一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

甲醇，是一种有刺激性气味的无色透明液体。甲醇作为生物制造原料具有以下较明显的优势：甲醇并且不需要压缩和减压安全性更高，更低的运输成本；甲醇还原力高于葡萄糖，使用甲醇作为唯一的或辅助的碳源来生产包括有机酸在内的还原性化学品，则有望获得更高的产品产量。当前生产甲醇的主要方法是化学合成法，即加压催化从化石燃料而来的合成气、直接氧化甲烷、还原大气中二氧化碳和氢气来合成甲醇，由于生产甲醇的原材料丰富，建设项目大批涌现，甲醇产能持续快速增长。因此，近年来甲醇产能压力过剩等问题日益加剧。寻找一种能够将甲醇作为底物生产各种化学品的方法，对于缓解甲醇产量过剩与需求不足之间的矛盾是至关重要的。

食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)，细菌学分类为梭菌属，是一种专性厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌。B.methylotrophicum可同时利用甲醇、CO、CO

然而，目前的研究主要集中在食甲基丁酸杆菌的发酵条件和培养基筛选等方面，并未涉及基因改造。食甲基丁酸杆菌中甲醇代谢主要分为三个模块，第一个模块为甲基转移酶系统，该系统能将甲醇的甲基转移到甲基四氢叶酸中，该模块的三个主要基因为mtaA,mtaB和mtaC2. 随后通过WLP途径的甲基分支，甲基四氢叶酸和二氧化碳被转化乙酰-CoA。随后，涉及丁酸合成途径的几个基因:atoB,paaH,crt和bcd等基因能将乙酰-CoA进一步转化为丁酸。但食甲基丁酸杆菌对甲醇消耗速率以及丁酸生产效率方面仍有进一步提高的空间。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用，通过在食甲基丁酸杆菌中过表达甲醇利用途径和丁酸合成途径，提高了该菌株对于甲醇消耗能力以及丁酸合成能力。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种重组食甲基丁酸杆菌，所述重组食甲基丁酸杆菌通过转入含有甲醇利用途径相关基因或丁酸合成途径相关基因的质粒，获得过表达甲醇利用途径或丁酸合成途径重组菌株；所述甲醇利用途径相关基因和丁酸合成途径相关基因的核苷酸序列分别如SEQ NO.1和SEQ NO.2 所示。

基于上述重组食甲基丁酸杆菌的构建方法包括如下步骤：(1)分别构建重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd；(2)对重组质粒 pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd分别进行甲基化修饰的重组质粒；(3)再将分别甲基化修饰的重组质粒电转化进入食甲基丁酸杆菌，构建重组食甲基丁酸杆菌。

作为改进的是，所述基因matA,mtaB,mtaC2,atoB,paaH,crt,bcd的Gene ID分别为BUME_RS16910,BUME_RS16905,BUME_RS16900,BUME_RS03485,BUME_RS03475, BUME_RS03480,BUME_RS0347。基因matA,mtaB,mtaC2,atoB,paaH,crt,bcd为食甲基丁酸杆菌内源基因，所述食甲基丁酸杆菌购自ATCC菌种保藏中心。

作为改进的是，所述重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2的构建方法为：使用引物MT3-BamHⅠ-F/MT3-NdeⅠ-R进行PCR扩增来源于食甲基丁酸杆菌的甲基转移酶相关基因mtaA/mtaB/mtaC2，分别使用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切扩增片段和载体pXY1，酶连后获得重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2。

作为改进的是，所述重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd的构建方法为：使用引物Tchb-HR-F/Tchb-HR-R进行PCR扩增来源于食甲基丁酸杆菌的丁酸合成相关基因 atoB/paaH/crt/bcd，将载体线性化后，通过同源重组的方法连接到载体pXY1上，获得重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd。

作为改进的是，将步骤1构建的重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd，分别以热激法转化进含有pMCljs质粒的大肠杆菌Top10感受态中，随后培养含有pMCljs和重组质粒的大肠杆菌，并提取总质粒，完成重组质粒 pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和pXY1-atoB/paaH/crt/bcd的甲基化修饰。

作为改进的是，将甲基化修饰的重组质粒通过电转的方式转化进食甲基丁酸杆菌中，电转程序为2200v，400Ω；在厌氧箱中以37℃培养3-4天，菌落PCR验证后获得重组菌株。

上述过表达甲醇利用和丁酸合成途径的食甲基丁酸杆菌重组菌株在甲醇发酵产丁酸上的应用。

上述应用，具体步骤如下：在平板上挑取重组食甲基丁酸杆菌的单菌落，接种至含有红霉素的1ml YTF培养基中，培养12-16h后，将离心管中的菌液全部转接至安剖瓶中，生长至OD

有益效果：

与现有技术，本发明一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用，具有如下优势：

本发明通过构建重组食甲基丁酸杆菌，B.methylotrophicum/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2，该菌株能够过表达甲醇利用途径，与含有空质粒的重组菌株相比，当以甲醇和CO

本发明通过构建食甲基丁酸杆菌重组菌株， B.methylotrophicum/pXY1-atoB/paaH/crt/bcd，该菌株能够过表达丁酸合成途径，与含有空质粒的重组菌株相比，当以甲醇和CO

附图说明

图1为重组菌株BM/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2与BM/pXY1生长情况对比结果；

图2为重组菌株BM/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2与BM/pXY1甲醇消耗对比结果；

图3为重组菌株BM/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2与BM/pXY1丁酸生成对比结果；

图4为重组菌株BM/pXY1-atoB/paaH/crt/bcd与BM/pXY1甲醇消耗对比结果；

图5为重组菌株BM/pXY1-atoB/paaH/crt/bcd与BM/pXY1丁酸生成对比结果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中如无特别说明，所用酶及质粒均为购买所得。

实施例1：构建重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2

实施例中所用到的基因matA,mtaB,mtaC2,atoB,paaH,crt,bcd的Gene ID分别为来自BUME_RS16910,BUME_RS16905,BUME_RS16900,BUME_RS03485,BUME_RS03475, BUME_RS03480,BUME_RS0347。基因matA,mtaB,mtaC2,atoB,paaH,crt,bcd为食甲基丁酸杆菌内源基因，所述食甲基丁酸杆菌购自ATCC菌种保藏中心。

甲醇过表达基因mtaB/mtaC2/mtaA碱基序列，即(甲醇利用途径相关基因SEQ NO.1所示)：

atggcaaagaaatttgataaactggcaattaataatctggacgattttatttatggctcttgtccgaaccctgtcaccac caggagcggcatggtcatcggcggcggcaccatctatccggaaatcaacttcacactgccgggcatggatgtcaatgatc agaccattgacaaggccttgggcatttattccaatatcatcgacggtgtgctcaagagagcggcagagctctacgcgccc ggcgtgctggtagaatttgaaaccgtgccggactttaccgagcatccaaaatatgggattgacgccaaccgcattttatt aaatggcatcaaggaagccgcagacaagtacggcctcaaggccgccctgcggaccacccccaacgacctgcgcgaaatga gccgtcctccggttatgcgcggcggcaagtactgggataccatgctggagctgtacgaacagtgcgccaaggatggttca gactttttatccatcgaatcgaccgggggcaaggaaatcaatgacgaagccctcgtaaaggccgatatccgcaaagccat cttcgccatgggcgtgctgggctgccgcgacatggaatacctctggggcaatctggttaaattatccgatgctaatggct gcttcgccgctggcgactctgcctgtggctttgccaacaccgccatggttctggccgaaaaaggctttatcccccatgtg ttcgcagcggttatgcgtgttgtggcagtgccgagagccctggtggcctttgaacagggcgcggttggcccgagcaagga ctgcgcctatgaaggcccatacctcaaggccattaccggcagtcccatcgccatggaaggtaagagcgcggctggcgccc atttaagcccagttggcaacatcgcggcagccgtggccgatacctggagtaatgaatccatccagcaggtcaagctctta tccgagatggcccctgtggtgggcatggaacagctggtatatgactgccgtctcatgaacgtggccaaggaaaaaggcca gggccttatgatgcgcgacctgctcgttgaatctgacgcgccgctggatgtccaggcatgggttttaagacccgatgttgtgcttaagatcgccggcgagctggtgaaagagcaggataacttcctgagaaccaaactggccgccaaattaaccattaac gagctgcgcgacgccatcaaggccgaaaaggttaaggctgaccgccgcgacatgaaatggctcgacaagatggaaaaagc agtggacaagattccagacgatccggaacagttctacgcagaaatcaagcccgagctggacatggacaagtggcatccta aaggctatggcttaaaggcctgatcttaatattcttaaaacagaaattcactgttaaaaattataaaaatttggacaatt ccctccggtgcggctcagtacacactgcgcgccggaagagcaggtaaacagctttaatcaggaataaaaaaatcggagga tataaaaatggcaattttagaagatattcaaaactgtgtgttggacggcgaactggatgagatcaaggacttggtgcaga aggcagtggatgaggggatcgaccccgccgccatcatcaacgacggcctcatcggcggcatgaacattgtggccccgctg tttaagagcggtgaaatgtttgtcccggaagttatggaatccgcggataccatgaacgaaggcatgcaggtggttaagcc cctgatcaccgacgcggatatgcccaccaagggcaaggtcatcatcggcactgtcaacggtgacctgcacgatatcggta aaaacctggtggtcttaatgatggaaagccgcggctacacagttattgacatgggcgtagatgtgaaggaagaacagttt gtggaagccatcaaagaacacaagccagacattgtgggcatgtcctcactgctcaccaccaccatgatgaagattgacga taccatcaagatgattaacgagtccggcctgcgtgaccaggttaagatcatcatcggcggcgcacccatctctcaggaat tcgccgatgatatcggggcggacggctattcagaggacgcctccaccgcggttgagctctgcgaccgcatgatggccatg tagcagacagcgaataaaattttgacgaacaggaggcatttcagatgctgacaattgttggtgaactcattaacaccagc cgccctccggtcaaggaggcggtacagaataaagacgaagcgttcatccgggagcttgccaaaaaacaggcagacgccgg cgcgacctatatcgacgtaaactgcggcaatatggtcaagaatgaactggaaataatggaatggcttgtgaacattgttc aggacgaggtcgacacccccctgtgcattgacagccccaacgccaaagcactggacgtgggtctggccctgtgcaggaac ggccgtcccatgatcaattccatctccgacgaggacgggcgttatgaatccgttcttcccttaattaaaaaatataacgc caaaatcgttgtattgtgcatggactccactggtatgcccgaaacctcagccgaccgcatgaaggtggtcaataaccttt atgccaagctgaaggccgagggcatcgccgatgacgacatgtactttgacccgctggtcaagcccatcagcagcgtgacc agtgccggagcagaggtgctcgacaccatccgccagatcaagcaggattaccccgatgtacacttcatgtgcggtttgag caacatttcctatggcctgccgaaccgcagcatcctcaatcggctgtttgttgtccagacaatgaccctggggatggacg gctacgtccttgaccccaccaatggcaaaatgatggcggacatcatcaccgccaccgcgctcctgggcagagacagctat tgcagtaaatacattaaagcccatagaaagggcaaacttgacgcatcgtctgatgcgtaa

重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2的构建：以食甲基丁酸杆菌的全基因组为模板，通过常规 PCR扩增甲基转移酶操纵子mtaA/mtaB/mtaC2，

所用的上游引物MT3-BamHⅠ-F带有BamHI酶切位点，序列如下：

CGGGATCCATGGCAAAGAAATTTGATAAACTGG；

所用的下游引物MT3-NdeⅠ-R带有NdeⅠ酶切位点，序列如下:

GGAATTCCATATGTTACGCATCAGACGATGCG,

反应条件为：95℃3min，95℃15s，57℃15s，72℃3min，共30个循环；72℃5min。得到的基因片段经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与载体pXY1用Takara公司的BamHI和NdeⅠ酶切，酶切反应体系为：10×buffer 5μL，BamHI 5μL，NdeⅠ5μL，基因片段或pXY1载体30μL，ddH

实施例2：构建重组菌株BM/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2

重组菌株BM/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2的构建：将质粒pMCljs热激转化进入大肠杆菌 Trans-T1中,得到重组菌株Trans-T1/pMCljs,将该重组菌株制备成感受态细胞，具体的步骤如下所示：

从LB平板上挑取新活化的Trans-T1/pMCljs单菌落，接种于5ml含有盐酸壮双霉素的 LB培养基中，37℃下培养至对数生长期，将菌株接种于50ml液体培养基中，37℃培养至OD

将实施例1得到的重组质粒转化进该感受态，将得到的重组菌株Trans-T1/pMCljs/ pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2接种于5ml含有氨苄抗性和盐酸壮双霉素的LB培养基中，37℃培养 12小时后提取质粒，即得到甲基化质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2。随后制作食甲基丁酸杆菌感受态细胞，在厌氧箱里，从YTF平板挑点接入1ml YTF培养基；12-16h后，将离心管中的菌液全部转接至安剖瓶中，生长至OD

食甲基丁酸杆菌电转步骤如下所示：吸取100μl感受态细胞至电转杯中，加入甲基化后的混合质粒，拿出电转；电转程序为2200v，400Ω；电转后，在电击杯中加入1ml YTF，混合后吸入2ml离心管，厌氧箱中复苏6h；5000rpm离心4min，吸出900μl，剩余菌液混匀涂板；正放至厌氧箱，1小时后翻板，生长3-4天，挑取转化子，即得到重组菌株 BM/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2。

实施例3：重组菌株BM/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2发酵实验

在平板上挑取重组菌株BM/pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2单菌落，接种至含有红霉素的1ml YTF 培养基(蛋白胨16g/L，酵母粉12g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖5g/L)中，培养12-16h后，将离心管中的菌液全部转接至安剖瓶中，生长至OD

其中，PB培养基的配方为：磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二钾6g/L，氯化铵1g/L，六水合氯化镁0.1g/L，二水合氯化钙0.1g/L，酵母粉3g/L，微量元素溶液2％(V/V)，维生素溶液2％(V/V)；

微量元素溶液：次氮基三乙酸1.5g，七水合硫酸镁3g，氯化钠1g，一水合硫酸锰0.5g，七水合硫酸亚铁0.1g，七水合硫酸钴0.18g，二水合氯化钙0.1g，七水合硫酸锌0.18 g，五水合硫酸铜0.01g，十二水和硫酸铝钾0.02g，硼酸0.01g，二水合钼酸钠0.01g，六水合氯化镍0.025g，五水合亚硒酸钠0.3mg，超纯水定容至1L。

维生素溶液：生物素2mg，叶酸2mg，吡哆醇盐酸10mg，二水合硫铵盐酸盐5mg，核黄素5mg，烟酸5mg，泛酸钙5mg，钴胺素0.1mg，对氨基苯甲酸5mg，硫辛酸5mg，超纯水定容至1L。

高效液相色谱法检测方法为：安捷伦高效液相色谱，色谱柱为Biorad HPX-87H，流动相为0.8g/L的H

实施例4：构建重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd

丁酸合成途径基因(atoB/paaH/crt/bcd)碱基序列(即丁酸合成途径相关基因的核苷酸序，如SEQ NO.2 所示)：

gtggcaaaagaagtagtattagctggtgctgtacgtacagcgattggtagttttggcggttctttagcaaacgttccggt agtcgatcttggaacaatcgttattaaagaagctttaaaccgtgctggcgttaaaccggaagacgttgatgaagtgttaa tggggtgtgtattacaggcggctcagggacagagtgttgcccgtcagtctgctgtaaatgctggtattcctgttgaggtt cctgctttaacccttaacaatttatgtggttctggtctcaaatgtatcaatcttgcagctgctatgatccaggctggaga agcagatattattgttgctggtggtatggaaagcatgtccggcgctgcttacgctgttcctaagggacgctatggctaca gaatgggcgatggccagttcatcgacaccatgatcaaagacggtttaaccgatgccttcaatcactatcacatgggtatc accgctgaaaatgtagcagaacagtatgatgtaacccgcgaagatcaggatgatttcgccgctaagagccagcagaaatg tgaagccgctcaggcagctggccgttttgatgatgaaatcgtaccggttccggttaaagttaaaaaagaaattgttgaat tcaaagttgatgaattcccaagaaaaggcgtaaccgctgaaggcatcagcaaaatgcgtccggctttcaaaaaagacggt accgtaaccgctgcaaatgcttctggtatcaatgacggcgctgctgccatcgttgtgatgtctgctgaaaaagcaaaaga attaggtgttaagccaatggctaaatttgttgtcggcgcttccgctggtgttgatccatccatcatgggtgttggaccaa tcttctcaagccgtaaagctttagaaaaagctggtttaaccattgacgatatggatttagttgaagcaaacgaagctttc gcagcacagtcctgtgctgtaggcaaaactttaaatattcctgaagataaattaaatgtaaacggcggcgcgatcgctct gggtcacccggttggtgcttctggctgccgtatcatggtaaccttactgcacgaaatgcagaaacgcggtgctaaaaaaggtcttgcaaccttatgcgtaggcggcggtatgggtgtatctaccatcgtagaaatggactaatttttctaaggagagaag gtaattacaatgggttttgttaaatatgaaccacagggtgcagtggctgttatcaccatcgaccgtgaaaaggctttaaa tgctttaaatagtgaagtgcttgaagatctggacaaggttattgacggtgttgatttagagaccattcgctgcctgatta ttacaggtgccggtcagaaatcttttgttgccggtgcggacatcggtgaaatgagcagcctgactcaggctgaaggcgaa gcttttggtaaaaaaggaaacgctgttttcagaaagatcgagactttaccaattccggttatcgctgcggttaacggctt tgcacttggcggcggctgcgaattatccatgtcctgcgacattcgtctggcttctgaaaatgcaacctttggccagcctg aagttggccttggcatcactgctggtttcggtggcactcagcgtcttgcacgtctgatcccgaccggtaaagcaaaggaa atgctctatgcctgcaccaatatcaaagcggccgacgctttgagctggggtctggttaatgctgtctacccggcagacga attaatgcctgctgcattgaaattggctggtaaaattgctaacaacgctccaattgctgtccgtaacaccaaaaaagcca tcaatgacggccttgaaatgggtatggacgacgcaattgcctttgaagcaaaacagtttggcggatgttttgaatccgct gaccaaaaagaaggcatggctgccttcctggaaaaacgtaaacacgaacctttccaaaacaaataaatatgattttcaac tcaagggtatttttgtataaaaatacccttgagtttgggcttttcgcctgtatatacaaatctgtatatacaagaataca aaaaagtttttaatttatctaggaggacttaaaatgaaagttggcgttattggtgccggtacaatgggatcaggtattgc tcaggttttcgcttctaccgatggttatgaagttgtactttgcgatatcaaacaggaatttgccgatggtgggaaagcta aaatcgaaaaagcattagcaaaacaggttgctaagggccgtatcgatcaggctaaaatggatgcaaccttagcaaaaatc acaacaggtttaagagatgctgttgcggattgcgatttggttgttgaagctgttttagaacagatggaaatgaaacatga attattccaggcattacagggaatctgtaaaccagaatgtattttcgcttccaatacttcttctttatctttaaccgaaa tgtctcagggcgttgaccgtccagtgattggtatgcatttctttaatccggttccggctatgaaactggttgaagttatt gctggttaccatacttctcaggaaaccgttgataccatcaaaaagattgcaacagatatcggcaaaactccggtacaggt taacgaagctgcaggttttgttgtaaacagaatcttagttccaatgatcaacgaaggtatcgaagtttatgctgctggta ctgcttccgctgcggatatcgacactgctatgaaattaggcgcaaaccacccaatgggaccactggctttaggcgactta attggtctggacgttgttctggcaattatggaagtattacaggcagaaactggctctgacaaatacgctccgtctccact gcttcgcaaaatggtacgcgcaggcgttttaggtatgaaaacaggaaaaggattctttgattacacaaaataagcttgtg tgacaaatatatttaggaggaacagtatggacttcaatctgagtaaggaacatcaaatgttgcgcacactctacagagag tttgcagaaaatgaagcaaaaccaatcgcgcaggaagttgacgaagaagaacgcttcccgcaggaaaccgttgataaaat ggtcaaaaatggctttatgggcattccatttgccaaagaagtcggtggacagggctgtgatacattagcttatattttag ctgttgaagagttatcccgcgtttgcggtactaccggcgttatcctttccgcacacacttcactgggaacagacccaatc cgtaaattcggtacaccggaacaaaaagaaaaatacttaccgcgtttagcaagcggtgaattattaggcgctttcggctt aactgaaccaggcgctggtactgatgcttccggacagcagacaaaggctgttttagaaggcgaccactatgtattaaacg gtacgaaaatcttcattaccaacggtggtaaagcagatgtttatatcatcttcgcaatgacagataagagcaaaggcacc aaggggatctctgcattcatcgtagaaaaagattatcctggcttctcaatcggtacaaaagaaaagaaaatgggtatccg tggttcttccacaaccgaattaatttttgaagactgcatcgttccaaaagaaaatcttcttggtaaagaaggtaaaggct ttggaatcgcgatgcagactctggacggcggccgtatcggtatcgctgctcaggctttaggtctggctcagggcgctttc gacgaaaccgttgcttacgttaaagaaagaaaacagtttggtcgctcaattgctaaattccagaacacacagtttaaatt agccgatatgtacgcacgtatcgaagctgcccgtaacctggtttacaaagcagctattgctaaggatactcagaaagtat tctctgtagaagcagcaactgctaaacttttcgcagctgaaactgctatggctgttaccacagaatgtgtacagttactt ggtggttatggctacaccagagactatccagttgaacgtatgatgcgtgatgctaagattaccgaaatttatgaaggaac aagcgaggtacaacgtatggttatatctggcaacgttctgaaatag

重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd的构建：以食甲基丁酸杆菌的全基因组为模板，通过常规 PCR扩增丁酸合成途径操纵子atoB/paaH/crt/bcd，

所用的上游引物Tchb-HR-F扩增产物物上游含有同源臂，序列如下： GTTAGTTAGAGGATCGTGGCAAAAGAAGTAGTATTAGCT；

所用的下游引物Tchb-HR-R使扩增产物下游含有同源臂，序列如下: TGAGAGTGCACCATACTATTTCAGAACGTTGCCAGA,

反应条件为：95℃3min，95℃15s，57℃15s，72℃4min，共30个循环；72℃5min。得到的基因片段经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将载体pXY1用Takara公司的BamHI和NdeⅠ酶切，酶切反应体系为：10×buffer 5μL，BamHI 5μL，NdeⅠ5μL，pXY1载体30 μL，ddH

综上所述，这表明针对特定的代谢途径改造，例如甲醇利用途径和丁酸合成途径，能够提高甲醇的消耗和丁酸的合成。这表明在食甲基丁酸杆菌种进行代谢工程是可行的。为将来利用甲醇和CO

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3020

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcaaaga aatttgataa actggcaatt aataatctgg acgattttat ttatggctct 60

tgtccgaacc ctgtcaccac caggagcggc atggtcatcg gcggcggcac catctatccg 120

gaaatcaact tcacactgcc gggcatggat gtcaatgatc agaccattga caaggccttg 180

ggcatttatt ccaatatcat cgacggtgtg ctcaagagag cggcagagct ctacgcgccc 240

ggcgtgctgg tagaatttga aaccgtgccg gactttaccg agcatccaaa atatgggatt 300

gacgccaacc gcattttatt aaatggcatc aaggaagccg cagacaagta cggcctcaag 360

gccgccctgc ggaccacccc caacgacctg cgcgaaatga gccgtcctcc ggttatgcgc 420

ggcggcaagt actgggatac catgctggag ctgtacgaac agtgcgccaa ggatggttca 480

gactttttat ccatcgaatc gaccgggggc aaggaaatca atgacgaagc cctcgtaaag 540

gccgatatcc gcaaagccat cttcgccatg ggcgtgctgg gctgccgcga catggaatac 600

ctctggggca atctggttaa attatccgat gctaatggct gcttcgccgc tggcgactct 660

gcctgtggct ttgccaacac cgccatggtt ctggccgaaa aaggctttat cccccatgtg 720

ttcgcagcgg ttatgcgtgt tgtggcagtg ccgagagccc tggtggcctt tgaacagggc 780

gcggttggcc cgagcaagga ctgcgcctat gaaggcccat acctcaaggc cattaccggc 840

agtcccatcg ccatggaagg taagagcgcg gctggcgccc atttaagccc agttggcaac 900

atcgcggcag ccgtggccga tacctggagt aatgaatcca tccagcaggt caagctctta 960

tccgagatgg cccctgtggt gggcatggaa cagctggtat atgactgccg tctcatgaac 1020

gtggccaagg aaaaaggcca gggccttatg atgcgcgacc tgctcgttga atctgacgcg 1080

ccgctggatg tccaggcatg ggttttaaga cccgatgttg tgcttaagat cgccggcgag 1140

ctggtgaaag agcaggataa cttcctgaga accaaactgg ccgccaaatt aaccattaac 1200

gagctgcgcg acgccatcaa ggccgaaaag gttaaggctg accgccgcga catgaaatgg 1260

ctcgacaaga tggaaaaagc agtggacaag attccagacg atccggaaca gttctacgca 1320

gaaatcaagc ccgagctgga catggacaag tggcatccta aaggctatgg cttaaaggcc 1380

tgatcttaat attcttaaaa cagaaattca ctgttaaaaa ttataaaaat ttggacaatt 1440

ccctccggtg cggctcagta cacactgcgc gccggaagag caggtaaaca gctttaatca 1500

ggaataaaaa aatcggagga tataaaaatg gcaattttag aagatattca aaactgtgtg 1560

ttggacggcg aactggatga gatcaaggac ttggtgcaga aggcagtgga tgaggggatc 1620

gaccccgccg ccatcatcaa cgacggcctc atcggcggca tgaacattgt ggccccgctg 1680

tttaagagcg gtgaaatgtt tgtcccggaa gttatggaat ccgcggatac catgaacgaa 1740

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accatgatga agattgacga taccatcaag atgattaacg agtccggcct gcgtgaccag 2040

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