新型CDK4/6抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一类CDK4/6抑制剂的化合物，该化合物对治疗细胞恶性增殖的疾病和病症有效果。

背景技术

细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)在调节细胞周期的过程发挥着重要的作用，CDK4/6结构和功能相似的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶，在细胞周期的G1期的前期，细胞周期蛋白(cyclin)D结合并且激活CDK4/6，形成的cyclin D-CDK4/6复合物促进成视网膜细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)磷酸化，从而释放出转录因子E2F，推动细胞周期由G1期向S期的进程。

CDK4/6是细胞周期由G1期向S期的关键启动蛋白，对于CDK4/6的抑制能够将细胞周期阻滞在G1期，从而减少细胞的增殖，在癌症的治疗发挥着重要的作用。目前已经有三个选择性CDK4/6抑制剂，Palbociclib,Ribociclib和Abemaciclib已经被批准上市，用于乳腺癌的治疗。

三种上市的CDK4/6抑制剂在乳腺癌的治疗中发挥着重要的作用，但是已经出现了对于它们产生耐药性的事件

我们发明了新型结构的CDK4/6抑制剂，该系列化合物对多发性骨髓瘤等多种疾病中具有治疗的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一类具有CDK4/6抑制活性的化合物及其制备方法。

本发明的目的可以通过以下措施达到：式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，

X为氢、卤素、羟基、巯基、氨基、-OR’、-SR’、-NHR’或-NR’R”，其中R’和R”为C

R选自氢、羟基、卤素、C

在一些优选的实施中，X为氢或卤素；更优选的X为氢、氯、氟；最优选的X为氟。

在一些优选的实施例中，R分别独立的为氢、C

在本发明的化合物或其药学上可接受的盐中，特别优选自下列化合物：

本发明还提供式(I)化合物的制备方法：

其中，R和X的定义如前所述。

在一些实施例中，式(II)化合物与双联频哪醇硼酸酯在钯催化剂的作用下反应得到式(III)化合物，然后氯代嘧啶发生Suzuki偶联反应，得到式(IV)化合物。

在一些实施例中，式(V)化合物与2-氨基-5-醛基吡啶在三乙酰基硼氢化钠的作用下发生还原胺化反应得到式(VI)化合物；式(VI)化合物与式(IV)化合物在钯催化剂的作用偶联得到式(I)化合物。

本发明还提供了一种药用组合物，所述组合物包含治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐或其异构体，以及药学上可接受的载体。

本发明还提供包含治疗有效量的根据任何前述化合物的组合物或其可药用盐或其溶剂合物和可药用载体或稀释剂的药物组合物。

治疗有效量，可以是在某种程度上缓解对象中的疾病或病症的一种或多种症状、使与疾病或病症相关或是其病因的一种或多种生理或生物化学参数部分或完全恢复正常、和/或降低疾病或病症的发作可能性的量。

药学上可接受的载体指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的赋形剂或稀释剂。

本发明还提供了一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐或本发明所述的组合物在制备药物中的用途。

本发明还提供了一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐或本发明所述的组合物在制备CDK4/6抑制剂中的应用。

本发明还提供了一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐或本发明所述的组合物在制备治疗癌症或肿瘤相关疾病药物中的应用。

本发明所述的癌症或肿瘤相关疾病包括但不限于多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌。

本发明中的术语除特别说明外，一般具有如下的含义。

术语“烷基”表示具有所述数目之碳原子的直链或支链饱和烃基。术语“C

术语“烷氧基”表示O-烷基。术语“C

术语“卤素”为氟、氯、溴或碘。优选为氟、氯、溴。

术语“卤代烷基”表示具有一个以上(包含一个)卤素取代基的烷基。

术语“环烷基”表示全部为碳原子的饱和的单环或多环的环结构。术语“C

术语“环烯基”是指具有至少一个环碳碳双键的单环或多环烷基取代基。术语“C

术语“C

术语“C

术语“C

术语“杂芳基”表示单环或稠合环基团，含有一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。术语“C

术语“杂环基”即杂环烷基，表示含1个或多个N、O或S的杂原子的单环或稠合的环。术语“C

“药学上可接受的盐”指的是本发明化合物的酸式盐或碱式盐，所述盐具有所期望的药学活性并且在生物学上和在其它方面的均没有不合要求之处。酸式盐包括无机酸盐和有机酸盐。无机酸包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸、甲磺酸，有机酸包括但不限于乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、马来酸、对甲苯磺酸、苹果酸、丙二酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、樟脑酸、二葡糖酸、天冬氨酸、酒石酸，本发明化合物的药学上可接受的盐优选采用无机酸盐。

本发明所述的式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，具有CDK4/6抑制活性，对CDK4/6调控有关的疾病具有治疗效果。

附图说明

图1为I-a和I-b与CDK6蛋白的相互作用示意图。

具体实施方式

下面通过非限定性实施例来对本发明进行说明，应当理解为，此处描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

中间体的制备

实施例1、6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)喹喔啉的制备

第一步：6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼戊烷-2-基)喹喔啉的合成

6-溴喹喔啉(0.42g,2.0mmol)溶于DMF(10mL),然后加入频哪醇硼酸酯(0.53g,2.1mmol),Pd(dppf)Cl

第二步：6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)喹喔啉的合成

称取化合物2，4-二氯-5-氟嘧啶(0.23g,1.4mmol)加入250mL三颈烧瓶,之后加入Pd(PPh

实施例2、5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-胺的制备

2-氨基-5-醛基吡啶(0.32g,2.6mmol)和N-乙基哌嗪(0.45g,3.9mmol)溶于1,2-二氯乙烷(20mL)，室温搅拌2h，随后加入三乙酰基硼氢化钠(0.87g,4.1mmol)，室温搅拌8h.加入1M NaOH(30mL)淬灭，DCM(20Ml*3)萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析(DCM/MeOH＝10:1)得到化合物5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-胺，白色固体(0.52g,91％)。

实施例3、叔丁基4-((6-胺基吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制备

化合物叔丁基4-((6-胺基吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制备参考化合物5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-胺的制备而得。

I-a和I-b的制备

实施例4：N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(喹喔啉-6-基)嘧啶-2-胺

化合物6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)喹喔啉(130mg,0.5mmol)和5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-胺(132mg,0.6mmol)溶于二氧六环(5mL)，然后加入Pd

实施例5：5-氟-N-(5-(哌嗪-1-亚甲基)吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)嘧啶-2-胺盐酸盐

第一步：叔丁基4-((6-((5-氟-4-(喹喔啉-6-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制备

化合物叔丁基4-((6-((5-氟-4-(喹喔啉-6-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯的制备参照实施例1N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(喹喔啉-6-基)嘧啶-2-胺的制备。

第二步：5-氟-N-(5-(哌嗪-1-亚甲基)吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)嘧啶-2-胺盐酸盐的制备

化合物叔丁基4-((6-((5-氟-4-(喹喔啉-6-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯溶于二氯甲烷中，0℃条件下通入HCl气体反应2h。反应结束后，浓缩得到化合物5-氟-N-(5-(哌嗪-1-亚甲基)吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)嘧啶-2-胺盐酸盐(I-b)。

生物学评价实验

实施例6：酶学活性分析检测方法

本实验采用PerkinElmer公司的Lance Ultra方法进行检测。在检测板中，将蛋白激酶、Ulight标记的多肽底物、ATP及化合物混合，并孵育反应。之后，加入EDTA终止反应，并加入铕(Eu)螯合物标记的抗体进行检测。本实验采用PerkinElmer公司的Envision仪器进行分析，模式为TR-FRET。在320/340nm波长激发后，可以发射665nm和615nm波长的荧光信号。Eu可以至能量转移至相邻的荧光物质ULight受体上，再对该发射光进行检测。

本发明中的化合物对CDK4/cyclin D1,CDK6/cyclin D1,CDK1/cyclin B,CDK2/cyclin A,CDK7/cyclin HMNAT1,CDK9/cyclin T1激酶抑制活性的进行测定。方法简述如下：

CDK1/cyclin B抑制活性测试：

1、在384孔实验板(Perkin Elmer，Cat.No.6007299)上加入不同浓度的化合物，复孔，之后加入CDK1/cyclin B(Invitrogen,Cat.No.PR4768C)激酶和底物ULight-MBPPeptide(PerkinElmer,Cat.No.TRF0109-M)，混合均匀；

2、室温孵育15分钟后，加入ATP溶液启动反应；

3、室温反应60分钟后，加入EDTA终止反应，并且加入抗体Eu-anti-phos MBP(PerkinElmer,Cat.No.TRF0201-M)产生检测信号；

4、室温孵育60分钟后，在Envision(Perkin Elmer，Cat.No.2104)进行读数；

5、IC

CDK2/cyclin A抑制活性测试：

1、在384孔实验板(Perkin Elmer，Cat.No.6007299)上加入不同浓度的化合物，复孔，之后加入CDK2/cyclin A(Invitrogen,Cat.No.PV3267)激酶和底物ULight-MBPPeptide(PerkinElmer,Cat.No.TRF0109-M)，混合均匀；

2、室温孵育15分钟后，加入ATP溶液启动反应；

3、室温反应60分钟后，加入EDTA终止反应，并且加入抗体Eu-anti-phos MBP(PerkinElmer,Cat.No.TRF0201-M)产生检测信号；

4、室温孵育60分钟后，在Envision(Perkin Elmer，Cat.No.2104)进行读数；

5、IC

CDK4/cyclin D1抑制活性测试：

1、在384孔实验板(Perkin Elmer，Cat.No.6007299)上加入不同浓度的化合物，复孔，之后加入CDK4/cyclin D1(Invitrogen,Cat.No.PV4436)激酶和底物ULight-4E-BP1Peptide(PerkinElmer,Cat.No.TRF0128-M)，混合均匀；

2、室温孵育15分钟后，加入ATP溶液启动反应；

3、室温反应90分钟后，加入EDTA终止反应，并且加入抗体Eu-phos-4E-BP1(PerkinElmer,Cat.No.TRF0216-M)产生检测信号；

4、室温孵育60分钟后，在Envision仪器(Perkin Elmer，Cat.No.2104)进行读数；

5、IC

CDK6/cyclin D1抑制活性测试：

1、在384孔实验板(Perkin Elmer，Cat.No.6007299)上加入不同浓度的化合物，复孔，之后加入CDK6/cyclin D1(Invitrogen,Cat.No.PV4437)激酶和底物ULight-4E-BP1Peptide(PerkinElmer,Cat.No.TRF0128-M)，混合均匀；

2、室温孵育15分钟后，加入ATP溶液启动反应；

3、室温反应180分钟后，加入EDTA终止反应，并且加入抗体Eu-phos-4E-BP1(PerkinElmer,Cat.No.TRF0216-M)产生检测信号；

4、室温孵育60分钟后，在Envision(Perkin Elmer，Cat.No.2104)进行读数；

5、IC

CDK7/cyclin HMNAT1抑制活性测试：

1、在384孔实验板(Perkin Elmer，Cat.No.6007299)上加入不同浓度的化合物，复孔，之后加入CDK7/cyclin HMNAT1(Invitrogen,Cat.No.PR6749B)激酶和底物ULight-MBPPeptide(PerkinElmer,Cat.No.TRF0109-M)，混合均匀；

2、室温孵育15分钟后，加入ATP溶液启动反应；

3、室温反应180分钟后，加入EDTA终止反应，并且加入抗体Eu-anti-phos MBP(PerkinElmer,Cat.No.TRF0201-M)产生检测信号；

4、室温孵育60分钟后，在Envision(Perkin Elmer，Cat.No.2104)进行读数；

5、IC

CDK9/cyclin T1抑制活性测试：

1、在384孔实验板(Perkin Elmer，Cat.No.6007299)上加入不同浓度的化合物，复孔，之后加入CDK9/cyclin T1(Invitrogen,Cat.No.PR7541B)激酶和底物ULight-4E-BP1Peptide(PerkinElmer,Cat.No.TRF0128-M)，混合均匀；

2、室温孵育15分钟后，加入ATP溶液启动反应；

3、室温反应120分钟后，加入EDTA终止反应，并且加入抗体Eu-phos-4E-BP1(PerkinElmer,Cat.No.TRF0216-M)产生检测信号；

4、室温孵育60分钟后，在Envision(Perkin Elmer，Cat.No.2104)进行读数；

5、IC

本发明中的化合物对CDK4/cyclin D1,CDK6/cyclin D1,CDK1/cyclin B,CDK2/cyclin A,CDK7/cyclin HMNAT1,CDK9/cyclin T1激酶抑制活性的试验进行测定，测得的IC

【表1】

由表1数据可见，化合物I-a和化合物I-b均对CDK4/6具有很好的抑制活性。

实施例7：本发明的化合物与CDK6蛋白的相互作用

实施例所示化合物I-a和I-b通过Discovery Studio 2019的Flexible docking模块与CDK6(PDB code 5L2S,2.27

实施例8：本发明的化合物对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖活性测定

化合物对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖活性通过以下的方法进行测试。

该方法用来测试本发明中的化合物对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的抑制作用。

实验步骤：

本实验照CCK-8法进行测定化合物对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226细胞增殖的抑制作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC

1、在96孔细胞培养板中接种100μL的RPMI8226细胞，密度为1×10

2、向培养板加入梯度稀释的不同浓度的待测化合物溶液100μL，将培养板在37℃，5％CO

3、每孔加入10μL CCK-8溶液，振荡均匀，在37℃，5％CO

4、通过吸光度值与对照组的比值计算抑制率。

5、根据各梯度稀释浓度组的抑制率计算IC

本发明中的化合物对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖活性的试验进行测定，测得的IC

【表2】

结论：本发明中的化合物对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖活性具有抑制作用。