一种用于冷冻电镜制样的低共熔溶剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及冷冻电镜制样领域，具体为一种用于冷冻电镜制样的低共熔溶剂及其制备方法。

背景技术

冷冻电镜技术是结构生物学领域重要的技术，它通常用于大分子量的、难以结晶的生物分子结构的解析。随着冷冻电镜技术的发展，已经可以解析原子级分辨率，逐渐成为一种与X-射线晶体学技术互补的生物大分子结构解析技术。尤其适于解析大分子之间或与小分子互作机理。

糖苷转移酶是一类在生物体内将UDP-葡萄糖等具有催化活化的糖连接到不同受体分子的酶，糖基化的产物具有很多生物学功能。天然药用活性物中的非极性化合物黄酮、联苯等类型化合物可以通过糖基化改变其极性实现极性翻转，进而促进其在生物体内的吸收与运输，提高其生物活性。

在研究糖苷转移酶的催化机理过程中，将使用冷冻电镜对其结构进行研究，但冷冻电镜的制样通常在水为主体的缓冲溶液环境中进行，易出现非极性底物溶解性不好而析出的问题，进而阻碍酶促反应的进行。

发明内容

有鉴于此，在冷冻电镜制备样品的过程中，通过使用上述低共熔溶剂解决了冷冻电镜制样时由于底物水溶性不好而造成结果背景不清晰的问题，并且提高了糖苷转移酶的催化活性、热稳定性、保存时间等酶活性质。本发明的DES-缓冲溶剂制作简单、反应条件温和、无毒、可降解，符合绿色化学的发展，具有广泛的工业生产前景。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于冷冻电镜制样的低共熔溶剂，该低共熔溶剂包括氢键供体试剂和氢键受体试剂。

氢键供体试剂选自多元醇、糖、有机酸及有机胺类化合物中的一种，或是它们的混合物。

氢键受体试剂选自氢键受体试剂选自氯化胆碱、甜菜碱、L-脯氨酸类中的至少一种。

氢键供体试剂和氢键受体试剂的摩尔比为1～2:2～4。

作为优选，所述氢键供体试剂选自丙二醇、1,2-丙二醇、葡萄糖、马来酸以及尿素中的一种，或是它们的混合物。

作为优选，所述氢键受体试剂为氯化胆碱、甜菜碱、L-脯氨酸中的至少一种。

作为优选，氢键供体试剂选自1,2-丙二醇。

作为优选，氢键供体试剂与氢键受体试剂的摩尔比为1:2。

一种低共熔溶剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

S01、将氢键受体试剂和氢键供体试剂按照预设摩尔比，混合加入到烧瓶中。

S02、在烧瓶中加入搅拌子，用磁力搅拌器搅拌混合物，温度为70-80℃，加热2h～10h，直到形成无色透明液体，待冷却至室温后，将无色透明液体存放在硅胶干燥器中，干燥时间为14d。

作为优选，在步骤S02中，反应温度为75℃。

作为优选，在步骤S02中，加热时间为6h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明与传统的缓冲溶剂相比，先进行了DES-缓冲溶剂的制备，然后在糖苷转移酶的过程中将传统的缓冲溶剂换成DES-缓冲溶剂，低共熔溶剂制作简单、反应条件温和、无毒、可降解，符合绿色化学的发展，具有广泛的工业生产前景。

同时，本发明提供的低共熔溶剂解决了底物溶解性对冷冻电镜制样的影响的问题，促进黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。

具体实施方式

下面的的实施例可以帮助本领域的技术人员更好的理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。

实施例1

本发明提供了一种用于冷冻电镜制样的低共熔溶剂及其制备方法，解决底物溶解性对冷冻电镜制样的影响的问题，促进黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。该低共熔溶剂是由氯化胆碱与纯度≥99％的甘油按照1:2的比例混合制成。

制备上述低共溶溶剂的方法如下：氯化胆碱与纯度≥99％的甘油按照1:2的比例混合在烧瓶中，在烧瓶中加入搅拌子，用磁力搅拌器搅拌混合物，温度为70℃-80℃，加热2h以上，直到形成无色透明液体。待冷却至室温后，将这些透明液体存放在硅胶干燥器中，干燥两周。干燥后的低共熔溶剂与原来缓冲溶剂进行1:99的混合，得到DES-缓冲溶液。

本发明提供了一种DES-缓冲溶液运用于糖苷转移酶冷冻电镜检测样品的制备方法，具体方法如下:

在试管5mL培养液中接种10μL菌液，加入5μL的卡那霉素，放入摇床中，温度37℃，转速为180-200r/min，菌体活化8-10h。将试管中的菌液倒入200mL培养基中，加入200μL卡那霉素。放入摇床中，温度为37℃，转速为200r/min，扩大培养2-4h。放入200μL诱导剂，半乳糖苷诱导剂(IPTG)，放入摇床中。温度为25℃，转速为150r/min，诱导18-20h。诱导后将菌液离心，弃上清液，取菌体。用咪唑对菌体重悬，在高压匀浆破胞机中将培养的细胞进行破胞，再进行离心，取上清液分装得到粗酶液。粗酶液经0.45μm滤膜过滤后采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白。将得到的酶液进行浓缩，以除去咪唑成分，并且浓缩过程中用DES-缓冲溶液替换原来的缓冲溶液，得到糖苷转移酶样品。

在铜网上滴加溶液状态下的样品，形成很薄的样品液层，然后再将铜网投放到液态乙烷中进行快速冷冻。将这样的冷冻样品保持低温放置在透射电子显微镜下观察，从而获得生物大分子的结构。

实施例2

本发明提供了一种低共熔溶剂用于糖苷转移酶冷冻电镜检测样品的制备方法，解决底物溶解性对冷冻电镜制样的影响的问题，促进黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。该低共熔溶剂是由氯化胆碱与纯度≥99％的乙二醇按照1:2的比例混合制成。

制备上述低共溶溶剂的方法如下:氯化胆碱与纯度≥98％的乙二醇按照1:2的比例混合在烧瓶中，在烧瓶中加入搅拌子，用磁力搅拌器搅拌混合物，温度为70℃-80℃，加热2h以上，直到形成无色透明液体。待冷却至室温后，将这些透明液体存放在硅胶干燥器中，干燥两周。干燥后的低共熔溶剂与原来缓冲溶剂进行1:99的混合，得到DES-缓冲溶液。

本发明提供了一种DES-缓冲溶液运用于糖苷转移酶冷冻电镜检测样品的制备方法，具体方法如下:

在试管5mL培养液中接种10μL菌液，加入5μL的卡那霉素，放入摇床中，温度37℃，转速为180-200r/min，菌体活化8-10h。将试管中的菌液倒入200mL培养基中，加入200μL卡那霉素。放入摇床中，温度为37℃，转速为200r/min，扩大培养2-4h。放入200μL诱导剂，半乳糖苷诱导剂(IPTG)，放入摇床中。温度为25℃，转速为150r/min，诱导18-20h，诱导后将菌液离心，弃上清液，取菌体。用咪唑对菌体重悬，在高压匀浆破胞机中将培养的细胞进行破胞，再进行离心，取上清液分装得到粗酶液。粗酶液经0.45μm滤膜过滤后采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白。将得到的酶液进行浓缩，以除去咪唑成分，并且浓缩过程中用DES-缓冲溶液替换原来的缓冲溶液，得到糖苷转移酶样品。

在铜网上滴加溶液状态下的样品，形成很薄的样品液层，然后再将铜网投放到液态乙烷中进行快速冷冻。将这样的冷冻样品保持低温放置在透射电子显微镜下观察，从而获得生物大分子的结构。

实施例3

本发明提供了一种低共熔溶剂用于糖苷转移酶冷冻电镜检测样品的制备方法，解决底物溶解性对冷冻电镜制样的影响的问题，促进黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。该低共熔溶剂是由氯化胆碱与纯度≥99％的1,2-丙二醇按照1:2的比例混合制成。

制备上述低共溶溶剂的方法如下:氯化胆碱与纯度≥99％的1,2-丙二醇按照1:2的比例混合在烧瓶中，在烧瓶中加入搅拌子，用磁力搅拌器搅拌混合物，温度为70℃-80℃，加热2h以上，直到形成无色透明液体。待冷却至室温后，将这些透明液体存放在硅胶干燥器中，干燥两周。干燥后的低共熔溶剂与原来缓冲溶剂进行1:99的混合，得到DES-缓冲溶液。

本发明提供了一种DES-缓冲溶液运用于糖苷转移酶冷冻电镜检测样品的制备方法，具体方法如下:

在试管5mL培养液中接种10μL菌液，加入5μL的卡那霉素，放入摇床中，温度37℃，转速为180-200r/min，菌体活化8-10h。将试管中的菌液倒入200mL培养基中，加入200μL卡那霉素。放入摇床中，温度为37℃，转速为200r/min，扩大培养2-4h。放入200μL诱导剂，半乳糖苷诱导剂(IPTG)，放入摇床中。温度为25℃，转速为150r/min，诱导18-20h，诱导后将菌液离心，弃上清液，取菌体。用咪唑对菌体重悬，在高压匀浆破胞机中将培养的细胞进行破胞，再进行离心，取上清液分装得到粗酶液。粗酶液经0.45μm滤膜过滤后采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白。将得到的酶液进行浓缩，以除去咪唑成分，并且浓缩过程中用DES-缓冲溶液替换原来的缓冲溶液，得到糖苷转移酶样品。

在铜网上滴加溶液状态下的样品，形成很薄的样品液层，然后再将铜网投放到液态乙烷中进行快速冷冻。将这样的冷冻样品保持低温放置在透射电子显微镜下观察，从而获得生物大分子的结构。

本发明的结果:

经检测，本发明解决底物溶解性对冷冻电镜制样的影响的问题，促进黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。并且很大程度的提高了糖苷转移酶的催化活性、热稳定性以及储存时间。本发明的应用:天然药用活性物中的非极性化合物黄酮、联苯等类型化合物可以通过糖基化改变其极性实现极性翻转，进而促进其在生物体内的吸收与运输，提高其生物活性。在研究糖苷转移酶的催化机理过程中，将使用冷冻电镜对其结构进行研究，但冷冻电镜的制样通常在纯水环境进行，造成底物溶解性不好而析出，阻碍了酶促反应的进行。为了解决非极性底物在水环境反应体系中难溶的问题，促进了黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，本发明使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。