恒温核酸扩增反应管及其应用

技术领域

本发明涉及医学检测工具技术领域，尤其涉及一种恒温核酸扩增反应管及其应用。

背景技术

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)对DNA模板进行特异性扩增，是一种恒温核酸扩增技术，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(36℃-42℃，5-30min)，作为一种恒温技术减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可完成，且可通过荧光分析装置判别是否存在扩增产物，具有对设施和操作要求均较为简单的特点，已广泛应用于生命科学研究、医学检测、农业、食品安全、转基因检测等多个领域。

为了进一步提高RPA的检测灵敏度，有研究者提出了巢式RPA检测方法(nestRPA)(Wanqiu Huang,Dachuan Lin,Cuini Wang,Chaohui Bao,Zhaoqi Zhang,Xinchun Chen,Zheng Zhang,Jian Huang#.The determination of release from isolation of COVID-19patients requires ultra-high sensitivity nucleic acid test technology.JInfect.2020Jul 2；S0163-4453(20)30456-4.doi:10.1016/j.jinf.2020.06.075.)，nestRPA的基本原理是：先用外引物扩增目的基因第一片段，然后用内引物扩增完全位于第一扩增片段内的目的基因第二片段。为了消除酶的荧光信号影响，在第一次的RPA反应体系中不包含荧光探针。在第二次RPA反应中，加入荧光探针。经实验证实nestRPA具有超高灵敏度，将为新冠病毒、流感病毒、猪瘟病毒等各种病毒的尽早发现提供有力的技术支撑。但是，nestRPA要经两次RPA反应，第一次RPA反应完之后，需打开反应管盖子，加入第二次RPA反应所需的内引物和探针等，再盖上反应管盖子进行第二次RPA反应，直至反应结束检测结果。其中，在第一次RPA反应完之后打开反应管盖子的过程中，容易产生核酸气溶胶污染，导致假阳性结果。因此，急需开发一种可以“一管法”完成nestRPA的反应管，在第一次RPA反应完之后无需打开反应管盖子，就可进行第二次RPA反应。

发明内容

本发明要解决目前用于巢式RPA检测的反应管容易产生核酸气溶胶污染的技术问题，提供一种恒温核酸扩增反应管，该反应管能有效避免巢式RPA检测过程中的开盖操作，防止核酸扩增产生气溶胶而造成样本间的核酸污染，使检测结果更加精准。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种恒温核酸扩增反应管，所述反应管包括管体、管盖、和穿刺部件，该穿刺部件设置于管体入口处内侧。

优选的，所述穿刺部件为空心圆锥体形状，在其圆锥侧面上设有多个孔洞，以利于液体离心后下沉管底。

所述管盖的开口可用封口膜密封，所述封口膜包括耐热薄膜型封口膜。

所述管盖的顶端可开设有加样口。

所述管盖在其底部预先密封可刺破封口膜的前提下，管盖内部可通过管盖顶端的加样口加入反应液体。

在本发明的另一个方面，提供了一种应用上述恒温核酸扩增反应管进行巢式RPA检测的方法，包括以下步骤：

将第一次RPA反应的反应体系加入管盖内，再用封口膜封住管盖开口，然后将其置于恒温扩增仪中进行第一次RPA反应；

在管体中加入第二次RPA反应所需的除反应模板外的成分，待第一次RPA反应结束，将封有封口膜的管盖盖入管体中，穿刺部件刺破管盖开口处的封口膜，使管盖内的第一次RPA反应产物流入管体中，作为第二次RPA反应的模板；

混合、离心，在荧光-恒温扩增仪中进行第二次RPA反应；

检测荧光结果。

在本发明的另一个方面，提供了一种应用上述恒温核酸扩增反应管进行巢式RPA检测的方法，包括以下步骤：

先将管盖下面开口用封口膜密封，再从管盖顶端开设的加样口加入第一次RPA反应的反应体系，封上盖子盖紧加样口，然后将其置于恒温仪中在36℃-40℃条件下进行第一次RPA反应；

在管体中加入第二次RPA反应所需的除反应模板外的其它成分，待第一次RPA反应结束，将封有封口膜的管盖盖入管体中，穿刺部件刺破管盖开口处的封口膜，使管盖内的第一次RPA反应产物流入管体中，作为第二次RPA反应的模板；

震动混匀、离心，在荧光-恒温扩增仪中进行第二次RPA反应；

检测荧光结果。

在本发明的另一个方面，提供了另一种实施方式的恒温核酸扩增反应管，所述反应管包括管体、管盖、和穿刺部件，该穿刺部件设置于管盖的顶端。

优选的，所述穿刺部件为穿透管盖顶端的钉子形部件，可于管盖顶端外侧推动该穿刺部件。

所述管盖内可加入液体如PCR反应体系等，管盖的开口可用封口膜密封。

在本发明的另一个方面，还提供了一种应用上述恒温核酸扩增反应管进行巢式RPA检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将第一次RPA反应的反应体系加入管盖内，再用封口膜封住管盖开口，然后将其置于恒温扩增仪中进行第一次RPA反应；

在管体中加入第二次RPA反应所需的除反应模板外的成分，待第一次RPA反应结束，将封有封口膜的管盖盖入管体中，推动管盖顶端外侧的穿刺部件尾端，使穿刺部件的尖锐头部往前运动，刺破管盖开口处的封口膜，使管盖内的第一次RPA反应产物流入管体中，作为第二次RPA反应的模板；

混合、离心，在荧光-恒温扩增仪中进行第二次RPA反应；

检测荧光结果。

在本发明的另一个方面，还提供了上述恒温核酸扩增反应管在制备检测核酸的产品中的应用。

所述核酸包括病毒、细菌、或动植物的核酸。

本发明恒温核酸扩增反应管，通过独特的结构设计，使巢式RPA检测在第一次RPA反应完之后无需打开反应管盖子，就可进行第二次RPA反应，有效避免了气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明恒温核酸扩增反应管的立体结构示意图；

图2是本发明恒温核酸扩增反应管的分解示意图；

图3是本发明恒温核酸扩增反应管的外观示意图；

图4是本发明恒温核酸扩增反应管另一种实施方式的立体结构示意图；

图5是使用本发明恒温核酸扩增反应管进行新冠病毒N基因nestRPA检测的结果图；

其中，在图1-4中：

1-管体，2-管盖，3-穿刺部件，4-穿刺部件圆锥侧面上的孔洞。

具体实施方式

实施例1

如图1-2所示，本发明恒温核酸扩增反应管，包括管体1、管盖2、和穿刺部件3，该穿刺部件3设置于管体1入口处内侧。在本发明的一个具体实施方式中，穿刺部件3为空心圆锥体形状，在其圆锥侧面上设有多个孔4(见图3)。使用本发明反应管进行巢式RPA检测时，第一次RPA反应的反应体系加在管盖2内，并用封口膜(parafilm)封住管盖2开口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次RPA反应。当第一次RPA反应结束，在管体1中预先加入第二次RPA反应所需的除反应模板外的成分，再将封有封口膜的管盖2盖入管体1中，此时设置于管体1入口处内侧的穿刺部件3会刺破管盖2开口处的封口膜，使管盖2内的第一次RPA反应产物通过穿刺部件3圆锥侧面上的孔洞4全部流入管体1中，作为第二次RPA反应的模板，然后，混合、离心，在荧光-恒温扩增仪中39℃条件下进行第二次RPA反应，最后检测荧光结果。由于采用本发明恒温核酸扩增反应管，巢式RPA检测在第一次RPA反应结束之后，无需打开反应管盖子即可进行第二次RPA反应，有效避免了因开盖操作引起的气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。

实施例2

在本发明的另一个具体实施方式中，管盖2的顶端开设有加样口。使用本发明反应管进行巢式RPA检测时，先将管盖2下面开口用封口膜密封，再从管盖2顶端的加样口加入第一次RPA反应的反应体系，封上加样口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次RPA反应。当第一次RPA反应结束，在管体1中预先加入第二次RPA反应所需的除反应模板外的成分，再将封有封口膜的管盖2盖入管体1中，此时设置于管体1入口处内侧的穿刺部件3会刺破管盖2开口处的封口膜，使管盖2内的第一次RPA反应产物通过穿刺部件3圆锥侧面上的孔洞4全部流入管体1中，作为第二次RPA反应的模板，然后，混合、离心，在荧光-恒温扩增仪中39℃条件下进行第二次RPA反应，最后检测荧光结果。由于采用本发明恒温核酸扩增反应管，巢式RPA检测在第一次RPA反应结束之后，无需打开反应管盖子即可进行第二次RPA反应，有效避免了因开盖操作引起的气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。

实施例3

如图4所示，本发明的恒温核酸扩增反应管，包括管体1、管盖2、和穿刺部件3，该穿刺部件3设置于管盖2的顶端。穿刺部件3为穿透管盖2顶端的钉子形部件，可于管盖2顶端外侧推动该穿刺部件3。使用该反应管进行巢式RPA检测时，第一次RPA反应的反应体系加在管盖2内，并用封口膜(parafilm)封住管盖2开口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次RPA反应。当第一次RPA反应结束，在管体1中预先加入第二次RPA反应所需的除反应模板外的成分，再将封有封口膜的管盖2盖入管体1中，然后推动管盖2顶端外侧的穿刺部件3尾端，使穿刺部件3的尖锐头部往前运动，刺破管盖2开口处的封口膜，使管盖2内的第一次RPA反应产物全部流入管体1中，作为第二次RPA反应的模板，然后，混合、离心，在荧光-恒温扩增仪中39℃条件下进行第二次RPA反应，最后检测荧光结果。该实施例的恒温核酸扩增反应管，也使巢式RPA检测在第一次RPA反应结束之后，无需打开反应管盖子即可进行第二次RPA反应，有效避免了因开盖操作引起的气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。

实施例4

1.方法

使用本发明恒温核酸扩增反应管进行nestRPA反应，检测新冠病毒核酸片段(含新冠病毒N基因片段的阳性质粒)，测试反应管性能，包括两个步骤：

步骤一：

nestRPA反应混合液I：5uL 10×RIA Reaction Buffer，10uL RIA Enzyme Mix(包括重组酶、单链DNA结合蛋白及聚合酶),13.5uL RIA Reaction Core Mix，2.4uL正向外引物(10uM)，2.4uL反向外引物(10uM)，1uL dNTP(25mM)。

在灭菌的200uL EP管中配置上述反应混合液I，加入5uL待测样品，2.5uL乙酸镁(280mM)，立即进行振荡混匀，离心后使用移液枪，将全部溶液转移至恒温核酸扩增反应管管盖内，封膜(Parafilm封口膜)，平放，39℃恒温室孵育10min。

步骤二：

nestRPA反应混合液II：5uL 10×RIA Reaction Buffer，10uL RIA Enzyme Mix(包括重组酶、单链DNA结合蛋白及聚合酶)，13.5uL RIA Reaction Core Mix，2.4uL正向内引物(10uM)，2.4uL反向内引物(10uM)，0.6uL Probe N，1uL exonuclease III，1uL dNTP(25mM)。

在灭菌的200uL EP管中配置上述反应混合液II，预先加入恒温核酸扩增反应管管体内，待步骤一孵育完成后，将封膜的管盖扣于管体，用力向下按压，穿刺部件刺破封膜，然后震荡混匀2000转/分离心1分钟，第一次反应液即可在不打开盖子的前提下，顺利进入第二次反应体系中，开始第二次核酸扩增反应。将恒温核酸扩增反应管置于恒温荧光检测仪中，设置39℃，反应时间30min，即可获得结果。

表1检测新冠N基因使用的特异性引物对与探针序列

2.结果

使用本发明恒温核酸扩增反应管进行新冠病毒N基因nestRPA检测，阳性质粒样品检测结果为阳性，阴性对照(其他无关序列)及空白对照(水)样品检测结果为阴性(见图5)。

以上所述的实施方式较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。