcac ccaatggcat agtgtttata 2760

cactttacat acactccaga gagttttgtt aatgttacgg caatagtagg gttttgcgta 2820

aacccagcta atgctagtca ttatgcaata gtgcctgtta atggcagggg tgtttttata 2880

gaagttaatg gtagttacta tatcactgct cgtgatatgt atatgccaag agatattact 2940

gcaggagaca tagtcacttt gacttcttgt caagcaaact atgttaatgt aaataaaacc 3000

gtcattaaca cttttgtgga agatgacgat tttgattttt atgatgaatt gtcaaaatgg 3060

tggaatgata ctaagcatga gctaccagat tttgatgaat tcaattatac cgttccagtt 3120

ttaaatatta gtaatgaaat tgacagaatt caacaggtta ttcagggatt aaatgattcc 3180

ctaatagacc ttgaaacact ctcaattctc aaaacttata ttaaatggcc t 3231

<210> 21

<211> 11404

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有IBV的质粒

<400> 21

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420

tgcgtcgaga tcggccgccc gggtaatacg actcactata gggacttaag atagatatta 480

atatatatct attgcactag ccttgcgcta gatttcaaac ttaacaaaac ggacttaaat 540

acctacagct ggtccccata ggtgttccat tgcagtgcac tttagtgccc tggatggcac 600

ctggccacct gtcaggtttt tgttgttaaa atatcattgt tgctggtatc actgcttgtt 660

ttgccgtgtc tcactttata catccgttgc ttgggctacc tagtatccag cgtcctacgg 720

gcgccgtggt cggttcgagt gcgaaggacc tctggttcat ctagcggtag gcgggtgtgt 780

ggaagtagcg cttcagacgt actggttctg ttgcgtgaaa cgcggggtca cctcccccca 840

catacctcta agggcttttg agcctagcgt tgggctacgt tctcgcacaa ggtcggctat 900

acgacgtttg tagggggtag tgccaaacaa cccctgaggt gacaggttct ggtggtgttt 960

cgaaaacaac aatgtgtgtg ccgcataata tgcgcgttat gcattttgga gcaggtagtg 1020

ataaaggagt ggcgcctggt agtactgttc ttaaacagtg gctccccgaa ggaacactcc 1080

ttgtcgataa tgatattgta gattatgttt ctgacgcaca cgtttctgtg ctttcagatt 1140

gcaataaata taagacagag cacaagtttg atcttgtgat atctgatatg tatacagaca 1200

atgattcaaa aagaaagcat gaaggcgtga tagccaataa tggcaatgat gacgtcttca 1260

tatacctttc aagttttcta cgcaataatt tggctctggg aggcagtttt gctgtaaaat 1320

taacagagac aagttggcat gagagtttat atgacattgc acaggattgt gcatggtgga 1380

caatgttttg tacagcagtg aatgcatctt cttcagaagc attcctgatt ggtgttaatt 1440

acttgggtgc aagtgcaaag gttaaagtta gtggaaaaac actgcacgca aattatatat 1500

tttggaggaa ttgtaattat ttacaaacct ctgcttatag tatatttgat gttgctaagt 1560

ttgatttgag attgaaagca acgccagttg ttaatcttaa gactgaacaa aagacagact 1620

tagtctttaa tttgataaag tgtggtaagt tactggtaag agatgttggt aacacctctt 1680

ttactagtga ctcttttgtg tgcactatgt agtgctttgc tctatgataa taatacttac 1740

gtttactact accaaagtgc ctttaggcct ggtccaggtt ggcacctata tgggggtgct 1800

tatgcagtag atagggtttt taatgaaacc aacaatgcag gcagtgcatc tgattgcact 1860

gctggtactt tttatgaaag ccataatatt tctgcttctt ctgtagccat gacagtacca 1920

cataatggta tgtcttggtc agcttcacaa ttttgtacag ctcattgtaa cttctcagac 1980

tttacagtgt tcgttacgca ttgttttaaa aatcaactcg gtagttgtcc cttgacaggt 2040

atgattcctc agaatcatat tcgtatttct gctatgagag atggagtttt gttttataac 2100

ttaacagtta gcgtatctaa ataccctaga tttaaatcgc ttcaatgtgt tagcaattct 2160

acatctgtct atgtaaatgg tgaccttgtt ttcacttcta atgaaacttc ttacgttacg 2220

ggtgcaggcg tttattttaa aagtggtggg cctgtaactt ataaagttat gaaagaagtt 2280

aaagccctag cctactttat taatggtacc gcacaagagg ttattttatg tgataactca 2340

cctagaggtt tgcttgcatg tcagtataac actggtaatt tttcagatgg attctaccct 2400

tttactaatc attctttagt taaggatagg tttattgtat atcgagaaag tagcactaac 2460

actactttaa agttaactaa tttcagtttt actaatgtaa gtaatgcttc tcctaattca 2520

ggtggcgttg atactttcca attatatcaa acaagtactg ctcaggatgg ttattataat 2580

tttaatttat catttctgag tagttttgtg tataaaccat ctgattttat gtatgggtca 2640

taccacccac attgtaagtt tagaccagag aatattaata atggcttatg gtttaattca 2700

ttatctgtgt cacttactta cggacccatt caaggtggtt gtaagcaatc tgtttttagt 2760

aatagagcaa cttgttgcta tgcttattct tatcaagggc ctagtagatg taagggtgtt 2820

tatagagggg agctaacgca atactttgaa tgtggacttc tagtttacgt aactaagagt 2880

gatggctctc gtatacaaac tagaagtgaa ccactggtgt taactcaata taattataac 2940

aacattactt taaataagtg tgttgagtat aatatatatg gtagggttgg tcaaggtttt 3000

attactaatg taactgaagc aactgctaat tatagttatc tagcagatgg tggtttagct 3060

attttagata cctcaggagc catagacata tttgttgttc aaggtgcata tggtcttaat 3120

tattataagg ttaatccctg tgaagatgtt aaccaacagt ttgtagtgtc tggtggcaac 3180

ttagttggca ttcttacatc tcataatgaa acaggttctg aatctattga gaaccagttt 3240

tacatcaaac tcactaacgg aacacgtcgc tctagacgtt ctgttactgg gaatgttaca 3300

aattgccctt atgttagtta tggcaagttt tgtataaaac cagatggttc tttatctata 3360

atagtaccac aagaattaga acagtttgtg gcgcctttat tcaatgttac tgagcatgtg 3420

ctcatacctg atagttttaa tttaactgtc acagatgagt acatacaaac tcgtatggat 3480

aaggttcaaa ttatttgcct tcagtatgtt tgtggtaatt ctattgaatg cagaaagttg 3540

tttcagcagt atggacctgt ttgtgataat atattgtctg ttgtaaatgg tgtaggtcaa 3600

agagaggata tggaactttt aagtttctat tcttctacta aacctagtgg ttacaataca 3660

ccaattttta ataatgttag cactggtgac tttaatattt cgctcctact aacaccacct 3720

aatagtccta ctgggcgctc ttttattgaa gatcttctct ttacaagtgt agaatctgtt 3780

ggattaccaa ctgatgaaga gtataaaaag tgtacagcag gacctttagg ttttgttaaa 3840

gaccttgttt gtgctagaga gtataatggt ttgctcgttc tgcctcctat tattactgcg 3900

gaaatgcaaa ccatgtatac tagttcttta gtagcctcta tggctttagg tggcattact 3960

gcagctggtg ctataccttt tgctacacaa ctgcaggcca gaattaacca tttgggtatt 4020

actaattctc ttttgttgaa aaaccaagaa aaaattgctg cttcctttaa taaggccatc 4080

ggtcatatgc aggaagggtt taaaagtact tctctagcat tacaacagat tcaagatgtt 4140

gttaataaac agagttctat tcttacagag actatgcaat cacttaataa aaattttggt 4200

gctatttcct ctgtaattca agacatttac cagcaactag atgctattca ggcagatgct 4260

caggttgatc gtcttattac aggtagactc tcttcactat ctgttttagc ttctgctaaa 4320

caggcagagt atcatagagt gtcacaacag cgtgagttgg ccactcagaa aattaatgag 4380

tgtgttaagt ctcagtctaa taggtattca ttttgtggta atggtagaca tgttctaacc 4440

ataccacaga atgcacccaa tggcatagtg tttatacact ttacatacac tccagagagt 4500

tttgttaatg ttacggcaat agtagggttt tgcgtaaacc cagctaatgc tagtcattat 4560

gcaatagtgc ctgttaatgg caggggtgtt tttatagaag ttaatggtag ttactatatc 4620

actgctcgtg atatgtatat gccaagagat attactgcag gagacatagt cactttgact 4680

tcttgtcaag caaactatgt taatgtaaat aaaaccgtca ttaacacttt tgtggaagat 4740

gacgattttg atttttatga tgaattgtca aaatggtgga atgatactaa gcatgagcta 4800

ccagattttg atgaattcaa ttataccgtt ccagttttaa atattagtaa tgaaattgac 4860

agaattcaac aggttattca gggattaaat gattccctaa tagaccttga aacactctca 4920

attctcaaaa cttatattaa atggccttgg tatgtgtggc tagccatagc ttttgccact 4980

attatcttca tcttaatatt aggatgggtt ttcttcatga ctgggtgttg tggttgttgt 5040

tgtggatgct ttggcattat gcctctaatg agtaagtgtg gtaagaaatc ttcttattac 5100

acgacttttg ataacgatgt ggtaactgaa caatacagac ctaaaaagtc tgtttaatga 5160

tccaaagtcc cactagtttc ttaatagtat taattttgct ttggtgtaaa cttgtactaa 5220

gttgttttag agagtttatt attgcccttc aacaactaac acaagtttta ctccaaatta 5280

tcgatagtaa tttacagtct agactgaccc tttggcacag tctagactaa tgttaaactt 5340

agaagcaatt attgaaaccg gtgatcaagt gattcaaaaa atcagtttca atttacagca 5400

tatttcaagt gtattaaaca cagaagtatt tgaccccttt gactattgtt attacagagg 5460

aggtaatttt tgggaaatag agtcagctga agattgttca ggtgatgatg aatttattga 5520

ataagtcgct agaggagaat ggaagttttc taacggcact ttacatattt gtaggatttt 5580

tagcatttta tcttctaggt agagcacttc aagcatttgt acaggctgct gatgcttgtt 5640

gtttattttg gtacacgtgg ttagtaattc caggagttaa gggtacagcc tttgtataca 5700

agtatacata tggtagaaaa cttaacaatt cggaattaga agcagttgtt gttaacgagt 5760

ttcctaagaa cggttggaat aataaaaatc cagcaaattt tcaagatgtc caacgaaaca 5820

aattgtactc ttgactttga acagtcagtt gagcttttta aagagtataa tttatttata 5880

actgcattct tgttgttctt aaccataata cttcagtatg gttatgcaac gcgtagtaag 5940

tttatttata tacttaaaat gatagtgtta tggtgctttt ggccccttaa cattgcagta 6000

ggtgtaattt catgtatata cccaccaaac acaggaggtc ttgtcgcagc gataatactt 6060

actgtgtttg cgtgtctttc ttttgtaggt tattggatcc agagtattag actctttaag 6120

cggtgtagat cttggtggtc atttaaccca gaatctaacg ccgtaggttc aatactccta 6180

actaatggtc aacaatgtaa ttttgctata gagagtgtgc cgatggtgct ttctcctatt 6240

ataaagaatg gtgttcttta ttgtgagggt cagtggcttg ctaaatgtga accagaccac 6300

ttgcctaaag acatatttgt atgcacacca gatagacgta atatctatcg tatggtgcag 6360

aaatacactg gtgaccaaag cggaaataag aaaaggtttg ctacatttgt ctatgcaaag 6420

cagtcagtag acactggcga gctagaaagt gtagcaacag gtggaagtag cctttacaca 6480

taaatgtgtg tgtgtagaga gtatttaaaa ttattcttca atagtgcctc tattttaaga 6540

gcgcggaaga gtatttgttt tgaggatatt aatataaatc ctctttgttt tgtactctct 6600

ttacaagagt tattatttaa gcaacagttt ttcctttcct ttgtttggaa gaaagttgtt 6660

gttaatggtg tagaattcca agtagaaaat ggaaaagtcc actacgaagg aaaccccatt 6720

ttccaaaaag gttgttgtag gttgtggtcc cattataaga aggattaaat ggattaaacc 6780

acctacacta cttacttgta ataagggcgt ttggacttac aagcgcttaa caaatacaga 6840

cgatgaaatg gctgactagt tttggaagag cagttatttc ttgttataaa gccctactat 6900

taactcagtt aagagtatta gataggttaa ttttagatca cggaccaaag cgagtcttaa 6960

cgtgtggtag gcgagtgctt ttatctcaat tagatttagt ttataggttg gcatatacgc 7020

ccacccaatc gctggtatga ataatagtaa agataatcct tttcgcggag caatagcaag 7080

aaaagcgcga atttatctga gagaaggatt agagtgtgtt tactttctta acaaagcagg 7140

acaagcagag ccttgtcccg cgtgtacctc cctagtattt caggggaaaa cttgtgagga 7200

acacacagat aataataatc ttttgtcatg gcgagcggta agacaactgg gaagacagac 7260

gccccagcgc cagtcatcaa actaggaggg ccaaaaccac ctaaagttgg ttcttctgga 7320

aatgctagct ggtttcaagc actaaaagcc aagaagttaa attcacctcc tcctaagttt 7380

gaaggtagcg gcgttcctga taatgaaaat cttaaattaa gccagcaaca tgggtactgg 7440

agacgtcaag ccaggtacaa gccaggtaaa ggcggaagaa aatcagtccc agatgcttgg 7500

tacttctatt acactggaac aggaccagcc gctgacctga attggggtga tagccaagat 7560

ggtatagtgt gggtttctgc aaagggtgct gatactaaat ctagatctaa ccagggtaca 7620

agggatcctg ataagtttga ccaatacccg ctacgattct cagatggagg acctgatggt 7680

aatttccgtt gggacttcat tccaataaat cgtggtagga gtggaagatc aacagcggct 7740

tcatcagcag catctagtag agcaccgtcg cgtgatggct cgcgtggacg tagaagcgga 7800

gctgaagatg atcttatagc tcgtgcagca aagatcattc aggatcagca gaagaagggt 7860

tctcgcatta ctaaagctaa ggccgatgaa atggctcatc gccggtattg taagcgtact 7920

atcccacctg gttataaggt tgatcaagta tttggtcccc gtactaaagg taaggaggga 7980

aattttggtg atgacaagat gaatgaggag ggtattaagg atgggcgcgt tacagcaatg 8040

ctcaacctag tccctagcag ccatgcttgt ctttttggaa gtagagtgac gcccaaactt 8100

caaccagatg ggctgcactt gagatttgaa tttactactg tggtttctag ggatgatccg 8160

cagtttgata attatgtgaa aatttgtgat cagtgtgtcg atggtgtagg gactcggcca 8220

aaagacgatg aaccgagacc aaagtcacgc ccaaattcaa gacctgctac aagaacaagt 8280

tctccagcgc caagacaaca gcgtcaaaag aaggagaaga agtcaaagaa gcaggatgat 8340

gaagtagata aggcattgac ctcagatgag gagaggaaca atgcacagct ggaatttgat 8400

gatgaaccga aagtgattaa ctggggggat tcagcacttg gagagaatga gttgtaaagc 8460

tagatttcca acttaacatc atggacgtgc gtatgctgtt tttccctact atagactttt 8520

tagcatatta ttttttgcta tttgtatggt ttattacagg tgaagattgt atgtatttgt 8580

tgtacactcg tatgttctat attatgtttt ctgtagttgt tattagtgtt gttcttgttc 8640

ttactctact gttctctttt ctttatttta gagtatcaat aagaatcaag gaagataggc 8700

atgtagtttg attacctaca tgtctatcgc cagggaaatg tctaatctgt ctacttagta 8760

gcctggaaac gaacggtaga cccttagatt ttaatttagt ttaattttta gtttagttta 8820

agttagttta gagtaggtat aaagaagcca gtgccggggc cacgcggagt acgatcgagg 8880

gtacagcact aggacgccca ctaggggaag agctaaattt tagtttaagt taagtttaat 8940

tggctaagta tagttaaaat ttataggcta gtatagagtt agagcaaaaa aaaaaaaaaa 9000

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9060

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagttta aacttaatta agaattccct tggctcgagt 9120

tcgaaatcgg atgccgggac cgacgagtgc agaggcgtgc aagcgagctt ggcgtaatca 9180

tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 9240

gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 9300

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 9360

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 9420

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 9480

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 9540

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 9600

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 9660

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 9720

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 9780

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 9840

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 9900

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 9960

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 10020

agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 10080

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 10140

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 10200

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 10260

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 10320

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 10380

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 10440

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 10500

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 10560

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 10620

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 10680

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 10740

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 10800

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 10860

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 10920

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 10980

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 11040

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 11100

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 11160

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 11220

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 11280

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 11340

taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 11400

cgtc 11404

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

cagagcacaa gtttgatctt gtgatatctg atatgtatac agacaatgat tc 52

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

tatcatagag caaagcacta catagtgcac ac 32

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

actatgtagt gctttgctct atgataataa tacttacg 38

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

cataccaagg ccatttaata taagttttga gaattgagag 40

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

aacttatatt aaatggcctt ggtatgtgtg g 31

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

cttaactcct ggaattacta accacgtgta ccaaaataaa caacaagc 48

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

tcagcatgga cgtgtggtta 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

aggttggcac ctatatgggg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

tgacttggtt tgaagatggc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

aagagatgtt ggtaacacct 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gacagagcac aagtttgatc 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

ggagtgaaaa caagatcacc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

aatttaacag ttagcgtatc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

tttgtatacg agagccatca 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

ggtcctacta gatgtaaggg 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

ctctctttga cctacaccat 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

ttgccttcag tatgtttgtg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

agtgaagaaa gtctacctgt 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

atttcctccg tacttcaaga 20

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

tgaagataat aatggcaaaa gc 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

tcttgaaaca ctctcaattc t 21

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

ggtcaccagt atatttctgc 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ggtcaacaat gtaattttgc t 21

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

cttgtcctgc tttgttaaga 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ttataggttg gcttgtacgc 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gcccatcctt aataccttcc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

ctcgcattac aaaggctaag 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

gctctaactc tatactagcc t 21

<210> 50

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

gtttgtccaa catctcttac cagtaactta cc 32

<210> 51

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

ttactggtaa gagatgttgg acaaaccgct tttac 35

<210> 52

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

ggactttgga tcattaaaca gactttttag gtctgtattg 40

<210> 53

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

aaagtctgtt taatgatcca aagtcccact ag 32

<210> 54

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

acttcaccaa catctcttac cagtaactta cc 32

<210> 55

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

ttactggtaa gagatgttgg tgaagtcact g 31

<210> 56

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

aatcaaacaa attagcacta catagtgcac ac 32

<210> 57

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

actatgtagt gctaatttgt ttgattctga taataattat g 41

<210> 58

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

cataccaagg ccacttaata taagttttaa ttattgaaag ttcttc 46

<210> 59

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

aacttatatt aagtggcctt ggtatgtgtg g 31

<210> 60

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

cagagcacaa gtttgatctt gtgatatctg atatgtatac agacaatg 48

<210> 61

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 61

acttccccaa catctcttac cagtaactta cc 32

<210> 62

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

ttactggtaa gagatgttgg ggaagtcact g 31

<210> 63

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 63

cttaactcct ggaattacta accacgtgta ccaaaataaa caacaag 47

<210> 64

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

tatcaaacaa agcagcacta catagtgcac ac 32

<210> 65

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

actatgtagt gctgctttgt ttgataataa tgaaac 36

<210> 66

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

cataccaagg ccatttaata taagtcttga gtattgaaag 40

<210> 67

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

gacttatatt aaatggcctt ggtatgtgtg g 31

<210> 68

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

tgtcatataa attagcacta catagtgcac ac 32

<210> 69

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

actatgtagt gctaatttat atgacaacga atcttttg 38

<210> 70

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

cataccaagg ccacttaata taagttttga gtattgaaag 40

<210> 71

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

tatcaaacag agcagcacta catagtgcac ac 32

<210> 72

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

actatgtagt gctgctctgt ttgataataa tcag 34

<210> 73

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 73

gttgaaccaa catctcttac cagtaactta cc 32

<210> 74

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 74

ttactggtaa gagatgttgg ttcaacctct tttac 35

<210> 75

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 75

tattgtacaa agaagcacta catagtgcac ac 32

<210> 76

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 76

actatgtagt gcttctttgt acaataatga tagctatg 38

<210> 77

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 77

cataccaagg ccatttaata taagttttta aaatagaaag tgtttc 46

<210> 78

<211> 27646

<212> DNA

<213> 禽类传染性支气管炎病毒

<400> 78

actaaaaata gatattaata tatatctatt acactagcct tgcgctagat ttccaactta 60

acaaaacgga cttaaatacc tacagctggt cctcataggt gttccattgc agtgcacttt 120

agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggtttttgt tattaaaatc ttattgttgc 180

tggtatcact gcttgttttg ccgtgtctca ctttatacat ccgttgcttg ggctacctag 240

tatccagcgt cctacgggcg ccgtggctgg ttcgagtgcg aagaacctct ggttcatcta 300

gcggtaggcg ggtgtgtgga agtagcgctt cagacgtact ggttctgttg cgtgaaacgc 360

ggggtcacct ccccccacat acctctaagg gcttttgagc ctagcgttgg gctacgttct 420

cgcacaaggt cggctatacg acgtttgtag ggggtagtgc caaacaaccc ctgaggtgac 480

aggttctggt ggtgtttagt gagcagacat acaatagaca gtgacaacat ggcttcaagc 540

ctaaaacagg gagtatctcc caaaccaagg gatgtcattc ttgtttccaa agacattccc 600

gaacaactct gtgacgcttt atttttctac acgtcacaca accctaagga ttacgctgat 660

gcttttgcat ttaggcaaaa gtttgaccgt aatctgcaga ctgggaagca gttcaaattt 720

gaaactgttt gtggtctctt cctattgaag ggagttgaca aaataacacc tggcgtccca 780

gcaaaagttt taaaagccac ttctaagttg gcagatttag aagacatctt tggtgtctct 840

ccttttgcac ggaagtaccg tgaattgttg aaaacagcat gccagtggtc tcttactgta 900

gaaacactgg atgctcgtgc acaaacgctt gacgaaattt ttgactctac tgaaatactt 960

tggcttcagg tggctgcaaa aattcaagtt tcagctatgg caatgcgcag gcttgttgga 1020

gaagtaactg caaaagtcat ggaagctctt ggctcaaatt tgagtgttct ctttcaaatt 1080

gttaaacaac aaatagccag aatctttcaa aaggcactgg ctatttttga aaatgtgagt 1140

gaattaccac agcgtattgc agcacttaag atggcctttg ccaagtgtgc caagtcaatt 1200

actgttgtgg ttgtggaaag aactctagtt gttagagagt tcgcaggaac ttgtcttgca 1260

agcatcaatg gtgctgttgc aaaattcttt gaagaacttc caaatggctt tatgggttct 1320

aaaatcttca caacattggc cttctttaaa gaagcagctg tgaaaattgt ggaaaatata 1380

ccaaatgcac caagaggtac tagaggtttt gaagtcgttg gtaacgccaa gggaacgcaa 1440

gttgttgtgc gtggcatgcg aaatgattta actctgctcg accaaaaagc tgacattcct 1500

gttgagaaag aaggttggtc tgcaattctt gaaggacatc tgtgttatgt ctttaagagt 1560

ggtgatcgtt tttatgcggc acctctttca gggaattttg cattgcatga tgtgcattgt 1620

tgtgagcgtg ttgtctgtct gtctgatggt gtaacaccag agataaatga tggactcatt 1680

ctagcagcaa tctattcatc ttttagtgtc tcagaactcg tggcagcact taaaaagggt 1740

gaaccattca agttcttggg tcataaattt gtgtatgcga aggatgcagc agtctctttc 1800

actcttgcaa aagcagccac tattgcagat gtactgaagc tgtttcaatc agctcgtgtg 1860

caaacagaag atgtgtggtc tgcatttact gaaaagtctt ttaatttctg gaaactcgca 1920

tatggaaaag tgcgtaatct tgaagaagtt gtgaagactc atttttgtaa agctcaaatg 1980

tcaattatca ttctagcagc agtgcttggc gaaggcattt ggcatcttgt ttcacaggtc 2040

atctataaag taggtggtct ttttactaga gtcgttgact tttgtgaaaa acactggaag 2100

ggtttctgtg cacaacttaa aaaggctaag ctcgttgtca cagaaactct ttgtgttctt 2160

aagggagtgg cacagcattg ttttcaacta ttgctggatg caatacattc tttgtatatg 2220

agttttaaga agtgtgcact tggtagaatt catggagact tactcttctg gaaagggggt 2280

gtacacaaaa ttgttcaaga tggcgatgaa gtttggtttg acgccattga tagtattgat 2340

gttgaagatc tgggtgttgt ccaagaaaaa cccatagatt ttgaggtttg tgaagacgta 2400

acacttccag aaaatcaacc tggtcatatg gttcaaatcg aggatgacgg aaagaactat 2460

atgttcttcc gcttcaaaag ggatgagaac atctactata caccaatgtc tcaacttggt 2520

gcaattaatg tagtttgcaa agcaggcggt aaaaccgtta cctttggaga caccattgtg 2580

aaagaaatac cgccacctga tgttgtgcct attaaggtta gcatagagtg ttgtggtgaa 2640

ccatggaata caatcttcaa gaaagcttat aaagagccca ttgaagttga aactgacctc 2700

acagtagaac aattgctctc tgtgatctat gagaaaatgt gcgacgacct caaattgttt 2760

ccagaggcac cagagccacc gccatttgag aatgtcgcac ttgttgataa aaacggtaaa 2820

gacttggatt gcataaaatc atgccatctt atctaccgtg attatgagag tgatgatgac 2880

atcgaggaag aagatgctga ggagtgtgat actgatttag aatgtgaaga agaggatgag 2940

gatactaaag tgttggctct tatacaagac cctgcaagta ataaataccc tcttcctctt 3000

gatgatgatt atagcgtctt taatggatgt attgtacata aggacgctct tgacgtcgta 3060

aatctaccat ctggtgaaga aacctttgtt gtcaacaact gctttgaggg agctgtaaaa 3120

ccactgcctc agaaagttgt tgatgttcta ggtgactggg gtgaggctgt tgatgcgcaa 3180

gagcaaattg cacaaactac ttcagaggaa acccctatca gtagtttgga ggcaactatt 3240

gagcaagttg ttgttgagga acagaaaata atttctgttg ttgaagaaga acagcaggtg 3300

gcggtctaca cacctgcaga cctacaagtt gttgaagaaa caccagatga gtttattctt 3360

attgctgatg tttccacaga agaaattgtg cctcatgaag aaaaggagtc acagattgaa 3420

caggagccta ttcaagttgt taaatcacaa cgtgaaaaga aggctaaaaa gttcaaggtt 3480

aaatctacta catgtgagaa acccaaattt ttggagtaca caacatgtgt gggtgaccta 3540

acggtagtga ttgccaaagc attggatgag tttaaagagt tctgcattgt aaatgctgct 3600

aatgagcata tgtctcacgg tggcggcgtt gcaaaggcaa ttgcagactt ttgtggaccg 3660

gactttgttg aatattgcgc ggactatgtt aagaaacatg gtccacagca aaaacttgtc 3720

acaccttcat ttgttaaagg cattcaatgt gtgaataatg ttgtaggacc tcgccatgga 3780

gacagcaact tgcgtgagaa gcttgttgct gcttacaaga gtgttcttgt aggtggagtg 3840

gttaactatg ttgtgccagt tctctcatca gggatttttg gtgtagattt taaaatgtca 3900

atagatgcta tgcgcgaagc ttttaaaggt tgtgccatac gcgttctttt attttctctg 3960

agtcaagaac acatcgatta tttcgatgca acttgtaagc agaagacaat ttatcttacg 4020

gaggatggtg ttaaataccg ctctgttgtt ttaaaacctg gtgattcttt gggtcaattt 4080

ggacaggttt ttgcaagaaa taaggtagtc ttttcggctg atgatgttga ggataaagaa 4140

atcctcttta tacccacaac tgacaagact attcttgaat attatggttt agatgcgcaa 4200

aagtatgtaa tatatttgca aacgcttgcg cagaaatggg atgttcaata tagagacaat 4260

tttgttatat tagagtggcg tgacggaaat tgctggatta gttcagcaat agtgctcctt 4320

caagctgcta agattaggtt taaaggtttt cttgcagaag catgggcaca acttttgggt 4380

ggagacccaa ctgattttgt agcctggtgc tatgcaagtt gcaatgctaa tgttggtgag 4440

ttttcagatg ctaattggct tcttgctaat ttggcagaat actttgatgc tgattacacg 4500

aatgcattcc ttaagaggcg tgtgtcatgt aactgtgggg ttaagaattg tgaagttaga 4560

ggccttgaag cttgtattca accagtaaag gcacccaatc ttcttcattt caagactcag 4620

tacacaaatt gtacagtgtg tgatgcaaat agtgtggatg aggtggtaga ggcctcacta 4680

ccatatctgt tgctccttgc tactgatggt cctactacag tggattgtga tgaaaatgct 4740

gtagggaatg ttgttttcat tggctctact aatagtggcc attgttacac gcaagccatt 4800

ggtaaggctt ttgataatct tgctaaggat agaaaatttt caaagaattc gccatacatt 4860

acagcaatgt atacgcgctt ctctcttaag agtgaaagct ctctgtctgt tgttaaacag 4920

agtaagagta aaactaaagt agtaaaagaa gatgttgcca accttgttac tagttctaaa 4980

gccagttttg atgatcttac tgactttgaa cattggtatg atagtaacat ctatgaaagt 5040

cttaaagttc aggaaatacc tgtgaatttg gatgagtatg tgtcatttac aacgaaagaa 5100

gatactaagt tgccactgac acttaaagtt agaggtatca aatcagttgt tgactttatt 5160

tcaagagacg gtttctctta taagttaaca cctgacattg aagaaaattc aaaagcgcca 5220

gtctactacc cagtcttaga ctctattagt cttaaggcaa tatgggtaga cggcagtgct 5280

aattttgttg ttggtcatcc aaactactat agtaagtctc ttcgcattcc tactttttgg 5340

gaaaatgcag agagctttgt taagataggt gacaaagttg atggtgtaac tatgggcctt 5400

tggcgtgcag aacagcttaa caaacctaat cttgaaagaa ttttcaacat tgctaagaaa 5460

gctattgttg gatccagtgt tgttactaca caatgtagta aattaattag taaagcagct 5520

acattcattg ctgataaagt aggtgggggt gtagttcgta atattacaga tagaattaag 5580

ggtctttgtg gatttacacg tgggcatttt gaaagaaaat tgtctccaca attcataaaa 5640

acacttatat tcttcttctt ttactttgta aaggctagtg ctaagagtgt tgccactagt 5700

tataagcgtg tgttatgtaa ggtggttttt accacgctat ttatattatg gtttatgtac 5760

acaagcaaac cagtaacttt tactggaaca cgtgtgctag acttcttatt tgagggttct 5820

ttatgtggtc cctataatga ctatggtaaa gactcatttg acgtactacg ctattgtgga 5880

gatgatttta cttgtcgtgt atgtttacat gataaagatt cacttcattt gtataagcat 5940

gcttatagcg tagaacaggt ttataaagat gcagcttctg gcattagttt taattggaat 6000

tggctttatt tggtctttct aatattattt gttaaaccag tagcaggttt cgttattatt 6060

tgctattgtg ttaagtactt ggtattgagt tcaactgtgt tgcaaactgg tgtaggtttt 6120

atggactggt ttattcaaac agtttttact cactttaatt ttatgggtgc aggtttctat 6180

ttctggctct tttataaatt gtacatacag gttcatcata tactgtattg taaggatata 6240

acatgtgaag tgtgtaagag agttgcacgc agtaacaggc atgaggttag tgttgttgtt 6300

ggtggacgca agcaaattgt gcatgtgtac actaactctg gttacaactt ttgtaagaga 6360

cataattggt attgtaggaa ttgtgatgta tatggtcacc aaaacacatt tatgtctcct 6420

gaagttgctg gcgagctttc tgaaaagctt aaacgccatg ttaaacctac agcacatgct 6480

taccacgttg tggatgaggc ttgcgtagtt gatgattttg ttaacttaaa atacaaagct 6540

gcaactcctg gtaaggatgg tgcacctcct gcagttaaat gtttcagtgt tacagatttc 6600

ttgaagaaag ctgtttttct taaggatgca ctgaaatgtg aacaaatatc taatgatggt 6660

tttatagtgt gtaatacgca gagtgcgcat gctttagagg aagcaaagaa tgcagccatc 6720

tattatgcgc aatacctgtg taaacctata cttatactcg accaggcact ctaccagaat 6780

ttaatagtgg aacctgtatc gaagagcgtt gtcaacaaag tgtgtgacat tttgtctagg 6840

ataatttctg tagatactgc atctttggat tataaagcag gtacaattcg tgatgccttg 6900

ctgtctgtta ctaaagatga agaagctgta gatatggcta tcttctgtca taatcatgaa 6960

gttgaatata caggtgatgg ttttactaat gttataccgt catatggtat agacactgat 7020

aaattaacac ctcgtgatag agggtttttg ataaatgcag atgcttctgt tgctaactta 7080

agagttaaaa atgctccgcc ggtagtatgg aagttctctg atcttattaa gttgtctgac 7140

agttgtctta aatatttaat ctcagcaact gtcaagtcag ggtctcgttt ctttataaca 7200

agatctggtg ctaaacaaat tttttcttgt agtactcaga aattgttggt agagaaaaag 7260

gctggtggtg tcattagtgg tacctttaat tggtttaaga gttgttgtaa atggctcttg 7320

atcttctatg tgctttttac attgtgttgt ttgggttgtt atcatatgga gacgaataaa 7380

agttttgttc atcctatgta tgatgttaac tctacaatgc atgttgaagg ctttaaggtt 7440

atagataaag gtgttattag agacattgta ccagaggatg cttgtttctc taataagttt 7500

gctaactttg atgcattttg gggtaaacca tatgtgaata gtagagactg tccaattgtt 7560

acagcagtca tagatggcgc tggaacaata gcagctggtg ttcctggttt tgtagactgg 7620

gttcttgatg gtgttatgtt tgtacacatg acacaaacag aaagaaaacc ctggtacatt 7680

cccacgtggt ttaacagaga aattgttggt tacactcagg attcaattat tactgaaggt 7740

agtttttata catctatagc tttgttttca gctaggtgtt tatatttaac agccagcaat 7800

acaccacaat tgtattgttt taatggtcat aatgatgctc ctggagcctt accatttagc 7860

agtatcactc cacacagggt ctacttccaa ccaaatggtg ttaggcttat aattcctcaa 7920

cagataatgc acacacccta cgtagtaaag tttttatcag acagctattg tagaggtagt 7980

gtatgtgagt atactaaacc gggttattgt gtctcactaa attcccaatg ggttttattt 8040

aatgacgaat acacaagtaa accaggagta ttctgtggtt ctactgttag agaacttatg 8100

tttaatatgg ttagtacatt ttttactggt gtcaacccta atatttatat gcagctggcg 8160

actatgttct taatactagt tgttgttgtg ttaatttttg caatggttat aaagtttcaa 8220

ggtgttttta aagcttatgc aaccattgtg tttacaataa tgctagtttg ggttgttaat 8280

gcatttattt tgtgtgtaca tagttataat agtgttgtgg ctgttatact actagtaatc 8340

tattgttatg catcattggt tacaagtcgt aatactgcta taataatgca ttgttggctt 8400

gtgtttacct ttggtttaat tgtacccata tggttggcgt gttgctacct ggcatttgtt 8460

ttatatatgt acacaccatt gtttttctgg tgttacggta ctactaaaaa cactcgtaaa 8520

ttgtatgatg gcaacgagtt tgttggtact tatgatcttg ctgcgaagag cacctttgtt 8580

attcgcggtc ctgaatttgt taagcttacg aacgagatag gtgataagtt tgaacactat 8640

ctctcagcgt atgctagact taaatactac tcaggcactg gcagtgaaca agattatctg 8700

caagcttgtc gtgcatggtt agcttatgct ttggaccaat atagaaatag tggtgtggaa 8760

attgtgtata ctccaccacg ttactctatt ggtgttagta gattacaggc cggttttaag 8820

aaactagttt ctcctagtag tgttgttgaa aagtgcattg ttagtgtctc ttatagaggt 8880

aataatctta atggactgtg gctaggtggt actatctact gtccgcgaca tgttctaggc 8940

aagttctcag gtgaccaatg gaatgatgta cttaaccttg ctaataatca tgagtttgaa 9000

gttgtaactc aaaataatgt tactttgaat gttgtcagta ggaggctaaa aggtgcagtt 9060

ttgattttac aaactgctgt tgctaatgct gaaactccaa agtataagtt tgttaaagcc 9120

aattgtggag atagttttac gattgcttgt tcctatggtg gtacagttgt tggactctac 9180

cctgttacta tgcgctctaa tggtactatt agggcgtctt tcttagcagg agcgtgtggt 9240

tctccaggtt ttaatataga aaagggtgta gttaactttt attatatgca ccatcttgag 9300

ttgcctaatg cattacacac aggaactgac ctaatgggag agttctatgg tggttatgtg 9360

gacgaagagg ttgcacaaag ggtgccacca gataatttag ttactaacaa tattgtagca 9420

tggctttatg ccgcaattat tagtgttaag gagagtagtt tctcactgcc taaatggttg 9480

gatagtacta ctgtcagtgt tgaagactgc aataagtggg ctggtgataa tggttttaca 9540

ccattttcta ctagtactgc tattactaaa ttaagtgcta taacaggagt agatgtttgt 9600

aaactccttc gcactattat ggtaaaaagt agtcaatggg gtagtgatcc cattttagga 9660

caatataatt ttgaagatga attgacacca gagtccgttt ttaatcagat aggtggtgtt 9720

agattacagt cttcttttgt aagaagagcc acatcctggt tttggagtag atgtgtgtta 9780

gcttgcttct tatttgtgtt gtgtgctatt gtcttgttta cggcagtgcc acttaaatat 9840

tatgtacatg cagccgttat tttgttaaca gctgtgctct tcatttcttt tactgttaaa 9900

catgttatgg catatatgga tacttttcta ctgccaacat tgcttacagt cattattgga 9960

gtttgtgctg aagtaccttt catctacaat actctaatta gtaggatagt tgtctttgtt 10020

agtcaatggt atgatcctgt agtctttgat actatggtac catggatgtt cttgccacta 10080

gtgttgtaca cagcatttaa gtgtgtgcag ggttgctata gtgtgaattc tttcaatact 10140

tctttgctag tactgtacca gttcttgaag ttaggctttg ttatttatgc ctcttctagc 10200

acgctggcag catacacaga aggtaattgg gatttatttt ttgaattagt tcacactact 10260

gtgttggcta atgttagtag taattcctta ataggtttgt ttgtgttcaa gttagctaag 10320

tggatgttgt attattgtaa tgctacatac tttaataatt atgtgctaat ggctgtcatt 10380

attaatggct ttggttggct cttcacttgt tactttggag tttattggtg gattaataag 10440

gtttttggtt taaccttagg taaatatgaa ttcaaagttt cagtagacca atataggtat 10500

atgtgtcttc ataagataaa ttcgcctaaa actgtgtggg aagttttttc gacaaatata 10560

cttatacaag gaattggtgg tgatcgtgtg ttgcctatag ctacagtgca atctaaattg 10620

agtgatgtaa agtgtacaac tgttgtttta atgcagcttt tgactaagct taatgttgaa 10680

gcaaattcaa aaatgcatgc ttatcttgtt gagttacaca ataaaatcct cgcatctgat 10740

gatgttggag agtgcatgga taatttattg ggtatgctta taacactatt ttgtatagat 10800

tctactattg atttgggtga gtattgtgat gatatactta agaggtcaac tgtattacaa 10860

tcggttactc aagagttttc gcacataccc tcgtatgctg aatatgaaag agctaagagt 10920

atttatgaaa aggttttagc cgattctaaa aatggtggtg taacacagca agagcttgct 10980

gcatatcgta aagctgccaa tattgcaaag tcagtttttg atagagactt ggctgttcaa 11040

aagaagttag atagcatggc agaacgtgct atgacaacaa tgtataaaga ggcgcgtgta 11100

actgatagaa gagcaaaatt agtttcatca ttacatgcac tacttttttc aatgcttaag 11160

aaaatagatt ctgagaagct taatgtctta tttgaccagg cgaatagtgg tgttgtaccc 11220

ctagcaactg ttccaattgt ctgtagtaat aagcttaccc tcgttatacc agacccagag 11280

acgtgggtca agtgtgtgga gggtgtgcat gttacatatt caacagttgt ttggaatata 11340

gactgtgtta ctgatgccga tggcacagag ttacacccca cttctacagg tagtggattg 11400

acttactgta taagtggtga taatatagca tggcctttaa aggttaactt gactaggaat 11460

gggcataata aggttgatgt tgccttgcaa aataatgagc ttatgcctca cggtgtaaag 11520

acaaaggctt gcgtagcagg tgtagatcaa gcacattgta gcgttgagtc taaatgttat 11580

tatacaagta ttagtggcag ttcagttgta gctgctatta cctcttcaaa tccaaatctg 11640

aaagtagcct cttttttgaa tgaggcaggt aatcagattt atgtagactt agacccacca 11700

tgtaaatttg gtatgaaagt gggtgataag gttgaagttg tttacctgta ttttataaaa 11760

aatacgaggt ctattgtaag aggtatggta cttggtgcta tatctaatgt tgttgtgtta 11820

caatctaaag gtcatgagac agaggaagtg gatgctgtag gcattctctc actttgttct 11880

tttgcagtag atcctgcgga tacatattgt aaatatgtgg cagcaggtaa tcaaccttta 11940

ggtaactgtg ttaaaatgtt gacagtacat aatggtagtg gttttgcaat aacatcaaag 12000

ccaagtccaa ctccggatca ggattcttat ggaggagctt ctgtgtgtct ttattgtaga 12060

gcacatatag cacaccctgg cggagcagga aatttagatg gacgctgtca atttaaaggt 12120

tcttttgtgc aaatacctac tacggagaaa gatcctgttg gattctgtct acgtaacaag 12180

gtttgcactg tttgtcagtg ttggattggt tatggatgtc agtgtgattc acttagacaa 12240

cctaaacctt ctgttcagtc agttgctgtt gcatctggtt ttgataagaa ttatttaaac 12300

gggtacgggg tagcagtgag gctcggctga taccccttgc taatggatgt gaccccgatg 12360

ttgtaaagcg agcctttgat gtttgtaata aggaatcagc cggtatgttt caaaatttga 12420

agcgtaactg tgcacgattc caagaagtac gtgatactga agatggaaat cttgagtatt 12480

gtgattctta ttttgtggtt aaacaaacca ctcctagtaa ttatgaacat gagaaagctt 12540

gttatgaaga cttaaagtca gaagtaacag ctgatcatga tttctttgtg ttcaataaga 12600

acatttataa tattagtagg cagaggctta ctaagtatac tatgatggat ttttgctatg 12660

ctttgcggca ctttgaccca aaggattgcg aagttcttaa agaaatactt gtcacttatg 12720

gttgtataga agattatcac cctaagtggt ttgaagagaa taaggattgg tacgacccaa 12780

tagaaaaccc taaatattat gccatgttgg ctaaaatggg acctattgta cgacgtgctt 12840

tattgaatgc tattgagttc ggaaacctca tggttgaaaa aggttatgtt ggtgttatta 12900

cacttgataa ccaagatctt aatggcaaat tttatgattt tggtgatttt cagaagacag 12960

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ccatgactga tgcgttggca cctgagaggt attttgaata tgatgtgcat aagggttata 13080

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catgggtagt aattccagga gctaagggta cagcctttgt atacaagtat acatatggta 24360

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caacagcgtc aaaagaagga gaagaagtca aagaagcagg atgatgaagt agataaggca 27000

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aaaatttata ggctagtata gagttagagc aaaaaaaaaa aaaaaa 27646

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