细胞染色的质控品制备方法

技术领域

本发明涉及细胞染色检测领域，特别涉及细胞染色的质控品制备方法。

背景技术

癌细胞从原发部位脱落，进入人体外周血，被称为循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cell，CTC)。肺癌主要起源于支气管的黏膜上皮，目前已经成为全球发病率最高、死亡人数最多的癌症。在肺癌患者中，肺癌循环肿瘤细胞通过血液传播转移到身体的其他器官，是导致患者死亡的主要原因。因此，检测外周血中的肺癌循环肿瘤细胞的含量的变化，对实时监测患者体内肺癌细胞的动态、评估治疗效果等具有积极的意义。

但是，现有的肺癌循环肿瘤细胞染色试剂盒对外周血中肺癌循环肿瘤细胞的检测准确性不高，容易出现假阳性/假阴性和非特异性等结果，使得医生无法做出准确的判断，给后续的分析、诊断等带来极大的影响。虽然中国专利CN107153021B公开一种循环肿瘤细胞染色的质控品制备方法，但是此方法富集肺癌循环肿瘤细胞的效果不好。

上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。

发明内容

本发明的主要目的是提出细胞染色的质控品制备方法，旨在解决现有染色试剂盒检测肺癌循环肿瘤细胞准确性不高的技术问题。

为实现上述目的，本发明提出一种细胞染色的质控品制备方法，包括以下步骤：

(1)将E-Cadherin免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得E-Cadherin免疫磁珠工作液，将CEA免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得CEA免疫磁珠工作液，将CD45免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得CD45免疫磁珠工作液；

(2)将所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、所述CEA免疫磁珠工作液、所述CD45免疫磁珠工作液、白细胞和肺癌循环肿瘤细胞进行混合，得到第一混合液；

(3)去除所述第一混合液中的液体，加入固定液固定，得到肺癌循环肿瘤细胞的质控品。

可选地，所述E-Cadherin免疫磁珠与所述CEA免疫磁珠的数量比为大于或等于3：4，且小于或等于4：3；所述E-Cadherin免疫磁珠、所述CEA免疫磁珠的数量和与所述CD45免疫磁珠的数量的比为大于或等于4：3，且小于或等于5：2；所述白细胞与所述肺癌循环肿瘤细胞的数量比为大于或等于1：10，且小于或等于10：1。

第二方面，本发明提出另外一种细胞染色的质控品制备方法，包括以下步骤：

(1)将E-Cadherin免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得E-Cadherin免疫磁珠工作液，将CEA免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得CEA免疫磁珠工作液，将CD45免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得CD45免疫磁珠工作液；

(2)将所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、所述CEA免疫磁珠工作液与肺癌循环肿瘤细胞进行混合，得到第二混合液，将所述CD45免疫磁珠工作液与白细胞混合，得到第三混合液；

(3)分别去除所述第二混合液和所述第三混合液中的液体，并加入固定液固定，得到肺癌循环肿瘤细胞的质控品。

可选地，所述E-Cadherin免疫磁珠与所述CEA免疫磁珠的数量比为大于或等于3：4，且小于或等于4：3。

在本发明制备方法中，所述E-Cadherin免疫磁珠通过E-Cadherin抗体特异性地结合肺癌循环肿瘤细胞表面抗原，所述CEA免疫磁珠通过CEA抗体特异性地结合肺癌循环肿瘤细胞表面抗原，所述E-Cadherin免疫磁珠、所述CEA免疫磁珠与所述肺癌循环肿瘤细胞形成磁珠-抗体-细胞复合物，检测者对所述复合物进行染色，即得到特异性结合的染色结果；所述CD45免疫磁珠免疫磁珠通过CD45抗体特异性地结合白细胞表面抗原，作为肺癌循环肿瘤细胞染色结果的阴性对照。采用本发明细胞染色的质控品制备方法，可以对不同的肺癌循环肿瘤细胞染色试剂盒进行质控，例如对染色试剂盒的精密度、准确度、试剂变化等指标进行评价，从而监测染色试剂盒是否出现异常；本发明细胞染色的质控品制备方法通过抗原与抗体的特异性结合，质控结果的可信度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为实施例一细胞保存一周的质控结果截图；

图2为实施例一细胞保存一个月的质控结果截图；

图3为实施例一细胞保存三个月的质控结果截图；

图4为实施例三细胞保存一周的质控结果截图；

图5为实施例三细胞保存一个月的质控结果截图；

图6为实施例三细胞保存三个月的质控结果截图；

图7为对比例一细胞保存一周的质控结果截图；

图8为对比例一细胞保存一个月的质控结果截图；

图9为对比例一细胞保存三个月的质控结果截图；

图10为对比例五细胞保存一周的质控结果截图；

图11为对比例五细胞保存一个月的质控结果截图；

图12为对比例五细胞保存三个月的质控结果截图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。

本发明提出一种细胞染色的质控品制备方法，包括以下步骤：(1)将E-Cadherin免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得E-Cadherin免疫磁珠工作液，将CEA免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得CEA免疫磁珠工作液，将CD45免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得CD45免疫磁珠工作液；(2)将所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、所述CEA免疫磁珠工作液、所述CD45免疫磁珠工作液、白细胞和肺癌循环肿瘤细胞进行混合，得到第一混合液；(3)去除所述第一混合液中的液体，加入固定液固定，得到肺癌循环肿瘤细胞的质控品。

在本发明制备方法中，E-钙粘蛋白(E-Cadherin)和癌胚抗原(CarcinoembryonicAntigen，CEA)是常用的肿瘤标志物，可以结合所述肺癌循环肿瘤细胞，用于监测肺癌的治疗和鉴定。由于有些肺癌循环肿瘤细胞的表面可能只表达E-Cadherin抗原或者CEA抗原，所以所述E-Cadherin抗体和所述CEA抗体无法100％地结合所有的肺癌循环肿瘤细胞。两种抗体共同结合所述肺癌循环肿瘤细胞，增强了所述肺癌循环肿瘤细胞的特异性富集，提高了质控效果。CD45抗体可以特异性结合白细胞表面抗原，是常用的检测和富集白细胞的抗体。

在本发明制备方法中，所述E-Cadherin免疫磁珠通过E-Cadherin抗体特异性地结合肺癌循环肿瘤细胞，所述CEA免疫磁珠通过CEA抗体特异性地结合肺癌循环肿瘤细胞，所述E-Cadherin免疫磁珠、所述CEA免疫磁珠与所述肺癌循环肿瘤细胞形成磁珠-抗体-细胞复合物，检测者对所述双磁珠-抗体-细胞复合物进行染色，即得到特异性结合的染色结果；所述CD45免疫磁珠免疫磁珠通过CD45抗体特异性地结合白细胞表面抗原，作为肺癌循环肿瘤细胞染色结果的阴性对照。采用本发明细胞染色的质控品制备方法，可以对不同的肺癌循环肿瘤细胞染色试剂盒进行质控，例如对染色试剂盒的精密度、准确度、试剂变化等指标进行评价，从而监测染色试剂盒是否出现异常；本发明试剂盒的操作简单，通过抗原与抗体的特异性结合，质控结果的可信度高。

可选地，所述E-Cadherin免疫磁珠与所述CEA免疫磁珠的数量比为大于或等于3：4，且小于或等于4：3；所述E-Cadherin免疫磁珠、所述CEA免疫磁珠的数量和与所述CD45免疫磁珠的数量的比为大于或等于4：3，且小于或等于5：2；所述白细胞与所述肺癌循环肿瘤细胞的数量比为大于或等于1：10，且小于或等于10：1。

当所述E-Cadherin免疫磁珠与所述CEA免疫磁珠的数量比为小于3：4时，所述E-Cadherin免疫磁珠的含量偏少，与所述CEA免疫磁珠竞争结合所述肺癌循环肿瘤细胞的能力偏弱，使得最终富集于所述E-Cadherin免疫磁珠和所述CEA免疫磁珠上的所述肺癌循环肿瘤细胞数量变少，对质控结果产生影响。当所述E-Cadherin免疫磁珠与所述CEA免疫磁珠的数量比为大于4：3时，所述CEA免疫磁珠的含量偏少，与所述E-Cadherin免疫磁珠竞争结合所述肺癌循环肿瘤细胞的能力偏弱，使得最终富集于所述E-Cadherin免疫磁珠和所述CEA免疫磁珠上的所述肺癌循环肿瘤细胞数量变少，也对质控结果产生影响。

当所述E-Cadherin免疫磁珠、所述CEA免疫磁珠的数量和与所述CD45免疫磁珠的数量的比小于4：3时，所述CD45免疫磁珠的含量偏少，结合混合细胞(白细胞和肺癌循环肿瘤细胞)中的白细胞的效果不佳，导致富集的白细胞数量偏少，对照效果不佳。当所述E-Cadherin免疫磁珠、所述CEA免疫磁珠的数量和与所述CD45免疫磁珠的数量的比大于5：2时，所述CD45免疫磁珠的含量偏多，影响E-Cadherin和CEA免疫磁珠结合混合细胞(白细胞和肺癌循环肿瘤细胞)中的肺癌循环肿瘤细胞，进而影响质控结果。

当所述白细胞和所述肺癌循环肿瘤细胞的数量比小于1：10时，所述白细胞的数量偏少，对照作用不足。当所述白细胞和所述肺癌循环肿瘤细胞的数量比大于10：1时，所述肺癌循环肿瘤细胞的数量偏少，同样对质控结果产生影响。优选地，所述白细胞和所述肺癌循环肿瘤细胞的数量比为1：1。

本发明提出第二种细胞染色的质控品制备方法，包括以下步骤：(1)将E-Cadherin免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得E-Cadherin免疫磁珠工作液，将CEA免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得CEA免疫磁珠工作液，将CD45免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得CD45免疫磁珠工作液；(2)将所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、所述CEA免疫磁珠工作液与肺癌循环肿瘤细胞进行混合，得到第二混合液，将所述CD45免疫磁珠工作液与白细胞混合，得到第三混合液；(3)分别去除所述第二混合液和所述第三混合液中的液体，并加入固定液固定，得到肺癌循环肿瘤细胞的质控品。

第二种制备方法的有益效果与第一种制备方法的有益效果一致，在此不再赘述。

本发明两种制备方法也可以包括所述白细胞的采集和所述肺癌循环肿瘤细胞的准备过程。所述白细胞的采集可以通过常规手臂静脉采血的方式，采集受试者的外周血。白细胞的采集步骤主要包括淋巴细胞分离液(Ficoll)的提前准备、缓冲液的清洗、离心、白细胞的吸取分离等步骤，具体步骤请参阅现有技术。在所述白细胞的采集步骤中，离心机可以采用低挡转速，并且设置为缓慢降速；吸取分层液中的白细胞要轻柔缓慢；可以再次对上清液离心并吸取白细胞，这些都有助于提高白细胞的采集率。所述肺癌循环肿瘤细胞的准备包括细胞的培养、细胞的清洗、细胞的消化(可采用胰蛋白酶)、细胞的悬浮和细胞的稀释等过程，具体步骤也请参阅现有技术。在所述肺癌循环肿瘤细胞的准备工作中，操作也要轻柔缓慢，以避免造成细胞的破碎，影响后续实验。所述肺癌循环肿瘤细胞可以包含多种肺癌细胞系的至少一种，例如人非小细胞肺癌腺癌细胞系(NCI-H1993)、人肺腺癌细胞系(NCI-H1975)、人肺癌表皮细胞(Calu-1)或者人肺癌细胞系(GLC-15)等。

实施例一

1、将白细胞与NCI-H1993细胞(数量比为1:10)混合，总体积为700ul；

2、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

3、用步骤2同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

4、取30ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、40ul的所述CEA免疫磁珠工作液、50ul的所述CD45免疫磁珠工作液加入步骤1中的细胞混合液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，加入200μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

在上述步骤中，为了避免细胞受到伤害后发生破损，影响后续的验证结果，溶液的混合等操作要轻柔缓慢。固定液的浓度和固定时间可以根据不同的实验条件和细胞状态进行调整。

以当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品为实验对象，按照染色试剂盒说明书对质控品进行染色。细胞的染色率将近100％。图1为保存一周的质控结果截图；图2保存一个月的质控结果截图；图3为保存三个月的质控结果截图。分别计算上述实验组中染色细胞与原始细胞的数量比，从而得到免疫磁珠结合细胞的结合率。计算结果请参阅表1。

表1实施例一中染色细胞与原始细胞的数量比

表1的结果显示，在本发明第一种细胞染色的质控品制备方法中，当E-Cadherin免疫磁珠与CEA免疫磁珠的数量比为3：4，E-Cadherin免疫磁珠、CEA免疫磁珠的数量和与CD45免疫磁珠的数量的比为7：5，白细胞与肺癌循环肿瘤细胞的数量比为1：10时，免疫磁珠与细胞的结合率可达到99％，说明本发明第一种制备方法的可信度高；质控品的稳定保存期长达三个月，说明本发明第一种制备方法制备出的质控品性质稳定。

实施例二

1、将白细胞与NCI-H1993细胞(细胞数比值为10:1)混合，总体积为700ul；

2、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

3、用步骤2同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

4、取40ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、30ul的所述CEA免疫磁珠工作液、28ul的所述CD45免疫磁珠工作液加入步骤1中的细胞混合液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，加入200μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

以当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品为实验对象，按照染色试剂盒说明书对质控品进行染色。染色结果与实施例一的染色结果一致，不再展示。染色细胞与原始细胞的数量比结果请参阅表2。

表2实施例二中染色细胞与原始细胞的数量比

以上结果显示，在本发明第一种细胞染色的质控品制备方法中，当E-Cadherin免疫磁珠与CEA免疫磁珠的数量比为4：3，E-Cadherin免疫磁珠、CEA免疫磁珠的数量和与CD45免疫磁珠的数量的比为5：2，白细胞与肺癌循环肿瘤细胞的数量比为10：1时，免疫磁珠与细胞的结合率也可以达到99％，再次说明本发明第一种制备方法的可信度高；质控品的稳定保存期长达三个月，再次说明本发明第一种制备方法制备出的质控品性质稳定。

实施例三

1、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

2、用步骤1同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

3、取30ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、40ul的所述CEA免疫磁珠工作液，加入350ul的NCI-H1993细胞液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

4、取30ul的所述CD45免疫磁珠工作液，加入350ul的白细胞液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将3和4步的离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，分别用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，分别加入100μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

图4为保存一周的质控结果截图；图5保存一个月的质控结果截图；图6为保存三个月的质控结果截图。染色细胞与原始细胞数量比的计算结果请参阅表3。

表3实施例三中染色细胞与原始细胞的数量比

表3的结果显示，在本发明第二种细胞染色的质控品制备方法中，当E-Cadherin免疫磁珠与CEA免疫磁珠的数量比为3：4时，免疫磁珠与细胞的结合率达到99％，说明本发明第二种制备方法的可信度高；质控品的稳定保存期长达三个月，说明本发明第二种制备方法制备出的质控品性质稳定。

实施例四

1、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

2、用步骤1同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

3、取40ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、30ul的所述CEA免疫磁珠工作液，加入350ul的NCI-H1993细胞液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

4、取30ul的所述CD45免疫磁珠工作液，加入350ul的白细胞液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将3和4步的离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，分别用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，分别加入100μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品的染色结果与实施例三类似，不再展示。染色细胞与原始细胞数量比的计算结果请参阅表4。

表4实施例四中染色细胞与原始细胞的数量比

如表4所示，在本发明第二种细胞染色的质控品制备方法中，当E-Cadherin免疫磁珠与CEA免疫磁珠的数量比为4：3时，免疫磁珠与细胞的结合率可达到99％，再次说明本发明第二种制备方法的可信度高；质控品的稳定保存期也长达三个月，再次说明本发明第二种制备方法制备出的质控品性质稳定。

对比例一

1、将白细胞与NCI-H1993细胞(细胞数比值为1:1)混合，总体积为700ul；

2、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

3、用步骤2同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

4、取30ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、40ul的所述CEA免疫磁珠工作液、60ul的所述CD45免疫磁珠工作液加入步骤1中的细胞混合液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，加入200μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品的染色结果请参阅图7至图9。图7为保存一周的质控结果截图；图8保存一个月的质控结果截图；图9为保存三个月的质控结果截图。染色细胞与原始细胞的数量比结果请参阅表5。

表5对比例一中染色细胞与原始细胞的数量比

表5的结果显示，当E-Cadherin免疫磁珠与CEA免疫磁珠的数量比为3：4，E-Cadherin免疫磁珠、CEA免疫磁珠的数量和与CD45免疫磁珠的数量的比为7：6时，免疫磁珠与细胞的结合率大约在93％左右，结合效果不如实施例一和实施例二。

对比例二

1、将白细胞与NCI-H1993细胞(细胞数比值为1:1)混合，总体积为700ul；

2、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

3、用步骤2同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

4、取40ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、30ul的所述CEA免疫磁珠工作液、20ul的所述CD45免疫磁珠工作液加入步骤1中的细胞混合液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，加入200μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品的染色结果与对比例一类似。染色细胞与原始细胞的数量比计算结果请参阅表6。

表6对比例二中染色细胞与原始细胞的数量比

表6的结果表明，当E-Cadherin免疫磁珠与CEA免疫磁珠的数量比为4：3，E-Cadherin免疫磁珠、CEA免疫磁珠的数量和与CD45免疫磁珠的数量的比为7：2时，免疫磁珠与细胞的结合率大约在90％左右，结合效果也不如实施例一和实施例二。

对比例三

1、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

2、用步骤1同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

3、取30ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、50ul的所述CEA免疫磁珠工作液，加入350ul的NCI-H1993细胞液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

4、取30ul的所述CD45免疫磁珠工作液，加入350ul的白细胞液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将3和4步的离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，分别用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，分别加入100μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

以当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品为实验对象，按照染色试剂盒说明书对质控品进行染色。本实施例的染色结果与对比例一类似。染色细胞与原始细胞的数量比计算结果请参阅表7。

表7对比例三中染色细胞与原始细胞的数量比

表7中，当E-Cadherin免疫磁珠与CEA免疫磁珠的数量比为3：5时，免疫磁珠与细胞的结合率大约在94％左右，说明结合效果不如实施例三和实施例四。

对比例四

1、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

2、用步骤1同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

3、取40ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、20ul的所述CEA免疫磁珠工作液，加入350ul的NCI-H1993细胞液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

4、取30ul的所述CD45免疫磁珠工作液，加入350ul的白细胞液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将3和4步的离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，分别用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，分别加入100μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

以当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品为实验对象，按照染色试剂盒说明书对质控品进行染色。染色结果的图片与对比例一类似，不再展示。染色细胞与原始细胞的数量比结果请参阅表8。

表8对比例四中染色细胞与原始细胞的数量比

表8的结果显示，当E-Cadherin免疫磁珠与CEA免疫磁珠的数量比为2：1时，免疫磁珠与细胞的结合率大约在93％左右，结合效果也不如实施例三和实施例四。

对比例五

1、将白细胞与NCI-H1993细胞(细胞数比值1：10

2、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

3、用步骤2同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

4、取30ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、40ul的所述CEA免疫磁珠工作液、50ul的所述CD45免疫磁珠工作液加入步骤1中的细胞混合液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，加入200μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

按照染色试剂盒说明书，对当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品进行染色。图10为保存一周的质控结果截图；图11保存一个月的质控结果截图；图12为保存三个月的质控结果截图。染色细胞与原始细胞的数量比计算结果请参阅表9。

表9对比例五中染色细胞与原始细胞的数量比

以上结果显示，当所述白细胞和所述肺癌循环肿瘤细胞的细胞数比值为1：10

对比例六

1、将白细胞与NCI-H1993细胞(细胞数比值10

2、取30ul的E-Cadherin免疫磁珠，加入1ml的结合缓冲液，弃上清，用1ml的结合缓冲液将磁珠重悬，制成E-Cadherin免疫磁珠工作液；

3、用步骤2同样的方法处理CEA免疫磁珠和CD45免疫磁珠，制成CEA免疫磁珠工作液和CD45免疫磁珠工作液；

4、取40ul的所述E-Cadherin免疫磁珠工作液、30ul的所述CEA免疫磁珠工作液、28ul的所述CD45免疫磁珠工作液加入步骤1中的细胞混合液，颠倒混匀，弃上清，重复该操作3次；

5、将离心管于4℃冰箱中旋转混匀2h，旋转速度为15转/分钟；

6、旋转混匀后，弃上清液，用50μL的1.6％固定液固定30min，每10min重悬一次；

7、弃上清液，加入200μL的结合缓冲液，并于4℃保存备用。

当天制备、保存一周、保存一个月、保存三个月的质控品的染色结果与对比例五类似，不再展示。染色细胞与原始细胞的数量比结果请参阅表10。

表10对比例六中染色细胞与原始细胞的数量比

表10的结果显示，当所述白细胞和所述肺癌循环肿瘤细胞的细胞数比值为10

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。