用于增强治疗效果的单一蛋白质包封的药剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月17日提交的美国临时申请号62/746,964的优先权。本申请的全部内容在此通过引用并入本文。

发明背景

化学疗法是癌症治疗的一种类型，其使用一种或多种抗癌药物(化学治疗剂)作为标准化化学疗法方案的一部分。这意味着非特异性使用细胞内毒物来抑制有丝分裂、细胞分裂。化学治疗剂可具有细胞毒性或遗传毒性或两者兼有。化学治疗技术有一系列副作用，所述副作用取决于所用药物的类型。最常见的药物主要影响身体的快速分裂的细胞，诸如血细胞以及口腔、胃和肠道内壁的细胞。化学疗法相关的毒性可以在施用后数小时或数天内急性发生，也可以从数周至数年慢性发生。在严重情况下，化学治疗剂可导致器官损伤，诸如由蒽环类药物产生的心脏毒性(心脏损伤)、由许多细胞毒性药物产生的肝毒性(肝脏损伤)、由肿瘤裂解综合征产生的肾毒性(肾脏损伤)和由基于铂的药物产生的耳毒性(对内耳的损伤)。

小分子蒽环类药物多柔比星(DOX)是广泛使用的抗癌治疗剂之一。在FDA批准的最强效的化学治疗剂中，蒽环类药物(Carvalho,C.等人，Curr Med Chem,2009,16,3267-3285)显示出针对实体瘤和血液肿瘤的广谱抗肿瘤活性(Tacar,O.,S等人，J PharmPharmacol,2013,65,157-170；Tahover,E.等人，Anticancer Drugs,2015,26,241-258；和Shafei,A.等人，Biomed Pharmacother,2017,95,1209-1218)。然而，作为小而疏水的分子，DOX不加选择地渗入所有组织和器官，导致诸如心肌病和骨髓抑制的全身毒性。当DOX的累积剂量达到一定水平时，充血性心力衰竭的事件急剧增加(Von Hoff,D.D.等人，AnnIntern Med,1979,91,710-717)，这对DOX治疗施加了<450mg/m

已经进行了各种努力和研究来减小DOX的毒性。成功的关键是限制DOX触及正常细胞，同时增加其向肿瘤的输送/递送，原则上这可以通过将DOX与分子量高于约50kD的肾清除值的大分子的自组装或聚集的系统缔合/结合/络合/缀合的合理设计的策略来实现。通过将DOX与纳米尺寸的部分相缔合，此种系统显著改善了DOX的PK，显著增加了DOX的循环寿命，并通过由于肿瘤的不规则新生血管和不良淋巴引流而导致的增强的通透性和滞留(EPR)效应来增强DOX向肿瘤的触及/递送。对脂质体、聚合物缀合物、蛋白质缀合物、蛋白质纳米粒子和金属/无机纳米颗粒(NP)的大量研究一致证明了这些基本原理。然而，目前的系统取得的成功有限，即使是FDA批准的Doxil也是如此(Petersen,G.H.等人，J ControlRelease,2016,232,255-264)。关于为什么当前的系统没有达到他们的期望，存在许多原因。脂质体非特异性地与细胞膜融合以将货物(cargo)DOX卸下，从而引起全身毒性。DOX与合成聚合物和蛋白质的化学缀合修饰了DOX以使其能够缀合，但同时也面临着其控制释放和因化学修饰而导致的性质发生变化的挑战。虽然金属/无机NP曾被誉为用于高效药物递送的银弹，但它们远非天然系统。对它们与组织和器官的相互作用仍没有很好的理解。此外，许多这些非天然系统可能被我们身体复杂的免疫系统识别，导致在不同患者之间可能不同的广泛反应。最后，关于人体如何配置人工系统(合成聚合物、金属/无机纳米NP等)的知识有限。虽然蛋白质和基于酰胺的聚合物可被酶促降解为可通过代谢使用/加工的单体，但不清楚不可生物降解的聚合物和金属/无机NP的长期影响是什么。尽管人血清白蛋白纳米颗粒(HSA-NP)可具有不同的尺寸和化学缀合/交联的不同形式，但它们都与游离HSA显著不同(Kratz,F.,J Control Release,2008,132,171-183；Sebak,S.等人，Int JNanomedicine,2010,5,525-532；Zensi,A.,J Drug Target,2010,18,842-848；Abbasi,S.,J Drug Deliv 2012,686108；Elzoghby,A.O.等人，J Control Release,2012,157,168-182；Jin,G.等人，Oncol Rep,2012,36,871-876；Lomis,N.等人，Nanomaterials,2016,(Basel)6；和Nateghian,N.等人，Chem Biol Drug Des,2016,87,69-82)。因此，它们的循环PK、与宿主器官/组织/细胞的相互作用以及免疫反应的潜在引发可以与天然HSA有相当大的不同。所有这些问题直接导致了目前癌症药物制剂/递送系统取得的成功有限(Petersen,G.H.等人，J Control Release,2016,232,255-264；van der Meel等人，ExpertOpin Drug Deliv,2017,14,1-5.；和Mukherjee,A.等人，1996,All About Albumin:Biochemistry,Genetics and Medical Applications.San Diego,CA:Academic PressLimited)。因此，迫切需要不仅能降低毒性，而且还能提高DOX和其它抗癌药在人临床环境中的功效的制剂。

HSA是体内最丰富的血清蛋白，总量约为460g，分布在血液循环、淋巴系统和细胞外/细胞内区室中(Peters,T.,1996,All About Albumin:Biochemistry,Genetics andMedical Applications.San Diego,CA:Academic Press Limited)。它的功能包括提供必需的胶体渗透压、平衡血浆pH值，以及结合和转运疏水分子，诸如脂肪酸和胆红素。HSA具有一些独特的性质(Hoogenboezem,E.N.and Duvall,C.L.,Adv Drug Deliv Rev,2018,130,73-89):1)是高度可溶的和热稳定的，2)能够以不同的结合亲和力结合多种配体，3)通过受体被内吞和胞转到细胞中并穿过细胞，4)由于新生Fc受体(FcRn)的有效内体再循环和通过兆蛋白/立方蛋白-复合物从肾清除中的拯救，显示出异常长的19天半衰期(Chaudhury,C.,J Exp Med,2003,197,315-322；Anderson,C.L.等人，Trends Immunol,2006,27,343-348；Chaudhury,C.等人，Biochemistry,2006,45,4983-4990；和Kim,J.,Bronson等人，Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol,2006,290,G352-360)，5)由于EPR效应而能够在肿瘤组织中积累，以及6)优先被癌细胞吸收和代谢以用作营养物(Stehle,G.等人，Crit RevOncol Hematol,1997,26,77-100；Commisso,C.等人，Nature,2013,497,633-637；和Kamphorst,J.J.等人，Cancer Res,2015,75,544-553)。

发明内容

本申请人已经鉴定出使治疗剂(如多柔比星)紧密地结合在单一蛋白质(例如白蛋白)内，同时基本上保持所述单一蛋白质的性质的方法。这种方法提供了具有更低毒性和/或更宽治疗窗的新组合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含具有一个或多个紧密地结合在其中的药剂分子的单一蛋白质的组合物。

本发明还提供了治疗动物的癌症的方法，所述方法包括向动物施用包含具有一个或多个紧密地结合在其中的抗癌剂分子的单一蛋白质的组合物。

本发明还提供了治疗动物的细菌或真菌感染的方法，所述方法包括向动物施用包含具有一个或多个紧密地结合在其中的抗细菌或抗真菌剂分子的单一蛋白质的组合物。

本发明还提供了一种方法，其包括：a)将包含药剂的第一溶液与包含单一蛋白质、水和极性有机溶剂的第二溶液组合，以提供第三溶液；以及b)在允许一个或多个药剂分子紧密地结合在每个单一蛋白质分子内的条件下搅拌第三溶液。本发明还提供了由本发明的方法制备的组合物。

本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含1)具有一个或多个紧密地结合在其中的药剂分子的单一蛋白质，和2)药学上可接受的载体。

本发明还提供了用于癌症的防治性治疗或治疗性治疗的如本文所述的组合物。

本发明还提供了如本文所述的组合物在制备用于治疗动物的癌症的药物中的用途。

本发明还提供了用于细菌感染的防治性治疗或治疗性治疗的如本文所述的组合物。

本发明还提供了如本文所述的组合物在制备用于治疗动物的细菌感染的药物中的用途。

附图说明

图1：拓扑替康在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例2。

图2：表柔比星(EPI)在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例3。

图3：通过DLS测定的HSA包封的表柔比星的粒度分布，参见实施例3。

图4：伊达比星在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例3。

图5：通过DLS测定的HSA包封的伊达比星的粒度分布，参见实施例3。

图6：长春新碱在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例5。

图7：柔红霉素在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的紫外光谱变化，参见实施例6。

图8：通过DLS测定的HSA包封的柔红霉素的粒度分布，参见实施例6。

图9：米托蒽醌在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例7。

图10：通过DLS测定的HSA包封的米托蒽醌的粒度分布，参见实施例7。

图11：多柔比星在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的紫外光谱变化，参见实施例8。

图12：通过DLS测定的HSA包封的多柔比星的粒度分布，参见实施例8。

图13：两性霉素B在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例8。

图14：通过DLS测定的HSA包封的两性霉素B的粒度分布，参见实施例8。

图15：氯法齐明在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例10。

图16：甲氨蝶呤在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例11。

图17：通过DLS测定的HSA包封的甲氨蝶呤的粒度分布，参见实施例11。

图18：利福平在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例12。

图19：长春碱在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例13。

图20：长春瑞滨在于PBS(pH＝7.4)中包封前后的光谱变化，参见实施例14。

图21：组合物15中的多柔比星的紫外光谱变化，参见实施例20。

图22：多柔比星的游离形式、HSA/DOX混合物和HSA包封的DOX在不同pH值下的透析的时间曲线，参见实施例16。

图23：平均肿瘤体积变化与用对照、游离Dox和组合物7治疗的天数的关系，参见实施例17。

图24：平均肿瘤体积变化与用对照、游离米托蒽醌和组合物6治疗的天数的关系，参见实施例17。

图25：％体重变化(经归一化的)与用对照、游离Dox和组合物7治疗的天数的关系，参见实施例17。

图26：％体重变化(经归一化的)与用对照、米托蒽醌和组合物6治疗的天数的关系，参见实施例17。

图27：％体重变化(经归一化的)与用含有3倍(15mg/kg)和4倍(20mg/kg)的Dox当量的组合物7治疗的天数的关系，参见实施例18。

图28：％体重变化(经归一化的)与用含有5倍(25mg/kg)和6倍(30mg/kg)的Dox当量的组合物7治疗的天数的关系，参见实施例19。

图29：白蛋白包封的药剂(药物分子)的示意图。

图30：HSA完全包封的药剂。

图31：HSA-部分包封的药剂。

图32：通过DLS测定的HSA的粒度分布。

图33：组合物16中的表柔比星的紫外光谱变化，参见实施例21。

图34：组合物18中的多柔比星的紫外光谱变化，参见实施例23。

具体实施方式

在一个实施方案中，本发明提供了包含具有一个或多个“紧密地结合”在其中的药剂分子的单一蛋白质的组合物。如本文中所用，术语“紧密地结合的”意指药剂分子被包封在单一蛋白质内；药剂并非直接或通过间插基团共价结合至单一蛋白质。在一个实施方案中，药剂分子完全被单一蛋白质包封(图30)。在另一个实施方案中，药剂分子的表面区域的仅一部分被单一蛋白质包封(参见图31)。在另一个实施方案中，一个或多个药剂分子可能被单一蛋白质质完全包封，并且一个或多个药剂分子可能仅一部分表面区域被单一蛋白质包封。

如本文中所用，术语“单一蛋白质”包括天然和合成来源的蛋白质的单分子种类，包括从活生物体和生物工程化系统中分离的蛋白质。此外，所述蛋白质可通过共价键联或非共价相互作用含有其它非蛋白质组分。在一个实施方案中，所述术语不包括蛋白质的多分子种类，诸如二聚体、三聚体、寡聚体或多聚体。在一个实施方案中，单一蛋白质是白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、IgA、IgM、IgG或另一种人蛋白质。

如本文中所用，术语“白蛋白”包括任何白蛋白。在一个实施方案中，白蛋白是哺乳动物的。在一个实施方案中，白蛋白是人、牛、绵羊、马或猪的白蛋白。在一个实施方案中，白蛋白是非哺乳动物的。在一个实施方案中，白蛋白由重组技术制备。在本发明的组合物中，白蛋白不以颗粒(例如纳米颗粒)的形式存在。因此，紧密地结合的药剂分子被包封在白蛋白结构内的口袋中，而不是白蛋白纳米颗粒的孔中。

如本文中所用，术语“球蛋白”包括任何球蛋白。球蛋白是不包括白蛋白在内的大血清蛋白的异质组，其可溶于盐溶液。球蛋白有三个主要的亚组(它们通过其各自的电泳迁移率来区分)：α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。各种球蛋白的非限制性实例包括凝血蛋白、补体、许多急性期蛋白、免疫球蛋白(Ig)和脂蛋白。在一个实施方案中，球蛋白是哺乳动物的。在一个实施方案中，球蛋白是人、牛、绵羊、马或猪的白蛋白。在一个实施方案中，球蛋白是非哺乳动物的。在一个实施方案中，球蛋白是重组球蛋白。在一个实施方案中，球蛋白是免疫球蛋白(Ig)，诸如IgA、IgM、IgG、IgE或IgD抗体。

如本文中所用，术语“抗体”包括单链可变片段(scFv或“纳米抗体”)、人源化抗体、全人抗体或嵌合抗体、单链抗体、双体抗体，以及不含Fc区的抗体的抗原结合片段(例如Fab片段)。在某些实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。“人源化”抗体仅含有三个CDR(互补决定区)，有时还含有少数精心选择的“框架”残基(可变区的非CDR部分)，所述框架残基来自每个供体抗体可变区，并重组连接至人抗体序列的相应框架和恒定区。“完全人源化抗体”是在来自经遗传工程改造成仅具有人来源的抗体基因的小鼠的杂交瘤中产生的或者通过从人来源的抗体基因的噬菌体展示文库中选择而产生的。

如本文中所用，术语“纤维蛋白原”包括任何纤维蛋白原。纤维蛋白原是存在于血浆中的可溶性糖蛋白，可通过凝血酶的作用从其产生纤维蛋白。在一个实施方案中，纤维蛋白原是哺乳动物的。在一个实施方案中，纤维蛋白原是人、牛、绵羊、马或猪的纤维蛋白原。在一个实施方案中，纤维蛋白原是非哺乳动物的。在一个实施方案中，纤维蛋白原是重组纤维蛋白原。

如本文中所用，术语“极性有机溶剂”包括可与水混溶或部分溶于水的溶剂。例如，所述术语包括水混溶性溶剂或水部分溶解的溶剂。术语“极性有机溶剂”包括：

(1)水溶性醇：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、叔丁醇等

(2)水溶性二醇和三醇、四醇(tetraols)：乙二醇、丙二醇、甘油等

(3)水溶性醛和酮：丙酮、丁酮、戊酮、己酮、乙醛、甲酰基醛(formyl aldehyde)、丙醛、丁醛等

(4)水溶性腈：乙腈、丙腈、丁腈等

(5)低分子量水溶性聚合物：聚乙二醇、聚丙二醇等

(6)水溶性酰胺：DMF、二甲基乙酰胺、二甲基丙酰胺等，

(7)水溶性醚：二乙基醚、THF、二噁烷等

(8)所有其它水溶性有机溶剂：DMSO等

如本文中所用，术语“药剂”包括可紧密地结合在单一蛋白质内的任何药物活性剂。在一个实施方案中，药剂是疏水性的。在一个实施方案中，药剂在所需的pH值下是水溶性的。在一个实施方案中，药剂是抗癌剂、抗炎剂、CNS剂、抗真菌剂或抗生素剂。在一个实施方案中，药剂是抗癌化合物。在一个实施方案中，药剂是多柔比星。特别地，药剂在约-4至约20的pH下是水溶性的。在一个实施方案中，药剂在约0至约14的pH下是水溶性的。在一个实施方案中，药剂在任何pH值下都具有有限的水溶解度。在一个实施方案中，药剂是多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、柔红霉素、长春新碱、长春瑞滨、长春碱、拓扑替康、伊立替康、放线菌素D、伊达比星、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、SN-38、伊沙匹隆、艾立布林、长春地辛、喜树碱、紫杉醇、多西他赛、苯达莫司汀、奈拉滨、吡柔比星、氯法拉滨、伐柔比星(valrubicin)、苯丁酸氮芥等。在一个实施方案中，药剂包含一个氨基或多个氨基。在一个实施方案中，药剂包含一个羧酸基团或多个羧酸基团。在一个实施方案中，药剂包含一个或多个羧酸基团和一个氨基。在一个实施方案中，药剂是抗生素剂。在一个实施方案中，药剂是两性霉素B、氯法齐明、利福平、氯霉素、四环素或氟喹诺酮抗生素。

如本文中所用，术语“第二药剂”包括任何药物活性剂。在一个实施方案中，第二药剂可以紧密地结合在单一蛋白质内。在一个实施方案中，第二药剂是疏水性的。在一个实施方案中，第二药剂在所需的pH值下是水溶性的。在一个实施方案中，第二药剂是抗癌剂、抗炎剂、CNS剂、抗真菌剂或抗生素剂。在一个实施方案中，药剂是抗癌化合物。在一个实施方案中，第二药剂是多柔比星。在一个实施方案中，第二药剂是多西他赛。特别地，第二药剂在约-4至约20的pH下是水溶性的。在一个实施方案中，第二药剂在约0至约14的pH值下是水溶性的。在一个实施方案中，第二药剂在任何pH值下都具有有限的水溶性。在一个实施方案中，第二药剂是多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、柔红霉素、长春新碱、长春瑞滨、长春碱、拓扑替康、伊立替康、放线菌素D、伊达比星、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、SN-38、伊沙匹隆、艾立布林、长春地辛、喜树碱、紫杉醇、多西他赛、苯达莫司汀、奈拉滨、吡柔比星、氯法拉滨、伐柔比星、苯丁酸氮芥等。在一个实施方案中，第二药剂包含一个氨基或多个氨基。在一个实施方案中，第二药剂包含一个羧酸基团或多个羧酸基团。在一个实施方案中，第二药剂包含一个或多个羧酸基团和一个氨基。在一个实施方案中，第二药剂是抗生素剂。在一个实施方案中，第二药剂是两性霉素B，或氯法齐明，或利福平、氯霉素，或四环素，或氟喹诺酮抗生素。

HSA因其环境改变时其构象发生变化而闻名。据报道，HSA在酸性、中性和碱性条件下呈现出不同的构象。HSA在共溶剂(诸如乙醇/水，或甲醇/乙醇/水，或1,4-二噁烷/水，或2-丁酮/乙醇/水，或丙酮/水，或DMSO/水，或其它有机溶剂/水的混合物)中的构象与在纯水中的构象有很大的不同。(Borisover,M.D.等人，Thermochimica Acta,1996,284,263-277)。文献表明，HSA在水/有机共溶剂中悬浮伴随着两个主要过程：(1)水解吸-吸附，(2)由于蛋白质-蛋白质接触点的破裂而导致的不吸附(non-sorption)，这取决于有机溶剂的性质和水含量。此外，在水/有机共溶剂中制备的HSA溶液导致可触及的表面区域的增加，这有能力改变预期的HSA悬浮液的吸水性和产热学性质(calorific property)。水/有机共溶剂中的HSA不再处于其自然状态；其是部分变性的。由于共溶剂的相对极性低于纯水的相对极性，因此HSA在所需的有机物/水混合物中发生的构象变化将使一些疏水口袋能够被打开，从而使药剂紧密地结合或包封到这些疏水口袋中，参见图29。例如，在下面的组合物7中，多个DOX分子紧密地结合在每个HSA分子内部。在文献报告中(Khan,S.N.等人，Eur J PharmSci,2008,35,371-382；和Agudelo,D.等人，PLoS One,2012,7,e43814)，其中DOX和米托蒽醌可逆地与人血清白蛋白(HSA)缔合，只有1个DOX或米托蒽醌分子被报告与每个HSA缔合。另外，可逆缔合的DOX和米托蒽醌的紫外光谱与相应的未缔合的材料相比没有变化。在本发明中，一旦多柔比星或米托蒽醌被包封到HSA分子中，就会观察到多柔比星或米托蒽醌的紫外光谱的红移，对于组合物7，参见图11，对于组合物6，参见图9。在一些情况下，一旦被包封到HSA分子中，药物分子的吸收带就会被消除，对于组合物8，参见图13，其中一旦被包封在HSA分子内部，两性霉素B在324nm处的吸收就会被完全消除。在其它情况下，观察并记录到某些药物分子在被包封到HSA分子中后紫外光谱蓝移，对于组合物9，参见图15，其中氯法齐明被包封到HSA分子中。具有紧密地结合在白蛋白中的药剂分子的本发明的组合物具有新的性质，例如，举个例子，增强的治疗效果。

在一个实施方案中，将单一蛋白质溶解在含有至少一种水溶性有机溶剂的共溶剂中，所述有机溶剂促使药剂能够被包封到单一蛋白质中。包封过程通过紫外或其它仪器监控。一旦获得期望百分比的单一蛋白质包封的药物，就终止包封过程并制备最终产品。过滤(例如通过0.22um的膜或高速离心或其它灭菌程序)后，可在通过沉淀蛋白质进行的有机溶剂提取之后通过紫外分光光度计、HPLC或其它方法定量药物的浓度。定量后，可将单一蛋白质包封的药物溶液在-20℃下冷冻，或者冻干成粉末产品。另外，在一些实施方案中，可通过运行通过Sephadex G25柱进一步纯化单一蛋白质包封的药物，其中大分子单一蛋白质包封的药物首先出来，然后是未包封的药物。在一些实施方案中，可使用具有不同分子量截断值的透析袋通过透析进一步纯化单一蛋白质包封的药物，其中具有小分子量的未包封的药物将被透析出来，并且分子量(macular weight)>20kd的单一蛋白质包封的药物将被保留在透析袋内。本发明提供了在不从化学上修饰单一蛋白质或目标药物的结构的情况下制备单一蛋白质包封的药物的新型方法。

HSA是生物聚合物，分子量约为66,000g/摩尔，通过动态光散射(DLS)测定的粒度约为的10nm(图32)。在本发明的组合物中，具有一个或多个包封在其中的药剂分子的白蛋白的粒度没有变化，对于组合物3，参见图5，对于组合物5，参见图8，对于组合物6，参见图10，对于组合物7，参见图12，对于组合物8，参见图14，对于组合物10，参见图17。在一个实施方案中，具有一个或多个紧密地结合在其中的药剂分子的白蛋白可溶于水。在另一个实施方案中，具有一个或多个包封在其中的药物分子的白蛋白在约6至约8的范围内的pH值下可溶于水。

如果药剂是抗癌剂，则包含具有一个或多个包封在其中的药剂分子的单一蛋白质的组合物可以增加药剂的MTD，因为包封的分子更倾向于进入癌细胞，并且与正常细胞的相互作用更少。如果药剂是抗生素，则包含具有一个或多个紧密地结合在其中的药剂分子的单一蛋白质的组合物可以降低对抗微生物的MIC(最小抑制浓度)，因为紧密地结合的分子有利地结合到细菌(革兰阳性和革兰阴性)和真菌两者的表面上。因此，在一些实施方案中，单一蛋白质紧密地结合的药剂可以通过将它们的MTD或MIC与分子游离形式的MTD或MIC进行比较来表征。

如前一节中所描述，在制备过程中，一旦成功制备出了单一蛋白质紧密地结合的药剂，目标药物分子就被截留在单一蛋白质的结合口袋中。与游离形式相比，包封的分子被不同的环境包围，这可导致它们的紫外光谱或荧光发射光谱发生变化。包封的分子的载体、结合和邻近关系可使用吸收、荧光、FTIR或圆二色性来表征和分析。

单一蛋白质包封对于溶解度有限的药剂可能特别有用。例如，单一蛋白质包封对于需要与一种或多种表面活性剂或增溶载体一起配制以促进施用的药剂可能有用。在许多情况下，在施用后会，表面活性剂和增溶载体具有产生不良影响的不期望的特性。将溶解度有限的药剂包封在单一蛋白质中可以提供该治疗剂的可施用形式，所述可施用形式不包含不期望的表面活性剂或增溶载体。因此，在一个实施方案中，第一药剂和/或第二药剂是溶解度差(例如，在水中的溶解度小于约0.1μg/mL)的药剂。在另一个实施方案中，本文所述的药物组合物不包含表面活性剂或增溶载体。

在一个实施方案中，药剂是蒽环类、细胞骨架破坏剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂或长春花生物碱或其衍生物。

在一个实施方案中，第二药剂是蒽环类、细胞骨架破坏剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂或长春花生物碱或其衍生物。

在一个实施方案中，药剂是蒽环类，并且第二药剂是细胞骨架破坏剂。

在一个实施方案中，药剂是蒽环类，并且第二药剂是长春花生物碱或其衍生物。

在一个实施方案中，药剂是细胞骨架破坏剂，并且第二药剂是拓扑异构酶I抑制剂

在一个实施方案中，药剂是细胞骨架破坏剂，并且第二药剂是拓扑异构酶II抑制剂。

在一个实施方案中，药剂是蒽环类，并且第二药剂是激酶抑制剂。

在一个实施方案中，药剂是烷化剂、抗代谢药、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂或细胞毒性抗生素。

在一个实施方案中，第二药剂是烷化剂、抗代谢药、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂或细胞毒性抗生素。

在一个实施方案中，药剂是抗微管剂，并且第二药剂是拓扑异构酶抑制剂。

在一个实施方案中，药剂是抗微管剂，并且第二药剂是细胞毒性抗生素。

在一个实施方案中，药剂是拓扑异构酶抑制剂，并且第二药剂是细胞毒性抗生素。

在一个实施方案中，药剂是抗微管剂，并且第二药剂是烷化剂。

在一个实施方案中，多个药剂分子紧密地结合在每个单一蛋白质内。

在一个实施方案中，至少一个药剂分子紧密地结合在每个单一蛋白质内。

在一个实施方案中，所述组合物包含水和一种或多种水溶性有机溶剂。

在一个实施方案中，药剂具有差的水溶解度。

在一个实施方案中，组合物中的药剂的最大耐受剂量高于单独的药剂游离形式(例如在无单一蛋白质的情况下配制的)的最大耐受剂量。

在一个实施方案中，组合物中的药剂的最大耐受剂量比单独的药剂游离形式(例如在无单一蛋白质的情况下配制的)的最大耐受剂量高至少10％。

在一个实施方案中，组合物中的药剂的功效大于单独的药剂的功效。

在一个实施方案中，组合物中的药剂的功效比单独的药剂(例如在无单一蛋白质的情况下配制的)的功效高至少10％。

在一个实施方案中，紧密地结合至药剂的单一蛋白质与相应的未紧密地结合的单一蛋白质相比，在吸收、荧光、圆二色性光谱或FTIR方面具有差异。

在一个实施方案中，一个或多个第二药剂分子紧密地结合在单一蛋白质中。

在一个实施方案中，多个第二药剂分子被包封在每个单一蛋白质内。

在一个实施方案中，至少一个第二药剂分子被包封在每个单一蛋白质内。

在一个实施方案中，每个第二药剂分子被完全包封在单一蛋白质中。

在一个实施方案中，至少一个第二药剂分子的表面区域的仅一部分被单一蛋白质包封。

在一个实施案中，第二药剂具有差的水溶解度。

在一个实施方案中，组合物中的第二药剂的最大耐受剂量高于单独的药剂游离形式(例如在无单一蛋白质的情况下配制的)的最大耐受剂量。

在一个实施方案中，组合物中的第二药剂的最大耐受剂量比单独的药剂游离形式(例如，在无单一蛋白质的情况下配制的)的最大耐受剂量高至少10％。

在一个实施方案中，组合物中的第二药剂的功效高于单独的药剂(例如在无单一蛋白质的情况下配制的的功效。

在一个实施方案中，组合物中的第二药剂的功效比单独的药剂(例如在无单一蛋白质的情况下配制的)的功效高至少10％。

在一个实施方案中，紧密地结合至第二药剂的单一蛋白质与相应的未紧密地结合至第二药剂的单一蛋白质相比，在吸收、荧光、圆二色性光谱或FTIR方面具有差异。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗人或动物的癌症的方法，其包括向人或动物施用本发明的组合物。在一个实施方案中，治疗剂是多柔比星，并且其中单一蛋白质组合物中的多柔比星的最大耐受剂量比单独的多柔比星(例如在无单一蛋白质的情况下配制的)的最大耐受剂量高至少10％。

在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括：将包含水、一种或多种药剂分子和任选的一种或多种水溶性有机溶剂的第一溶液与包含水、单一蛋白质和任选的一种或多种水溶性有机溶剂的第二溶液组合，以提供第三溶液。在一个实施方案中，本发明进一步提供了通过过滤对第三溶液进行灭菌以去除微生物。

可以将本发明的制剂与药学上可接受的媒介物(诸如惰性稀释剂或可同化的可食用载体)组合来全身施用，例如口服施用。它们可被封装在硬壳或软壳明胶胶囊中、可被压制成片剂，或者可直接与患者饮食中的食物掺合在一起。对于口服治疗施用，所述制剂可与一种或多种赋形剂组合在一起，并以可摄取片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、干胶片(wafer)等的形式使用。此类组合物和制品应含有至少0.1％的制剂。所述组合物和制剂的百分比当然可以变化，并且可以方便地在给定的单位剂型重量的约2％与约60％之间。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可添加甜味剂诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或调味剂诸如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了含有上述类型的材料之外，其还可含有液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。可存在作为包衣或者以其它方式修改固体单位剂型的物理形式的各种其它材料。例如，可用明胶、蜡、虫胶或糖等给片剂、丸剂或胶囊包衣。糖浆剂或酏剂可含有活性化合物、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、染料和调味剂(诸如桃和橙子风味)。用于制备任何单位剂型的任何材料都应该是药学上可接受的，并且在使用量上基本上无毒。另外，可将所述制剂掺入到缓释制品和装置中。

适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散体或适于临时制备无菌可注射或输注溶液或分散体的包含活性成分的无菌粉末，它们任选地包封在脂质体中。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下都应是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯以及它们的合适的混合物。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。

通过将所需量的制剂根据需要与上文列举的多种另外的成分一起掺入在适当的溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分外加存在于先前无菌过滤的溶液中的任何额外的所需成分的粉末。

制剂的有用剂量可通过比较其体外活性和在动物模型中的体内活性来确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。

用于治疗的所需的制剂量将随所选择的特定制剂、施用途径、所治疗的病症的性质以及患者的年龄和状况而变化，最终将由主治医生或临床医生决定。

期望剂量可以方便地以单剂量或以适当的间隔施用的分剂量(例如每天两次、三次、四次或更多次亚剂量)提供。亚剂量本身可以进一步划分，例如，划分为多个离散的松散间隔的施用。

还可将本发明的制剂与其它治疗剂组合施用。因此，在一个实施方案中，本发明还提供了组合物，所述组合物包含本发明的制剂、至少一种其它治疗剂和药学上可接受的稀释剂或载体。本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒包含本发明的制剂、至少一种其它治疗剂、包装材料以及用于向动物施用所述制剂和一种或多种另外的治疗剂的说明书。

HSA或IgG的异常长的半衰期主要通过FcRn或Brambell受体维持(Brambell,F.W.等人，Nature,1964,203,1352-1354)，所述FcRn或Brambell受体在多种组织或器官中表达(Sockolosky,J.T.和Szoka,F.C.,Adv Drug Deliv Rev,2015,91,109-124)。这种主要组织相容性复合物I类相关受体最初被发现在IgG从母体向幼体的传递中起重要作用，调节血清IGg浓度，并维持血清中IgG的长半衰期。后来发现，FcRn可在不同的位点结合IgG和HSA，并导致IgG和HAS的长半衰期(Chaudhury,C.,J Exp Med,2003,197,315-322；Anderson,C.L.等人，Trends Immunol,2006,27,343-348；Chaudhury,C.等人，Biochemistry,2006,45,4983-4990；和Kim,J.,Bronson等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006,290,G352-360)。正如所预期的，发现FcRn突变导致家族性高分解代谢低蛋白血症(Wani,M.A.等人，Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103,5084-5089)。

HSA的拯救和再循环机制已经阐明，并且涉及：

1.由于在酸性pH下具有高亲和力，FcRn结合内体中的HSA，

2.由此产生的FcRn-HSA复合物(1:1的比例)被送回血流，

3.FcRn-HSA复合物由于在pH 7.4下的亲和力低而解离，从而将HSA释放回循环中。

在表达低水平FcRn的细胞中，HSA将会被内吞到溶酶体中，在那里它被降解为氨基酸。因此，这种FcRn介导的再循环途径是促使IgG和HSA在人中具有长半衰期的主要因素，并具有重要的病理生理学和治疗意义。

根据公开可得的蛋白质表达数据库(Uhlen,M.等人，Science,2015,347,1260419；Lindskog,C.,Expert Rev Proteomics,2016,13,627-629；Tang,Z.,Nucleic Acids Res,2017,45,W98-W102；Uhlen,M.,Science,2017,357；和Papatheodorou,I.等人，NucleicAcids Res,2018,46,D246-D251)，研究了来自不同人体器官的正常组织与癌症组织之间的FcRn表达差异。在31个不同的组织中进行了FcRn表达比较。其中，超过一半(16/31)的癌症组织比其正常组织对应物表达更少的FcRn，而超过四分之一(12/31)的癌症组织表达更多的FcRn，只有3个具有相似的FcRn水平。第一组(16种癌症，表1)是SPE-抗癌药物的特定靶标。

现将通过以下非限制性实施例来说明本发明。

实施例

实施例1：SPE-抗癌药物的靶向作用

认识到当前癌症药物制剂/递送系统的问题，将生物大分子作为高效药物递送系统来进行研究。特别地，研究集中在：1)使用所有天然生物大分子的组分或者天然产生的或通过重组技术产生的蛋白质，以及2)避免化学修饰和缀合。

基于该工作，开发了针对新型药物制剂的SPE(单一蛋白质包封)平台。例如，将SPE应用于DOX包封能产生SPEDOX(单一蛋白质包封的DOX)，其含有两种组分DOX和HSA。与通常通过化学缀合/交联或聚集含有大量HSA分子的HSA-NP不同，SPEDOX提供了稳定且均匀的分子系统，该系统包含封装了可变数目的可被精确控制的DOX分子的单一HSA分子。

基于人中FcRn所致的HSA拯救和再循环的机制(Hoogenboezem,E.N.and Duvall,C.L.,Adv Drug Deliv Rev,2018,130,73-89)，HSA将被那些表达低水平FcRn的细胞吸收并被内吞到溶酶体中进行水解从而产生肽和氨基酸。将这一概念应用于SPE药物递送平台，正常细胞表达正常水平的FcRn，正常水平的FcRn可有效地使SPE药物再循环以维持其在身体内的长循环。另一方面，如果一种类型的癌细胞几乎不表达或不表达FcRn，则SPE药物将被这种类型的癌细胞吸收并被内吞到溶酶体中，在所述溶酶体中HSA被水解并且药物释放出来。所产生的药物然后从溶酶体扩散到胞质溶胶中，在所述胞质溶胶中其通过核孔复合物被转运到细胞核中。因此，几乎不表达或不表达FcRn的癌症类型(表1)为利用SPE药物的治疗提供了理想靶标。

实施例2：组合物1(HSA包封的拓扑替康)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水和1mL 50％的丙二醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入25mg拓扑替康盐酸盐、1.2mL 50％的丙二醇/水和3.8mL去离子水。混合均匀后，将制得的淡黄色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌该红色混合物1小时后。将该淡黄色溶液以12000RPM离心7分钟，取顶部溶液，用紫外光谱仪进行分析。包封前后拓扑替康的光谱变化如图1所示。

实施例3：组合物2(HSA包封的表柔比星)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向4mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入3mL去离子水和1mL 56％的乙醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入72mg表柔比星盐酸盐、2.0mL 56％的乙醇/水和6mL去离子水。混合均匀后，将制得的红色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌该红色混合物1小时后。将该红色溶液以12000RPM离心10分钟，取顶部溶液，用紫外光谱仪和动态光散射仪进行分析。包封前后表柔比星的光谱变化如图2所示，组合物2的粒度分布如图3所示。

实施例4：组合物3(HSA包封的伊达比星)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水和1mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入33mg伊达比星盐酸盐、3.0mL 50％的甲醇/水和6mL去离子水。混合均匀后，将制得的微红色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌该微红色混合物1小时后，通过高真空泵将混合物浓缩至约9mL，将混合物以4400RPM离心10分钟。将组合物3通过Sephadex g 25柱进一步纯化。用紫外光谱仪和动态光散射仪对纯化的HSA包封的伊达比星进行分析。包封前后伊达比星的光谱变化如图4所示，组合物3的粒度分布如图5所示。

实施例5：组合物4(HSA包封的长春新碱)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水和1mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入44mg长春新碱、H

实施例6：组合物5(HSA包封的柔红霉素)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水和1mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入29mg柔红霉素盐酸盐、2.0mL 50％的甲醇/水和6mL去离子水。混合均匀后，将制得的红色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌该红色混合物1小时后，通过高真空泵将混合物浓缩至约7mL，将所得溶液以12000RPM离心10分钟，并取顶部溶液。将组合物5通过Sephadex g 25柱进一步纯化。用紫外光谱仪和动态光散射仪对纯化的HSA包封的柔红霉素进行分析。包封前后柔红霉素的光谱变化如图7所示，组合物5的粒度分布如图8所示。

实施例7：组合物6A(HSA包封的米托蒽醌)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向3mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水，搅拌混合物5分钟。向15mL离心管中加入47mg米托蒽醌二盐酸盐、3.0mL 50％的甲醇/水和7mL去离子水。混合均匀后，将制得的蓝色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌该蓝色混合物1小时后，通过高真空泵将混合物浓缩至约7mL，将所得溶液以12000RPM离心10分钟，并取顶部溶液。将组合物6通过Sephadex g 25柱进一步纯化。用紫外光谱仪和动态光散射仪对纯化的HSA包封的米托蒽醌进行分析。包封前后米托蒽醌的光谱变化如图9所示，组合物6的粒度分布如图10所示。

实施例8：组合物7(HSA包封的多柔比星)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水和1mL 56％的乙醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入22mg多柔比星盐酸盐、2mL 56％的乙醇/水和8mL去离子水。混合均匀后，将制得的红色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌该红色混合物1小时后。将该红色溶液以12000RPM离心7分钟，并取顶部溶液，用紫外光谱仪和动态光散射仪器进行分析。包封前后多柔比星的光谱变化如图11所示，组合物7的粒度分布如图12所示。

实施例9：组合物8(HSA包封的两性霉素B)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水和2mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入25mg两性霉素B、2mL甲醇和10mL去离子水，然后加入7滴1.0M HCl溶液。混合均匀后，将制得的淡黄色溶液逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌该红色混合物1小时后，将淡黄色混合物以12000RPM离心10分钟，并取顶部溶液。将组合物8通过Sephadex g 25柱进一步纯化。用紫外光谱仪和动态光散射仪对纯化的HSA包封的两性霉素B进行分析。包封前后两性霉素B的光谱变化如图13所示，组合物8的粒度分布如图14所示。

实施例10：组合物9(HSA包封的氯法齐明)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水和1mL 56％的乙醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入27mg氯法齐明、2mL乙醇和2滴乙酸以形成暗红色溶液，然后加入6mL去离子水。混合均匀后，将制得的暗红色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌该红色混合物1小时后。将红色混合物以12000RPM离心10分钟，并取出顶部溶液。再将溶液以12000RPM进一步离心10分钟。取出顶部溶液，然后用紫外光谱仪和动态光散射仪进行分析。包封前后氯法齐明的光谱变化如图15所示。

实施例11：组合物10(HSA包封的甲氨蝶呤)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水和1mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入31mg甲氨蝶呤、2.0mL 50％的甲醇/水和7mL去离子水。混合均匀后，将制得的淡黄色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌红色混合物1小时后，用紫外光谱仪和动态光散射仪分析HSA包封的甲氨蝶呤。包封前后甲氨蝶呤的光谱变化如图16所示，组合物10的粒度分布如图17所示。

实施例12：组合物11(HSA包封的利福平)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入9mL去离子水和1mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入44mg利福平、2.0mL甲醇和1mL水。混合均匀后，将制得的红色溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌红色混合物2小时后，将红色混合物以12000RPM离心10分钟，并取顶部溶液，将其用Sephadex g 25柱进一步纯化。用紫外光谱仪分析纯化的HSA包封的利福平。包封前后利福平的光谱变化如图18所示。

实施例13：组合物12(HSA包封的长春碱)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入3mL去离子水和6mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入46mg长春碱、9.0mL 50％的甲醇/水。混合均匀后，将制得的溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌混合物2小时后，通过高真空泵将混合物浓缩至约2mL。再加入8mL去离子水后，将混合物以4400RPM离心10分钟，并取顶部溶液，以12000RPM离心7分钟。用紫外光谱仪分析HSA包封的长春碱。包封前后长春碱的光谱变化如图19所示。

实施例14：组合物13(HSA包封的长春瑞滨)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入2mL去离子水、1mL甲醇和5mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入44mg长春瑞滨、9.0mL 50％的甲醇/水。混合均匀后，将制得的溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌混合物2小时后，通过高真空泵将混合物浓缩至约2mL。再加入8mL去离子水后，将混合物以4400RPM离心10分钟，并取上层溶液，以12000RPM离心8分钟。用紫外分光光度计分析HSA包封的长春瑞滨。包封前后长春碱的光谱变化如图20所示。

实施例15：组合物14(HSA包封的紫杉醇)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向2mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入6mL去离子水，然后加入3mL甲醇和5mL 50％的甲醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入40mg紫杉醇、3.0mL甲醇和7mL 50％的甲醇/水。混合均匀后，将制得的溶液在搅拌下逐渐加入到上述的HSA溶液中。在室温下搅拌混合物1小时后，通过高真空泵将混合物浓缩至约2mL。再加入8mL去离子水后，将混合物以12000RPM离心10分钟，并取顶部溶液，将其用Sephadex g 25柱进一步纯化。

实施例16：对多柔比星的游离形式、HSA/DOX混合物和组合物7的透析研究

向3×3cm的扁平透析管(截留分子量：25kD)中加入3mg多柔比星游离形式、3mg多柔比星当量的HSA/DOX混合物或3mg多柔比星当量的组合物7于2mL去离子水中的红色溶液。将透析管密封，放入装有100mL PBS缓冲液(pH＝7.4)或乙酸盐缓冲液(pH＝5.5)以及磁力搅拌棒的玻璃烧杯中。在持续搅拌的情况下，在不同时间点从玻璃烧杯中取出等分试样(500uL)，并用紫外光谱仪进行分析。计算在不同pH值下从透析管透析出的百分比，所述百分比在图22中示出。很明显，在24小时内，在pH＝7.4时，HSA/DOX混合物几乎100％被透析出来；对于多柔比星游离形式，在pH＝7.4时，它在较早的时间被非常快速地透析出来，但由于在pH＝7.4时溶解性差，它在透析袋中沉淀。最有趣的是注意到HSA包封的DOX在pH＝5.5时从透析管透析出来的速度几乎是在pH＝7.4时的3.5倍。

实施例17：功效研究

对来自实施例8(组合物7)和实施例7(组合物6)的材料进行抗乳腺癌肿瘤的功效研究。记录到，小鼠模型中游离DOX的最大耐受剂量(MTD)为5mg/kg，游离米托蒽醌的MTD为3mg/kg。1、图23和图24中示出了在雌性无胸腺裸小鼠中使用乳腺癌细胞系MDA-MB231进行的异种移植模型功效研究的结果，游离DOX为5kg/mL，来自实施例7的材料为10mg/kg(DOX当量，为游离DOX的MTD的2倍)，来自实施例6的材料为6mg/kg(米托蒽醌当量，为游离米托蒽醌的MTD的2倍)。对于多柔比星，HSA-紧密地结合的Dox在抑制肿瘤生长方面明显优于游离DOX(p<0.05)；其中来自样品7的材料的TGI％为54％，相比之下游离DOX的TGI％为34％。对于米托蒽醌，HSA紧密地结合的米托蒽醌在抑制肿瘤生长方面明显比游离米托蒽醌优良得多(p<0.01)；其中来自样品6的材料的TGI％为58％，相比之下游离米托蒽醌的TGI％为27％。此外，通过比较图25和图26所示的体重变化(经归一化的)，组合物7，虽然含有2倍的DOX当量，但未显示出任何毒性(图25)；然而，来自实施例7的组合物6，尽管含有2倍的米托蒽醌当量，但显示出一些可接受的毒性(仅平均10％的体重减轻，参见图26)。代表性组合物的结果在表2中示出。

表2：使用组合物6和组合物7进行的MDA-MB-231研究中的肿瘤生长抑制

上表给出了研究完成时的最终治疗方案。

媒介物＝无菌水

研究终点＝2000mm

n＝组中未死于意外或未知原因，或为取样而实施安乐死的动物的数量

％TGI＝[1-(MTV

统计显著性(曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验)：ne＝不可评价的，ns＝不显著的，*＝P≤0.05，**＝P≤0.01，***＝P≤0.001，与组1相比

MTV(n)＝TGI分析之日动物(包括具有终点时的肿瘤体积的动物)的数目的中位肿瘤体积(mm

PR＝部分回归；CR＝完全回归

平均BW谷值＝最低组平均体重，表示为与第1天相比的变化％；---表示未观察到平均体重的减轻

TR＝治疗相关的死亡；NTR＝非治疗相关的死亡

实施例18：毒性研究

为了研究组合物7的毒性，使用健康雌性无胸腺裸小鼠(每组4只)以与功效研究(实施例13)相同的途径和相似的时间表进行和完成MTD研究。所得数据在图27中示出。这些数据表明，来自组合物7的材料中的3倍和4倍DOX当量未显示出毒性。

实施例19：第二MTD研究

还完成了使用相同的方案利用不同的剂量进行第二MTD研究。所得数据在图28中示出。这些数据表明，组合物7中的5倍和6倍的DOX当量仍然非常安全。

实施例20：组合物15(IGG包封的多柔比星)的制备

向35mg多柔比星盐酸盐中加入10mL去离子水，摇匀后，形成红色溶液。向该溶液中加入500mg IgG抗体粉末，搅拌混合物1小时，制得红色溶液。然后加入4.0mL 50％的乙醇/H

实施例21：组合物16(IGG包封的表柔比星)的制备

向28mg表柔比星盐酸盐中加入12mL去离子水，摇匀后，形成红色溶液。向该溶液中加入500mg IgG抗体粉末，搅拌混合物1小时，制得红色溶液。然后加入5.0mL 50％的乙醇/H

实施例22：组合物17(HSA包封的多西他赛)的制备

在装有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中，向6.5mL市售HSA溶液(25％HSA)中加入12.5mL去离子水和8.5mL 50％的叔丁醇/水溶液，将混合物搅拌5分钟。向15mL离心管中加入71mg多西他赛、3.0mL乙醇。将所得多西他赛溶液加入到上述HSA中。在室温下搅拌混合物2小时后，将混合物以4400RPM离心10分钟，并取顶部溶液。冻干后，获得HSA包封的多西他赛(组合物17)粉末。

实施例23：组合物18(HSA包封的多柔比星和多西他赛)的制备

向66mg多柔比星盐酸盐中加入14mL去离子水，摇匀后，形成红色溶液。向该溶液中加入1.6g HSA粉末，将混合物搅拌20分钟，然后加入6.0mL 50％的乙醇/H

所有出版物、专利和专利文件均通过引用并入本文，就如同单独地通过引用并入。已参考各种特定的和优选的实施方案及技术描述了本发明。然而，应当理解，在保持在本发明的精神和范围内的同时，可以进行许多变化和修改。