纳米载体及含其的药物递送系统

技术领域

本发明涉及一种纳米载体及其应用。

背景技术

纳米载体是一种具有纳米尺度的亚微粒药物载体输送系统，可以通过包载等方式将药物分子包封在保护性壳状结构内。经检索，尽管目前利用纳米载体将药物递送至M2型巨噬细胞的研究已有很多，但是这些药物载体的递送并不是特异性递送因此存在药效差的问题,抑或是此类纳米药物存在引起全身性免疫反应等毒副作用的风险。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，一方面提供了一种药物纳米载体，所述纳米载体的靶向配体包括特异性靶向M2型巨噬细胞的多肽，多肽的序列可为YEQDPWGVKWWY。

可选地，所述纳米载体载药用的递送材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。

可选地，所述纳米载体包含有用于助其减少被给药对象的网状内皮系统RES捕获的囊泡，载药用的递送材料被内置在该囊泡中；当然，使用载体时，药物亦随递送材料内含在所述囊泡中。

囊泡在本专利中为本领域常见涵义，意指类似于细胞膜那样，由两亲性分子形成的具有封闭双层结构的分子有序组合体。

任选地，所述囊泡的膜表面含有CD47蛋白。

任选地，所述囊泡源于高表达CD47蛋白细胞的细胞膜，高表达意指该细胞比给药对象正常细胞，在细胞膜表面含有更高水平的CD47，多为癌细胞，如黑色素瘤细胞的细胞膜，可选为B16-OVA细胞的细胞膜。具体制备时，可直接使用细胞匀浆裂解得到的细胞膜，将其挤成泡状。

任选地，所述多肽通过与其共价连接(如通过形成酰胺键而相连)的疏水链而嵌接在囊泡膜的外表面，该疏水链可为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)的碳链，如共价连接通过所述多肽与DSPE–PEG-NH

任选地，所述给药对象为哺乳动物，如人。

另一方面，本发明提供了递送系统，该系统包含被递送的药物及上述纳米载体。

任选地，所述药物能够重极化M2型巨噬细胞，如为瑞喹莫德(resiquimod)R848。

可补充地，所述系统中药物与其递送材料形成的纳米颗粒NP可为水包油(O/W)结构，制备可用水包油乳化法液，乳化剂可为聚乙烯醇，所述递送材料与药物接触以包载药物前，递送材料可用二氯甲烷预溶解，药物可用DMSO预溶解，所投药物与所投递送材料的质量比可为1：10-400，如为1：10-100。递送材料与药物接触后，可通过超声混匀，离心得到NP。NP制成后，用囊泡包裹NP，将所述多肽通过与其共价连接的疏水链嵌接在囊泡膜外表，该疏水链可为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE碳链，共价连接可为形成酰胺键而相连，如通过所述多肽与DSPE–PEG-NH

本发明的有益效果为：

本发明的载体成功实现了特异性靶向M2型巨噬细胞，载体的毒性/免疫原性低,稳定性、缓释好，载重极化M2的药后，能大幅提高M2重极化率，提高抗肿瘤效果。

附图说明

图1示范本专利载体NP-R@M-T各模块的结构及其制备；

图2比较了本专利载体与其他对照组对M2型巨噬细胞表型转化的影响(细胞水平)；

图3比较了本专利载体与其他对照组处理后，M1型巨噬细胞因子分泌的水平；

图4比较了本专利载体与其他对照组对M2型巨噬细胞表型转化的影响(mRNA水平)；

图5比较了对小鼠体内各给药形式的抗肿瘤效果，其中5A为M1/M2型巨噬细胞浸润比例的流式统计，5B、5C均是组织中分泌IFN-γ的CD8

各图中涉及的统计学标识含义：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

为节约篇幅，对本领域技术人员公知、熟悉或惯常操作的技术细节，本专利有所省略，如无特别说明，下面所用试剂、生物材料、培养基和溶液均为本领域常用、公众可以得到或市售，或者通过常规制备能够得到的物品。下面为详细示例说明本发明，而不应该为限制本发明的范围，分章节描述如下：

第1章可能涉及的英文缩写表

续表1

第2章NP-R@M-T纳米载体的制备与表征

2.1部分试剂来源

DSPE-PEG

M2pep(YEQDPWGVKWWY) 本实验室合成

ScM2pep(WEDYQWPVYKGW) 本实验室合成

2.2实验方法

2.2.1合成PLGA纳米颗粒(NP)以及该NP包载R848的复合物NP-RPLGA纳米颗粒的合成采用“水包油”的乳化方法，具体合成步骤如下：

(1)用分析天平称取10mg的PLGA粉末溶于含400μL DCM的EP管中，充分震荡至PLGA完全溶解，将PLGA溶液转移至15mL离心管里。

(2)继续加入3.6mL的2.5％的PVA水溶液。若制备包载R848的NP-R，则另加入DMSO溶解好的0.1mg R848(细胞实验用量)或1mg R848(动物实验用量)，比例平衡实验见后。

(3)将15mL离心管固定在盛有冰的200mL烧杯里，放进超声波细胞破碎仪里，以3son/3s off的工作频率超声1分钟后，补加2mL 2.5％的PVA水溶液。

(4)放入磁力搅拌转子，置于磁力搅拌器上，以500rpm/min的频率过夜搅拌至DCM完全挥发。

(5)DCM挥发完后，4000rpm/min,10min,4℃离心去掉大颗粒(沉淀)，取上清至干净的1.5mL EP管里，14000rpm/min，30min，4℃，离心，弃上清，收集纳米颗粒沉淀，并用200μL双蒸水超声重悬,补加体积至1mL后，再次离心，以洗去残留的PVA以及未包裹进PLGA里的R848等杂质。

(6)14000rpm/min，30min，4℃反复离心3次后，移入离心管中。

为平衡载药效果，本研究分别制备了PLGA与R848质量比为400:1，200:1，100:1，50:1，20:1，10:1的NP-R，分离获得各纳米载体前，检测上清中游离药物的量并计算：

包封率(％,w/w)＝(R848的总投入量-上清液中R848含量)/R848的总投入量×100

载药量(％,w/w)＝(R848的总投入量-上清液中R848含量)/(R848的包封量+载体的总投入量)×100

最终，我们选取了PLGA:R848的比值为100:1进行后续的细胞实验，动物实验比值为10：1。

2.2.2提取B16-OVA细胞膜

(1)收集细胞：挑选处于对数生长期的细胞用于细胞膜提取。

(2)细胞匀浆裂解：使细胞充分破碎。

(3)去除细胞核和未破碎的细胞

(4)沉淀细胞膜碎片。

2.2.3纳米载体NP@M以及NP-R@M的构建

(1)向细胞膜沉淀中加入PBS，超声重悬细胞膜沉淀后，用装有400nm聚碳酸酯薄膜的挤出机挤压细胞膜悬液11次，获得细胞膜囊泡。

(2)取制备好的NP和NP-R纳米载体与细胞膜囊泡进行充分混合，随后用装有200nm聚碳酸酯薄膜的挤出机挤压混合液11次，以生成用细胞膜包裹的纳米载体，即NP@M和NP-R@M纳米复合物。

2.2.4 DSPE-M2pep以及DSPE-ScM2pep的合成

(1)用配置好的MES缓冲液(浓度为0.1M，pH6.0)溶解NHS和EDC，调整浓度为2mg/mL。

(2)称取M2pep(2μM)和ScM2pep(2μM)，与1.1mg NHS(保证反应体系里NHS终浓度为2mM)和0.4mg EDC(保证反应体系里EDC终浓度为5mM)，总体系为1mL，共孵育15min。

(3)称取两份DSPE-PEG

2.2.5NP-R@M-T以及NP-R@M-S纳米载体的构建

(1)取制备好的NP-R@M纳米载体2mg，平均分成两份，分别与20μg的DSPE-M2pep和20μg DSPE-ScM2pep在4℃冰箱里置于磁力搅拌器上进行搅拌。

(2)充分搅拌2小时后，即得到NP-R@M-T以及NP-R@M-S纳米复合物。以NP-R@M-T为例，上述各步制备过程总结如图1。

2.2.6 NP-R@M-T的表征

(1)纳米复合物Zeta电位和粒径检测：纳米复合物样品(1mg/mL)，利用马尔文粒度电位仪检测不同的纳米粒子的电位和粒径分布。

(2)纳米复合物TEM成像

2.3实验结果

2.3.1 NP-R的药物包封率和载药量

表2.1纳米载体NP-R在不同PLGA:R848质量比下的包封率和载药量

2.3.2 NP-R以及NP-R@M-T的体外药物释放

本实验采用透析法考察，NP-R在前12h内的释药速度较快，12h后释放速度有所下降，且120h内的累计释放率达21.9±2.57％，相比于NP-R，NP-R@M-T的体外释药速度略有减慢，但二者相比并无显著性差异。

2.3.3 DSPE-M2pep以及DSPE-ScM2pep的合成

合成得到的产物利用红外光谱仪进行鉴定后，确认成功：M2pep和DSPE-PEG

2.3.4 NP-R@M-T的表征

NP-R@M-T的平均粒径在188nm左右，Zeta电位在-9.7mV左右。另一方面，细胞膜成功地覆盖在NP-R载体上，TEM结果进一步表明成功：NP-R@M-T呈圆形或类圆形，且表现出明显的核壳结构，其均匀的脂质双分子层的厚度约为10nm。电位说明配体成功连接上纳米载体。

此外，我们还证明NP-R@M-T能够在含10％的血清的PBS溶液里于37℃下稳定存在7天。最后，我们利用SDS-PAGE分析了NP-R@M的蛋白质成分，结果表明纯的细胞膜蛋白条带以及纳米载体上的蛋白条带一致。

第3章NP-R@M-T体外毒性、摄取和体内靶向性研究

对制备的纳米载体表征完后，我们接着考察了纳米载体在体内外摄取的情况以及载体的细胞毒性，结果如下：

3.3.1纳米载体的细胞毒性评价

采用MTT比色法来测定构建的不同纳米载体对B16-OVA细胞的毒性大小，载体中的R848含量从0.4μg/mL～1.6μg/mL变化时，NP-R@M-T各载体均没有毒性作用。

3.3.2纳米载体体外摄取实验

在上章所制载药载体的基础上，进一步用亲脂性荧光染料DIO标记B16-OVA细胞膜，形成荧光纳米载体DIO-NP-R@M-T和DIO-NP-R@M-S。从共聚焦荧光成像、流式细胞术的结果上看，M2型巨噬细胞在3小时摄取DIO-NP-R@M-T的量要比DIO-NP-R@M-S更多。

3.3.3纳米载体体内摄取实验

我们构建了黑色素瘤B16-OVA小鼠皮下移植瘤模型,在上章所制载药载体的基础上，进一步将荧光染料DID包裹入NP以制备成荧光纳米载体NP-D@M-T和NP-D@M-S。实验结果显示，相比于M1型TAMs，DCs，B16-OVA，NP-D@M-T在6h时更多的被M2型巨噬细胞吞噬，且在24h时，吞噬荧光载体的M2型巨噬细胞数量有明显的增加，吞噬载体的平均细胞数从46％增加到了58％。另一方面，从平均荧光强度的流式统计结果分析，由于载体修饰了M2pep，相比于NP-D@M-S，M2型巨噬细胞不论是在6h还是在24h都摄取了更多的NP-D@M-T。

第4章纳米载体对M2型巨噬细胞表型转化的影响

4.3.1纳米载体对M2型巨噬细胞表型转化的影响(细胞水平)

为了考察不同组纳米载体将M2型巨噬细胞重极化为M1型巨噬细胞的能力，我们选择CD11c作为M1型巨噬细胞标志物进行流式细胞术分析，由图2可见，与对照组NP-R@M-S等相比，NP-R@M-T能够将更多的M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞。

4.3.2纳米载体对M2型巨噬细胞表型转化的影响(蛋白水平)

收集不同处理组的细胞培养上清，ELISA检测IL-12p70的分泌情况如图3。

4.3.3纳米载体对M2型巨噬细胞表型转化的影响(mRNA水平)

实时荧光定量PCR技术检测不同纳米载体刺激24h后细胞中TNFα、iNOS、CD86以及IL12 mRNA的表达情况,qRT-PCR实验结果如图4所示。

第5章纳米载体对治疗黑色素瘤的评价

5.3.1纳米载体对黑色素瘤生长的抑制作用

我们构建了黑色素瘤B16-OVA小鼠皮下移植瘤，分别通过尾静脉注射PBS、NP-R、NP-R@M-S、NP-R@M-T和R848，给药期间，记录小鼠的体重和肿瘤体积变化。治疗组小鼠体重与PBS组小鼠体重并无显著性差异，在接种肿瘤后17天，NP-R@M-T治疗组的肿瘤体积相比于PBS组缩小了82％，而NP-R@M-S治疗组相比于PBS组仅缩小了65％。同时，发现NP-R@M-T治疗组的小鼠存活时间最长，与PBS组相比具有显著的差异。

5.3.2纳米载体的抗肿瘤效果

流式结果表明与PBS对照组相比，NP-R@M-S减少了肿瘤部位37％的M2型巨噬细胞(CD45

与PBS组相比，NP-R@M-T组肿瘤浸润的CD8

此外，我们分离荷瘤小鼠肿瘤引流淋巴结和脾脏进行ex vivo实验分析浸润的T细胞IFN-γ的分泌情况，结果如图5B～5C所示。

5.3.3纳米载体对小鼠器官的毒副作用

为了评价纳米载体对小鼠器官的毒副作用，我们取各组治疗后小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行组织病理学分析。标准H&E染色显示，治疗后小鼠主要器官组织与对照组相比并无异常。因此，我们认为给药剂量在10mg/kg时，纳米载体对小鼠主要脏器无毒副作用。