一种微生物复合菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种微生物复合菌剂及其应用。

背景技术

目前化肥和农药的过量使用，不仅造成了一系列生态环境的污染，而且严重危害人们健康及农业和社会的可持续化发展。微生物菌剂是一种绿色环保、生态友好的肥料，具有增加土壤肥力，减少化肥和农药使用，净化和修复土壤，降低植物病害，提质增产，提高食品安全等特点，是实现农业可持续化发展的重要途径。微生物菌剂在世界范围内已得到了广泛应用。

单一微生物菌剂存在功能单一、适应能力差等问题。将不同功能菌株组合，得到比单一微生物菌剂促生能力更强、更稳定的微生物复合菌剂，是微生物菌剂发展的趋势。目前，微生物复合菌剂的研究已经进入到产业化阶段，受到了国内外生物农业公司的重点关注。如王继雯等(王继雯，赵俊伟，刘莉，等.M-14复合生物肥料抗小麦孢囊线虫及增产效果[J].中国生物防治学报.2016，32(5)：676-680)施用M-14微生物复合菌剂，使小麦增产14.3％，胞囊线虫侵染率减少43.4％-70.8％。TJ Technology公司开发了一个名为QuickRoots的微生物复合菌剂，能够改善作物在苗期的营养元素供给，以小麦为例其增产量可达220-250kg/ha左右(白洋，钱景美，周俭民，等.农作物微生物组：跨越转化临界点的现代生物技术[J].中国科学院院刊.2017，32(3)：260-265)；TJ Technology公司于2014年以3亿美元的价格将该技术转让给孟山都，此一例足以彰显微生物复合菌剂的应用潜力和市场规模。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为获得一种具有促生特性的微生物复合菌剂。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种微生物复合菌剂。

本发明微生物复合菌剂的活性成分由解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和菌种A组成；所述菌种A为短波单胞菌(Brevundimonas sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)或不动杆菌(Acinetobacter sp.)。

上述微生物复合菌剂中，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FH-1；

所述短波单胞菌(Brevundimonas sp.)为短波单胞菌(Brevundimonas sp.)N-YM-3；

所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)为假单胞菌(Pseudomonas sp.)G3-6；

所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LSI-1、芽孢杆菌(Bacillus sp.)JFH-1或芽孢杆菌(Bacillus sp.)IF-2或芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZPC-1；

所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)为不动杆菌(Acinetobacter sp.)KYM-3。

上述微生物复合菌剂中，所述微生物复合菌剂的活性成分中解淀粉芽孢杆菌和菌种A的菌落形成单位(cfu)数目比为1∶1。

本发明进一步提供了上述微生物复合菌剂在下述任一中的应用：

A1)在促植物生长中的应用；

A2)在提高植物苗长中的应用；

A3)在提高植物根长中的应用；

A4)在提高植物鲜重中的应用；

A5)在提高植物干重中的应用。

A6)在抑制植物病原菌中的应用。

本发明还提供了利用上述微生物复合菌剂促植物生长的方法。

本发明一种促植物生长的方法包括将上述微生物复合菌剂施加于栽种植物的土壤中，以促进植物的生长。

上述方法中，所述微生物复合菌剂的施加剂量为每克(g)土壤1×10

本文中，所述植物为如下任一种：

B1)单子叶植物；

B2)双子叶植物；

B3)稻属植物；

B4)水稻。

本发明通过将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FH-1与其他7株细菌按照菌落形成单位(cfu)数目比1∶1的比例复配成微生物复合菌剂，利用盆栽实验筛选除了具有高效促水稻根长、苗长、鲜重和干重的微生物复合菌剂FN，能显著促进水稻的生长，同时还具有抑制水稻病原菌的能力。

附图说明

图1为不同菌剂对水稻苗长(A)、根长(B)、鲜重(C)、干重(D)的生长影响。

图2为水稻的生长图。

图3为不同菌剂对水稻干重(A)、鲜重(B)、苗长和根长(C)的生长影响。

图4为不同菌剂对作物病原菌的抑制效果。

图5为不同菌剂对作物病原菌的抑制率。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明下述实施例中各试验菌株的来源：

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FH-1(简称F)记载于“李晴晴，徐松，赵维，等.根际微生物组介导的解淀粉芽孢杆菌FH-1对水稻的促生机制[J/OL].微生物学报.”；

短波单胞菌(Brevundimonas sp.)N-YM-3(简称N)记载于“Song Xu etal.Isolation and potential of Ochrobactrum sp.NW-3to increase the growth ofcucumber，International Journal of Agricultural Policy and Research，2016”；

假单胞菌(Pseudomonas sp.)G3-6(简称G)记载于“王欢，王敬敬，徐松，et al.有机磷降解菌的筛选及其促生特性[J].微生物学报.2017，57(5)：47-60”；

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LSI-1(简称L)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)JFH-1(简称J)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)IF-2(简称I)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZPC-1(简称Z)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)KYM-3(简称K)均由中国科学院天津工业生物技术研究所应用微生物生态工程实验室筛选、保藏。

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F679记载于“李晴晴，徐松，赵维，等.根际微生物组介导的解淀粉芽孢杆菌FH-1对水稻的促生机制[J/OL].微生物学报.”。

本发明下述实施例中供试土壤为天津市东丽区华明镇的耕地土壤，土壤类型为黄壤。土壤性质为：有机质1.78％；全氮3.00g/kg，全磷0.39g/kg，全钾5.13g/kg；速效氮37.33mg/kg；速效磷9.57mg/kg；速效钾61.84mg/kg；pH 7.69。

本发明下述实施例中供试作物为水稻(内5优8015杂交稻)，由浙江农科种业有限公司购买。

本发明下述实施例中LB液体培养基，无机磷培养基，有机磷培养基，解钾培养基，CAS培养基，阿须贝固氮培养基，PDA培养基，CAS染液和Salkowski’s显色液记载于“李晴晴，徐松，赵维，等.根际微生物组介导的解淀粉芽孢杆菌FH-1对水稻的促生机制[J/OL].微生物学报；王欢，王敬敬，徐松，等.有机磷降解菌的筛选及其促生特性[J].微生物学报.2017，57(5)：47-60和银婷婷，王敬敬，柳影，等.高效解磷菌的筛选及其促生机制的初步研究[J].生物技术通报.2015，31(12)：234-242”。

本发明下述实施例中SPX-250B5生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司；RXZ-500B-LED人工智能气候培养箱，江南仪器厂。

本发明下述实施例中所有数据为均值±标准差。通过t检验分析不同菌剂间每盆水稻苗长、根长、鲜重和干重的差异显著性(P≤0.05)。所有统计分析均使用IBM SPSSstatistic(Version21.0)进行，所有作图均使用Origin2016完成。

实施例1微生物复合菌剂的筛选

一、菌株的培养

将-80℃保藏的菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FH-1(简称F)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LSI-1(简称L)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)JFH-1(简称J)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)IF-2(简称I)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZPC-1(简称Z)、短波单胞菌(Brevundimonas sp.)N-YM-3(简称N)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)KYM-3(简称K)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)G3-6(简称G)分别按照5％的比例接种到LB液体培养基中，在30℃摇床，180r/min，活化培养24h。

二、水稻盆栽筛选实验

1、复合菌剂的制备

各菌株活化24h后分别以5％的接种量在LB培养基培养60h后显微计数，再用自来水稀释至8×10

2、复合菌剂的筛选实验

将水稻种子放入蒸馏水中，30℃静置孵育24h，再将水稻种子转移到湿纱布中，30℃孵育24h，直至水稻种子全部露白。将供试土壤在阴凉避光处晾干，过5mm筛，取240g供试土壤装入直径为8em的花盆中，每个花盆播种13粒露白的水稻种子，播种5d出现1叶幼苗，移除生长不好的幼苗和花盆，最终保持每个花盆11颗长势基本均一的幼苗。然后按照步骤1设置的8个菌剂组在每个花盆施加30mL相应的菌剂满足1×10

结果如图1所示，通过对每盆水稻的苗长(A)、根长(B)、鲜重(C)、干重(D)数据的综合分析发现，与CK相比，菌剂组FN显著提升水稻的苗长20.79％、根长26.67％和鲜重74.84％，菌剂组FL显著提升水稻的鲜重68.23％和干重43.14％，菌剂组FJ、FK和FG显著提升水稻的鲜重分别为61.19％、75.48％和63.75％，菌剂组FZ显著提升水稻的干重42.48％(P≤0.05)。与其他处理组相比，菌剂组FN可提升水稻苗长7.12-15.47％、根长1.64-18.82％。除了菌剂组FK，与其他处理组相比，菌剂组FN可提升水稻鲜重3.93-32.90％。除了菌剂组FL和FZ，与其他处理组相比，菌剂组FN可提升水稻干重3.48-17.51％。另外，菌剂组FI的苗长低于菌剂组F，菌剂组FJ的根长低于菌剂组F。

综合上述，复合菌剂FN是7种微生物复合菌剂中综合效果较好的微生物复合菌剂。

三、验证复合菌剂FN促进水稻生长的能力

通过扩大处理组之间的重复，进一步验证复合菌剂FN促进水稻生长的能力。

1、菌剂的制备

F和N菌液各活化24h后分别以5％的接种量在LB培养基培养60h，再用自来水稀释至8×10

2、菌剂促进水稻生长的能力试验

将水稻种子放入蒸馏水中，30℃静置孵育24h，再将水稻种子转移到湿纱布中，30℃孵育24h，直至水稻种子基本全部露白。水稻露白后，再将240g供试土壤装入直径为8em的花盆中，每个花盆放适量的水稻种子，播种后5d出现1叶幼苗，移除生长不好的幼苗和花盆，最终保持每个花盆11颗长势基本均一的幼苗。然后按照步骤1设置的4个菌剂组在每个花盆施加30mL相应的菌剂满足1×10

结果如图3所示，图3中A、B、C分别为水稻幼苗地上的长度(苗长)、地下的长度(根长)、鲜重和干重指标。菌剂组FN、菌剂组F、菌剂组N相比CK的苗长分别增加了32.11％、19.25％、23.00％；菌剂组FN、菌剂组F、菌剂组N相比与CK的根长分别增加了77.09％、46.05％、35.42％。菌剂组FN、菌剂组F、菌剂组N相比CK的地上鲜重分别增加了130.57％、89.22％、93.82％；菌剂组FN、菌剂组F、菌剂组N相比与CK的地下鲜重分别增加了202.70％、101.47％、80.64％。菌剂组FN、菌剂组F、菌剂组N相比CK的地上干重分别增加了198.00％、149.00％、163.27％；菌剂组FN、菌剂组F、菌剂组N相比与CK的地下干重分别增加了94.60％、61.26％、52.25％。

综合地上和地下指标，可以明显看出，复合菌剂FN显著促进水稻幼苗生长，且显著优于单菌剂。

四、复合菌剂FN抑制植物病原菌的能力

F和N菌液各活化24h后分别以5％的接种量在LB培养基培养24h。将作物病原菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F679在PDA平板上活化3d后，转接到新的PDA平板上，同时用移液枪吸取培养24h的菌液F、N和FN各5μL，分别接种在PDA平板上，30℃静置培养4d观察是否有拮抗现象，以不接细菌为对照，每个处理组设置4个重复。拮抗能力测定公式：

抑菌率(％)＝(对照真菌直径-处理真菌直径)÷对照真菌直径×100％

结果如图4和图5所示，菌剂组FN的抑菌率为65.44％、菌剂组F的抑菌率为62.75％、菌剂组N和CK的抑菌率为0％。相比菌剂组F，菌剂组FN的抑菌率增加了4.29％。

综上所述，可以看出，复合菌剂FN显著抑制作物病原菌，且优于单菌剂。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。