对工程化细胞组合物进行质谱分析的方法

相关申请的交叉引用

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技术领域

本文提供了用于产生来自细胞组合物如工程化细胞组合物的样品的质谱(MS)图谱的方法。在一些实施方案中，质谱图谱包括基于一种或多种质谱分析或技术的数据。本文还提供了基于此类细胞组合物的一种或多种样品的质谱图谱的用于以下的方法：通过与参考质谱图谱进行比较，鉴定包含含有重组受体的免疫细胞的基因工程化细胞组合物的质谱(MS)图谱；表征用于产生基因工程化细胞组合物的过程；评估工程化细胞组合物的细胞表面蛋白；以及评估用于产生基因工程化细胞组合物的过程。

背景技术

自体T细胞疗法(如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法)已经显示出治疗患有疾病的受试者的巨大希望，所述疾病包括癌症如复发性和难治性B细胞肿瘤，如急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。虽然此类疗法有很大的潜力使患病受试者受益，但是自体T细胞疗法通常比替代疗法更复杂，这部分是由于以下事实：药物产品包含从具有不同遗传背景和不同疾病变异或程度的受试者获得的活细胞，以及必须对细胞进行加工或基因工程化以获得最终药物产品。鉴于这种复杂性，必须注意确保产生在不同受试者中具有一致性品质的细胞疗法。本领域需要另外的方法来分析用于产生细胞疗法的细胞组合物和试剂。

发明内容

本文提供了用于鉴定基因工程化细胞组合物的质谱(MS)图谱的方法，所述方法包括：使用质谱技术确定来自测试工程化细胞组合物或其子集的样品的测试质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞；将测试质谱图谱与参考质谱图谱进行比较；以及鉴定与参考质谱图谱相比，在所述测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，从而鉴定含有所述重组受体的细胞组合物的质谱图谱。

本文还提供了用于鉴定基因工程化细胞组合物的质谱(MS)图谱的方法，所述方法包括：使用质谱技术确定来自测试工程化细胞组合物或其子集的样品的测试质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含含有编码重组受体的核酸分子的免疫细胞；将测试质谱图谱与参考质谱图谱进行比较；以及鉴定与参考质谱图谱相比，在所述测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，从而鉴定所述样品所特有的质谱图谱。

本文还提供了用于鉴定基因工程化细胞组合物的质谱(MS)图谱的方法，所述方法包括：使用质谱技术确定来自测试工程化细胞组合物或其子集的样品的测试质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞；以及鉴定与参考质谱图谱相比，在测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，从而鉴定所述样品所特有的包含所述重组受体的细胞组合物的质谱图谱。

在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，或者是来自多种参考组合物的若干样品的平均质谱图谱。

在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是基于来自参考组合物的样品。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是基于来自参考组合物的多种样品。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是基于来自多种参考组合物的若干样品。

在一些实施方案中，所述测试工程化细胞组合物用于自体细胞疗法。在一些实施方案中，所述测试工程化细胞组合物通过包括以下项的过程产生：从来自受试者的样品选择或分离免疫细胞，从而产生源组合物，任选地其中所述生物样品是白细胞单采术样品、单采术样品或全血样品；将所述源组合物的细胞与刺激试剂一起孵育，从而产生刺激组合物，其中所述孵育任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行；将编码所述重组受体的核酸引入到所述刺激组合物的免疫细胞中，从而产生转化组合物；以及将所述刺激组合物在37℃下培养至少24小时，从而产生所述测试工程化细胞组合物，其中所述培养任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行。

在一些实施方案中，所述参考组合物或所述多种参考细胞组合物中的每一种尚未引入编码所述重组受体的核酸分子。

在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，并且所述参考细胞组合物是含有从中衍生或获得所述测试细胞组合物的免疫细胞的源细胞组合物。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，其中：所述测试工程化细胞组合物含有从受试者获得的免疫细胞，所述免疫细胞含有编码所述重组受体的核酸分子；并且所述参考细胞组合物是含有从所述受试者获得的免疫细胞的输入组合物，所述免疫细胞不含编码所述重组受体的核酸。

在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，并且所述参考细胞组合物是在用于产生所述测试工程化细胞组合物的制造过程阶段之后、之前或期间获得的组合物。

在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物是从过程的一个阶段产生的，并且所述参考组合物是在产生所述测试工程化细胞组合物的阶段之后、之前或期间获得的。

在一些实施方案中，所述测试工程化细胞组合物是从先前施用所述工程化细胞组合物的受试者获得的样品。在一些实施方案中，从所述受试者获得的所述样品含有用所述重组受体工程化的免疫细胞，任选地如通过流式细胞术或聚合酶链式反应(PCR)所检测的。在一些实施方案中，从所述受试者获得的所述样品是血液样品或肿瘤样品。

在一些实施方案中，从所述受试者获得的所述样品是在向所述受试者施用所述工程化细胞后在或在约6与30天之间、在或在约14与29天之间或者在或在约17与22天之间获得的。在一些实施方案中，所述样品是在或大约在所述受试者的血液中可检测到表达所述重组受体的峰值细胞时或者之后立即从所述受试者获得的。

在一些实施方案中，所述测试工程化细胞组合物含有已由药剂接触以产生重组受体依赖性活性的细胞，任选地其中所述药剂是能够被所述重组受体结合的靶抗原或是对所述抗体具有特异性的抗独特型抗体。

在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是来自多种参考组合物的若干样品的平均质谱图谱。在一些实施方案中，所述多种参考组合物中的每一种包含含有重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述多种参考组合物中的每一种是通过与所述工程化细胞组合物相同的过程或基本上相同的过程产生的。

本文提供了用于评估产生基因工程化细胞组合物的过程的方法，所述方法包括计算跨越基于来自多种参考工程化细胞组合物或其子集的样品的若干质谱图谱，至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的变异性量，其中所述多种参考工程化细胞组合物中的每一种包含通过相同过程或基本上相同过程产生的重组受体。

本文提供了用于评估产生基因工程化细胞组合物的过程的方法，所述方法包括：获得多种参考工程化细胞组合物或其子集的样品的平均质谱图谱，其中所述多种参考组合物中的每一种含有通过相同过程或基本上相同过程产生的重组受体；以及确定所述平均质谱图谱的变异性或变化的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，所述方法还包括：如果在所述多种参考组合物之中，所述质谱图谱的变异性或变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，或者依据这种平均，变化不超过在数据组分之中的一个标准偏差，则选择用于产生工程化细胞组合物的所述过程。

本文提供了用于评估产生基因工程化细胞组合物的过程的方法，所述方法包括：获得基于来自多种参考工程化细胞组合物或其子集的样品的若干质谱图谱的平均质谱图谱，其中所述多种参考工程化细胞组合物中的每一种包含通过相同过程或基本上相同过程产生的重组受体；以及基于所述若干质谱图谱产生参考质谱图谱；以及确定跨越所述平均质谱图谱数值变化的至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的变异性量，从而确定由所述过程产生的细胞组合物的变化程度。

在一些实施方案中，所述方法使用质谱图谱测试用于产生基因工程化细胞组合物的过程是否导致跨越多种工程化细胞组合物的变异性或差异。在一些实施方案中，使用基于来自所述多种工程化细胞组合物的样品的平均质谱图谱来评估这种变异性或变化的程度。

在一些实施方案中，所述方法包括：如果跨越所述若干质谱图谱的所述至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的变异性量为所述参考质谱图谱中至少一种数据组分的水平的不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，则选择用于产生基因工程化细胞组合物的过程。

在一些实施方案中，所述平均质谱图谱是以下样品的质谱图谱：(1)所述参考组合物中的细胞；(2)所述组合物中的CD3+细胞；(3)所述组合物中的CD4+T细胞；(4)所述组合物中的CD8+T细胞；(5)所述组合物中的重组受体+细胞；(6)所述组合物中的重组受体+CD3+细胞；(7)所述组合物中的重组受体+CD8+细胞；或(8)所述组合物中的重组受体+CD4+细胞。

在一些实施方案中，所述多种参考组合物中的每一种通过包括以下项的过程产生：从来自受试者的样品选择或分离免疫细胞，从而产生源组合物，任选地其中所述生物样品是白细胞单采术样品、单采术样品或全血样品；将所述源组合物的细胞与刺激试剂一起孵育，从而产生刺激组合物，其中所述孵育任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行；将编码所述重组受体的核酸引入到所述刺激组合物的免疫细胞中，从而产生转化组合物；以及将所述刺激组合物在37℃下培养至少24小时，从而产生所述测试工程化细胞组合物，其中所述培养任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行。

在一些实施方案中，所述测试质谱图谱和参考质谱图谱单独地是肽图谱。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是使用与所述测试质谱图谱相同的质谱技术来确定的。

本文提供了用于表征产生基因工程化细胞组合物的过程的方法，所述方法包括：使用质谱技术确定来自第一细胞组合物的样品的第一质谱图谱；使用质谱技术确定来自第二细胞组合物的样品的第二质谱图谱；以及鉴定与所述第二质谱图谱相比，在所述第一质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，其中所述第一细胞组合物和所述第二细胞组合物含有在用于产生基因工程化细胞组合物的制造过程的不同阶段的组合物。在一些实施方案中，所述第一细胞组合物和所述第二细胞组合物处于产生基因工程化细胞组合物的不同阶段，并且选自：源组合物，其含有从来自受试者的生物样品选择或分离的免疫细胞，任选地其中所述生物样品是白细胞单采术样品、单采术样品或全血样品；刺激组合物，其含有所选组合物中已与刺激试剂接触的免疫细胞，任选地其中所述接触在一种或多种细胞因子的存在下进行；转化组合物，其含有所述刺激组合物中含有编码所述重组受体的核酸的细胞；以及培养组合物，其含有所述转化组合物中已在37℃或约37℃下培养至少24小时的细胞，任选地其中所述培养在一种或多种细胞因子的存在下进行。

在一些实施方案中，与所述第二细胞组合物相比，所述第一细胞组合物是来自所述制造过程的先前阶段或先前时间点的组合物。

本文提供了用于表征产生基因工程化细胞组合物的过程的方法，所述方法包括：使用质谱技术确定来自第一细胞组合物的样品的第一质谱图谱；使用质谱技术确定来自第二细胞组合物的样品的第二质谱图谱；以及鉴定与所述第二质谱图谱相比，在所述第一质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，其中所述第一细胞组合物和所述第二细胞组合物含有由不同过程产生的基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述不同过程在以下中的一个或多个方面不同：血清的存在或浓度；培养的时间；试剂的批次；试剂的处理或储存；刺激试剂的存在或量；刺激试剂的类型；一种或多种细胞因子的存在或量；氨基酸的存在或量；温度；源组合物的来源或免疫细胞类型；源组合物中免疫细胞类型的比率或百分比，任选CD4+/CD8+细胞比率；细胞密度；静态培养；摇摆培养；灌注；病毒载体的类型；载体拷贝数；转导佐剂的存在；冷冻保存时源组合物的细胞密度；所述重组受体的表达程度；或调节细胞表型的化合物的存在。

在一些实施方案中，所述第一质谱图谱和所述第二质谱图谱单独地是肽图谱。在一些实施方案中，所述第一质谱图谱和所述第二质谱图谱使用相同质谱技术来确定。

本文提供了表征重组受体的方法，所述方法包括使用质谱技术获得具有从来自工程化细胞组合物或其子集的样品分离的重组受体的至少一种数据组分的质谱图谱，所述工程化细胞组合物或其子集包含表达或含有所述重组受体的免疫细胞。

本文提供了表征重组受体的方法，所述方法包括使用质谱技术获得来自测试工程化细胞组合物的样品的重组受体的质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含表达或含有所述重组受体的免疫细胞，所述质谱图谱包括至少一种数据组分。

本文提供了表征重组受体的方法，所述方法包括：使用质谱技术获得来自测试工程化细胞组合物或其子集的样品的测试质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物或其子集包含表达或含有重组受体的免疫细胞；使用质谱技术获得来自包含免疫细胞的参考组合物或其子集的样品的参考质谱图谱，所述参考质谱图谱包括至少一种数据组分；以及鉴定与所述参考质谱图谱相比，在所述测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异。

在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定与相同但不表达所述重组受体的细胞的质谱图谱相比，所述至少一种数据组分的一个或多个差异。

在一些实施方案中，所述测试工程化细胞组合物和所述参考细胞组合物基本上类似，不同之处是所述重组受体的存在，任选地其中所述测试工程化细胞组合物和所述参考组合物通过基本上类似的过程产生和/或包含相同类型的免疫细胞。

在一些实施方案中，已在刺激试剂的存在下刺激所述测试工程化细胞组合物。在一些实施方案中，所述工程化细胞组合物含有已由药剂接触以产生重组受体依赖性活性的细胞，任选地其中所述药剂是能够被所述重组受体结合的靶抗原或是对所述抗体具有特异性的抗独特型抗体。

在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定与相同但尚未在刺激试剂的存在下被刺激或已在不同刺激试剂存在下被刺激的工程化细胞组合物的质谱相比，所述质谱图谱中的一个或多个差异。

在一些实施方案中，所述细胞组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞包括淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞包括T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞包括T细胞，并且所述T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是人的。

在任何提供的实施方案中，任何所述细胞组合物包括富集了免疫细胞的细胞组合物，如通过从生物样品选择、分离或纯化免疫细胞进行富集，例如通过基于免疫亲和力的方法进行富集。在一些实施方案中，所述测试工程化细胞组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述参考组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述参考工程化细胞组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述源组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述刺激组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述转化组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述第一细胞组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述第二细胞组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述培养组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述测试工程化细胞组合物和所述参考组合物中的每一种富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述测试工程化细胞组合物和所述参考工程化组合物中的每一种富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述第一细胞组合物和所述第二细胞组合物中的每一种富集了所述免疫细胞。

在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、任选CD4+和/或CD8+T细胞，并且所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述刺激试剂包括与TCR复合物的成员特异性结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。在一些实施方案中，所述一级药剂与CD3特异性结合和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在一些实施方案中，所述刺激试剂包括抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂存在于固体支持物的表面上，任选地其中所述固体支持物是珠。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂存在于包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的可溶性寡聚试剂的表面上。

在一些实施方案中，所述培养在促进所述工程化细胞增殖和/或扩增的条件下进行。

在一些实施方案中，所述样品是通过标记一种或多种表面蛋白、使细胞裂解并分离所述一种或多种蛋白质而从所述测试工程化细胞组合物加工得到的。在一些实施方案中，所述方法还包括消化所述一种或多种分离的蛋白质。

本文提供了评估工程化细胞组合物的表面蛋白的方法，所述方法包括(a)标记存在于工程化细胞组合物或其子集的细胞上的一种或多种表面蛋白，所述工程化细胞组合物包含表达或含有重组受体的细胞，从而产生标记的细胞组合物；(b)使标记的细胞组合物的细胞裂解，从而产生裂解的细胞组合物；(c)从所述裂解的细胞组合物分离所述一种或多种表面蛋白，以获得一种或多种分离的蛋白质；以及(d)使所述一种或多种分离的蛋白质经受质谱技术以获得包括一种或多种数据组分的质谱图谱。

在一些实施方案中，在(d)之前，所述方法还包括消化所述一种或多种分离的蛋白质。在一些实施方案中，所述消化在能够切割一个或多个肽键的一种或多种蛋白酶的存在下通过蛋白水解进行。在一些情况下，所述一种或多种蛋白酶是或含有胰蛋白酶。

在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白质含有细胞表面膜蛋白。在一些实施方案中，使所述细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育。在一些实施方案中，所述洗涤剂是非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂是或含有有效量的Triton X-100。在一些实施方案中，所述洗涤剂是变性洗涤剂。在一些例子中，所述变性洗涤剂是或含有有效量的十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方案中，在使所述细胞裂解之后，所述方法还包括从所述裂解的组合物中去除所述洗涤剂。

在一些实施方案中，标记所述表面蛋白包括对伯胺进行生物素标记。在一些例子中，使用含有亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin

在一些实施方案中，所述质谱技术包括使所述样品经受液相色谱法(LC)，然后经受质谱法。在一些实施方案中，所述液相色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UHPLC)或超效液相色谱法(UPLC)。在一些情况下，所述液相色谱法是超效液相色谱法(UPLC)。

在一些实施方案中，所述液相色谱法和所述质谱法是联机进行的。在一些实施方案中，所述液相色谱法选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水相互作用色谱法(HILIC)。在一些实施方案中，执行所述质谱法的质谱仪包括四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。在一些实施方案中，所述质谱仪包括离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。在一些例子中，所述质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。

在一些实施方案中，所述数据组分选自MS离子信息、总离子色谱仪(TIC)或其一部分、提取离子色谱图(XIC)或其一部分、肽MS离子信号峰、蛋白质MS离子信号峰、肽鉴定信息、蛋白质鉴定信息、定性信息、定量信息、结构信息、翻译后修饰。在一些实施方案中，所述数据组分是XIC或其一部分，其中所述XIC或其一部分是基于所述重组受体的一种或多种肽组分的一个或多个理论或已知m/z值。在一些实施方案中，所述一种或多种肽组分是经蛋白水解切割或消化的肽组分，任选地其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

在一些任何此类实施方案中，所述重组受体是或含有嵌合受体和/或重组抗原受体。在一些实施方案中，所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些例子中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或者肿瘤或癌症。在一些方面，所述靶抗原是肿瘤抗原。在一些例子中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。

在一些任何此类实施方案中，所述重组受体是或含有功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施方案中，所述样品是选自以下的细胞组合物或其子集的样品：(1)所述细胞组合物中的细胞；(2)所述细胞组合物中的CD3+细胞；(3)所述细胞组合物中的CD4+T细胞；(4)所述细胞组合物中的CD8+T细胞；(5)所述细胞组合物中的重组受体+细胞；(6)所述细胞组合物中的重组受体+CD3+细胞；(7)所述细胞组合物中的重组受体+CD8+细胞；或(8)所述细胞组合物中的重组受体+CD4+细胞，任选地其中所述重组受体是CAR。

在此提供了通过过程产生的工程化细胞组合物，其中在由所述过程产生的多种工程化细胞组合物的平均质谱图谱之中，来自所述工程化细胞组合物或其子集的样品的质谱图谱变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，或者依据这种平均，变化不超过在所述质谱图谱的数据组分之中的一个标准偏差。

在此提供了通过过程产生的工程化细胞组合物，其中相对于基于来自通过所述过程产生的多种工程化细胞组合物的样品的若干质谱图谱的参考质谱图谱的至少一种数据组分的水平，使用质谱技术获得的来自工程化细胞组合物或其子集的样品的质谱图谱的至少一种数据组分的水平变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，或者相对于这种参考，变化不超过跨越所述若干质谱图谱的至少一种数据组分的水平的标准偏差。

在一些实施方案中，所述工程化细胞组合物包含重组受体。在一些实施方案中，所述工程化细胞组合物包含免疫细胞。

在一些实施方案中，用于产生所述工程化细胞组合物的过程包括：(i)从来自受试者的样品选择或分离免疫细胞，从而产生源组合物，任选地其中所述生物样品是白细胞单采术样品、单采术样品或全血样品；(ii)将所述源组合物的细胞与刺激试剂一起孵育，从而产生刺激组合物，其中所述孵育任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行；(iii)将编码所述重组受体的核酸引入到所述刺激组合物的免疫细胞中，从而产生转化组合物；以及(iv)将所述刺激组合物在37℃下培养至少24小时，从而产生所述测试工程化细胞组合物，其中所述培养任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行。

在一些实施方案中，所述细胞组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞包括淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞包括T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些例子中，所述淋巴细胞包括T细胞，并且所述T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。

在一些实施方案中，所述工程化细胞组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述源组合物富集了所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述转化组合物富集了所述免疫细胞。

在一些实施方案中，所述免疫细胞是人的。

在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、任选CD4+和/或CD8+T细胞，并且所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述刺激试剂包括与TCR复合物的成员特异性结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。在一些情况下，所述一级药剂与CD3特异性结合和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。

在一些实施方案中，所述刺激试剂包括抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂存在于固体支持物的表面上，任选地其中所述固体支持物是珠。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂存在于包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的可溶性寡聚试剂的表面上。

在一些实施方案中，所述培养在促进所述工程化细胞增殖和/或扩增的条件下进行。在一些实施方案中，所述样品是通过标记一种或多种表面蛋白、使细胞裂解并分离所述一种或多种蛋白质而从所述工程化细胞组合物加工得到的。在一些实施方案中，所述方法还包括消化所述一种或多种分离的蛋白质。在一些实施方案中，所述消化在能够切割一个或多个肽键的一种或多种蛋白酶的存在下通过蛋白水解进行。

在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶是或含有胰蛋白酶。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白质包括细胞表面膜蛋白。在一些实施方案中，使所述细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育。在一些例子中，所述洗涤剂是非离子型洗涤剂。

在一些实施方案中，所述洗涤剂是或含有有效量的Triton X-100。在一些情况下，所述洗涤剂是变性洗涤剂。在一些实施方案中，所述变性洗涤剂是或含有有效量的十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方案中，在使所述细胞裂解之后，所述方法还包括从所述裂解的组合物中去除所述洗涤剂。

在一些实施方案中，标记所述表面蛋白包括对伯胺进行生物素标记。

在一些实施方案中，使用包含亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin

在一些实施方案中，所述质谱技术包括使所述样品经受液相色谱法(LC)，然后经受质谱法。在一些例子中，所述液相色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UHPLC)或超效液相色谱法(UPLC)。在一些实施方案中，所述液相色谱法是超效液相色谱法(UPLC)。在一些情况下，所述液相色谱法和所述质谱法是联机进行的。在一些实施方案中，所述液相色谱法选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水相互作用色谱法(HILIC)。

在一些实施方案中，执行所述质谱法的质谱仪包括四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。在一些实施方案中，所述质谱仪包括离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。在一些实施方案中，所述质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。

在一些实施方案中，所述数据组分选自MS离子信息、总离子色谱仪(TIC)或其一部分、提取离子色谱图(XIC)或其一部分、肽MS离子信号峰、蛋白质MS离子信号峰、肽鉴定信息、蛋白质鉴定信息、定性信息、定量信息、结构信息、翻译后修饰。在一些实施方案中，所述数据组分是XIC或其一部分，其中所述XIC或其一部分是基于所述重组受体的一种或多种肽组分的一个或多个理论或已知m/z值。

在一些实施方案中，所述一种或多种肽组分是经蛋白水解切割或消化的肽组分，任选地其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

在一些实施方案中，所述重组受体是或包括嵌合受体和/或重组抗原受体。在一些实施方案中，所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些情况下，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或者肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在一些例子中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。

在一些实施方案中，所述重组受体是或包括功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。

本文提供了评价在产生工程化细胞组合物的过程中使用的试剂的方法，所述方法包括将来自第一试剂的样品的质谱图谱与所述试剂的参考质谱图谱进行比较，其中所述质谱图谱是使用质谱技术获得的；以及鉴定与所述参考质谱图谱相比，在所述测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，从而鉴定所述试剂的质谱图谱。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是来自参考试剂的样品的质谱图谱，或者是来自多种不同批次的所述试剂的若干样品的平均质谱图谱。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是多个不同批次的所述试剂的样品的平均质谱图谱。

在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述样品的质谱图谱相对于所述平均质谱图谱的变异性或变化的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，所述方法还包括：如果在所述多个不同批次的试剂之中，所述质谱图谱的变异性或变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，或者依据这种平均，变化不超过在所述质谱图谱的数据组分之中的一个标准偏差，则选择所述试剂。

在一些实施方案中，所述方法还包括：如果跨越所述若干质谱图谱的至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的变异性量为所述参考质谱图谱中至少一种数据组分的水平的不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，则选择所述试剂。

在一些实施方案中，所述方法还包括：如果相对于来自所述参考质谱图谱的至少一种数据组分的水平，所述测试质谱图谱的至少一种数据组分的水平变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，或者相对于这种水平，变化不超过跨越所述若干质谱图谱的至少一种数据组分的水平的标准偏差，则选择所述试剂。

在一些实施方案中，所述质谱技术包括使所述样品经受液相色谱法(LC)，然后经受质谱法。在一些实施方案中，所述液相色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UHPLC)或超效液相色谱法(UPLC)。在一些情况下，所述液相色谱法是超效液相色谱法(UPLC)。

在一些实施方案中，所述液相色谱法和所述质谱法是联机进行的。在一些实施方案中，所述液相色谱法选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水相互作用色谱法(HILIC)。在一些实施方案中，执行质谱法的质谱仪包括四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。

在一些实施方案中，所述质谱仪包括离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。在一些实施方案中，所述质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。

在一些实施方案中，所述数据组分选自MS离子信息、总离子色谱仪(TIC)或其一部分、提取离子色谱图(XIC)或其一部分、肽MS离子信号峰、蛋白质MS离子信号峰、肽鉴定信息、蛋白质鉴定信息、定性信息、定量信息、结构信息、翻译后修饰。

在一些实施方案中，所述试剂是能够刺激细胞组合物、任选T细胞组合物的细胞中的信号的试剂。在一些实施方案中，所述细胞组合物的细胞包含重组受体、任选嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述试剂能够刺激或诱导所述细胞组合物的细胞中的重组受体依赖性活性。

附图说明

图1A和图1B示出了从鉴定的源(CAR-)和工程化(CAR+)T细胞组合物分离的细胞表面蛋白的质谱分析的示例性读出。图1A描绘了代表细胞表面蛋白的肽离子的示例性总离子色谱图(TIC)。图1B描绘了与来自工程化和源T细胞组合物的CAR的细胞外和细胞内部分相关的肽峰的示例性提取离子色谱图(XIC)。

图2描绘了存在于试剂中的三种单独蛋白质的LC分析图谱和共洗脱蛋白质的质荷比(m/z)，所述三种单独蛋白质包括从在用于产生工程化(CAR+)T细胞组合物的过程中使用的三个不同批次的示例性原料分离的具有翻译后修饰(PTM)的蛋白质。

图3描绘了在用于产生工程化(CAR+)T细胞组合物的过程中使用的原始试剂的三种不同滴定样品中蛋白质2(具有翻译后修饰(PTM))和蛋白质3的相对百分比的质谱分析。

图4A-图4C示出了在PNG酶F处理后从整个完整CD3+激活的T细胞中释放的N-聚糖的HILIC-LC和串联MS所产生的色谱图。图4A示出了PNG酶F从激活的CD3+T细胞组合物中释放的N-聚糖的HILIC-FLR色谱图。图4B示出了使用5ppm质量公差从处于+3带电状态的示例性N-聚糖A3S3F(理论质量为1113.0933)的串联MS的第一阶段产生的提取离子色谱图(XIC)。图4C示出了由串联MS的第二阶段产生的另外的示例性N-聚糖A3S4F(理论质量为1210.4614)的MS/MS碎片化。图4C中的虚线框指示不同的n-乙酰葡糖胺残基连接。

具体实施方式

本文提供了用于鉴定细胞组合物的质谱图谱的方法，所述细胞组合物包括基因工程化细胞组合物，例如自体CAR T细胞组合物。在一些方面，所提供的方法涉及使用质谱技术确定来自工程化细胞组合物的样品的质谱图谱(例如，测试质谱图谱)。在一些方面，所述工程化细胞组合物含有或包含含有重组受体(例如，CAR)的细胞。在特定方面，将质谱图谱与参考质谱图谱(例如使用相同质谱技术确定的来自用作参考的组合物(例如，参考细胞组合物)的样品的参考质谱图谱或从所述样品获得的参考质谱图谱)进行比较，例如以鉴定与参考质谱图谱相比，在测试质谱图谱中至少一种肽种类(包括其翻译后修饰)的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异。

本文还提供了用于表征产生基因工程化细胞组合物的过程(例如，制造过程)的方法。在某些实施方案中，分析在所述过程的不同阶段获得的细胞组合物的质谱图谱，以表征所述过程，或在一些方面，以表征所述过程期间细胞所经历的变化。在一些方面，分析从不同过程(例如，用于产生工程化细胞的制造过程)产生的工程化细胞组合物的质谱图谱，以表征所述过程，或者在一些方面，以表征由不同过程产生的细胞组合物的相似性或差异。

在一些方面，提供了用于评估产生基因工程化细胞组合物的过程的方法。在一些方面，所述方法是或包括获得多种参考工程化细胞组合物或其子集的样品的平均质谱图谱，以及确定所述平均质谱图谱的变异性或变化的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，所述多种参考组合物含有通过相同过程或基本上相同过程产生的表达重组受体的细胞。

在一些方面，提供了用于评估产生基因工程化细胞组合物的过程的方法。在一些方面，所述方法是或包括获得来自多种参考工程化细胞组合物或其子集的样品的若干质谱图谱、产生其平均质谱图谱以及确定在平均质谱图谱中至少一种肽种类(包括其翻译后修饰)的存在、不存在或水平。在一些方面，所述方法还包括确定跨越所述多个质谱图谱的至少一种肽种类(包括其翻译后修饰)的水平的变异性或变化的量。在一些方面中，将所述至少一种肽种类的水平的变异性或变化的量与所述至少一种肽种类的平均水平进行比较，从而确定跨越样品的变异性程度。在一些实施方案中，所述多种参考组合物含有通过相同过程或基本上相同过程产生的表达重组受体的细胞。

在一些方面，提供了用于评估产生基因工程化细胞组合物的过程的方法。在一些方面，所述方法是或包括获得来自多种参考工程化细胞组合物或其子集的样品的若干质谱图谱以及确定跨越所述多个质谱图谱的至少一种肽种类(包括其翻译后修饰)的水平的变异性或变化的量。在一些实施方案中，所述多种参考组合物含有通过相同过程或基本上相同过程产生的表达重组受体的细胞。

还提供了用于表征产生基因工程化细胞或细胞组合物的过程的方法。在一些方面中，所述方法包括使用质谱技术获得来自不同细胞组合物的样品的第一质谱图谱和第二质谱图谱以及鉴定质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一种或多种差异。在一些实施方案中，所述细胞组合物是或含有在用于产生基因工程化细胞组合物的制造过程的不同阶段的组合物。在某些实施方案中，所述组合物含有通过不同过程产生的基因工程化细胞。

在一些方面，所提供的方法可用于评估或表征重组受体，例如通过使用质谱技术获得样品的重组受体的质谱图谱来评估或表征重组受体。在一些实施方案中，所述样品来自包含表达或含有重组受体的免疫细胞的测试工程化细胞组合物或其子集，所述质谱图谱包括至少一种数据组分。

本文提供的另外的方法可用于分析或评估工程化细胞组合物的表面蛋白。在一些实施方案中，此类方法包括以下步骤：标记存在于工程化细胞组合物或其子集的细胞上的一种或多种表面蛋白、使所述标记的细胞组合物的细胞裂解、分离所述表面蛋白以及然后使所述分离的蛋白质经受质谱技术。在一些方面，所述方法产生含有数据组分的质谱图谱，所述数据组分例如与一种或多种表面蛋白相关的组分，在一些情形下其包括重组受体或CAR。

特定实施方案设想细胞疗法以及特别是过继T细胞疗法代表了用于治疗、减轻和/或改善各种疾病(如癌症)的一种强大的技术。可用于分析或表征治疗性或药物细胞组合物的当前分析工具包括细胞表面或内部标记的检查(如通过流式细胞术)或通过诸如RNA-seq或ATAC-seq的技术的基因表达检查。虽然这些技术在一些方面可用于分析或表征细胞组合物，但这些技术并非没有限制。例如，在一些方面，蛋白质表达的检测(如通过基于流式细胞术的方法)可能受限于可在单个实验中检查到的不同单独标记的量。在一些方面，此类测定必须集中于由于可评估的靶标的量有限而被预测或假设在某些条件下发生改变的靶标。相反，通过RNA-seq或ATAC-seq进行基因表达分析适用于全基因组筛选，从而允许无偏差地检测可能受某些条件影响的靶标。然而，这些技术的局限性在于，基因表达水平上的变化并不总是与功能性蛋白质表达水平的变化相关。

在特定实施方案中，本文提供了可用于检测、鉴定和/或定量存在于细胞组合物中的蛋白质(如细胞表面蛋白)的无偏差方法。在特定方面，所提供的方法的优点在于，所述方法可用于检测在不同条件下蛋白质(例如，表面蛋白)的变化，而无需在分析前选择或预测特定靶标。在一些方面，所提供的方法的另外的优点在于，所述方法允许大规模分析蛋白质，如功能性表面蛋白。因此，在一些方面，所提供的方法适于单独使用或与现有方法组合使用，以分析或表征细胞组合物，如细胞疗法组合物。

在一些方面，细胞疗法(如CAR T细胞疗法)是源自受试者并被工程化以产生最终药物产品的活细胞。因此，与小分子或传统生物制剂相反，在一些情况下，可能难以一致地对适于向受试者施用的细胞疗法组合物进行工程化。例如，在一些方面，来源于患有特定疾病的不同个体患者的细胞可能在某些属性(如细胞健康、活力、活性和增殖能力)上有所不同。此类差异可能是由于跨越患者的不同疾病程度或变化，或者在一些方面，可能是由于患者的不同遗传或环境背景。在一些方面，从受试者获得的细胞组合物之间的任何差异可能由于对工程化过程的不同反应而加剧。在一些方面，所提供的方法可用于评估跨越多个受试者产生的细胞疗法的变异性或变化，或确保与施用细胞疗法之前的理想或参考标准相比，单独细胞组合物是在可接受的耐受性内。

在一些方面，所提供的方法利用质谱法来表征存在于细胞组合物的细胞中的一些或全部细胞表面蛋白，从而允许同时评估细胞的不同特征。在一些方面，所提供的方法鉴定并测量存在于细胞上的单独表面蛋白的水平或量。此技术尤其可用于监测在工程化过程期间在单独细胞组合物之中发生的变化，或在向患者施用细胞疗法之前验证细胞疗法的身份和质量。在某些方面，所提供的方法的优点在于，所述方法可检测受限于一次仅分析若干靶蛋白的技术所遗漏的变化，所述技术例如依赖于抗体标记来检测蛋白质的技术。

在特定方面，单个标记或表面蛋白可能不足以检测到T细胞可具有特定特性的程度。所提供的方法的优点在于，可以同时评估与特性相关联的多个标记的变化，从而允许在单次评估中检测沿着若干不同特性的连续体的变化。

本文所提供的方法表明，质谱图谱可以成功地由细胞组合物(如细胞疗法组合物)产生。在一些方面，所述质谱图谱允许还研究与工程化细胞组合物的一种或多种蛋白质或肽(包括其翻译后修饰)相关的数据组分，以表征细胞疗法和不同工程化过程可能对细胞产生的影响。

所提供的方法的特定优点包括所获得的高度分辨率以用于检测和测量样品中的大量蛋白质靶标。在一些方面，这种高度灵敏性允许检测和定量翻译后修饰，如聚糖与蛋白质的缀合。在一些方面，可以将转录后修饰的测量或定量与来自样品的其他读出，如由RNA-seq或使用测序的转座酶可及染色质测定(ATAC-seq)产生的基因组读出进行比较。此类比较尤其可用于鉴定或评价基因组水平下的酶的变化可如何影响特定翻译后修饰，并且在一些情况下可用于开发评估细胞中的特性或功能性的其他测定。例如，在一些方面，所提供的方法可以用于检测细胞表面蛋白的糖基化，并且此类数据可以与单独糖基转移酶基因的表达相关。在一些方面，这种相关性可能可用于鉴定或确定遗传水平的变化如何影响细胞的功能。

在某些方面，所提供的方法结合了质谱法，以实现用于分析复杂混合物的强大工具。在一些方面，已经观察到，在一些情况下，在用于产生工程化T细胞组合物的过程(在其他方面类似的细胞工程化过程)中使用的一种或多种原料或一种或多种试剂或者不同批次的一种或多种原料或一种或多种试剂的储存或处理条件的变化可能在最终工程化组合物中与特定参数相关，所述特定参数与工程化T细胞产物的活性改变或变化相关。(公布的PCT申请号WO 2018/157171)。例如，在一些方面，细胞疗法的开发、生产或工程化可能需要复杂的试剂，例如是或包含一种或多种蛋白质的试剂。在一些方面，满足所有供应商的放行标准的试剂可能展示出批次之间的变化，并且因此，在一些方面，可能需要另外筛选来确保所述试剂不会造成细胞疗法的不希望的变异性或变化。所提供的方法提供了另外的手段来研究此类复杂混合物，以鉴定细胞疗法或试剂的潜在变化，以确保细胞疗法或试剂适合且使用安全。

在一些方面，所提供的方法可以利用基于质谱法的测定，例如LC-MS，以在蛋白质水平上鉴定原料批次的试剂(例如，用于基因工程化细胞组合物的试剂)之间的差异(或不存在差异)。在一些方面，基于质谱法的测定可能足够灵敏以检测制造批次之间的差异，包括可能不影响试剂与细胞之间的相互作用的差异。然而，在一些方面，所提供的方法允许集中于具有生物学相关性差异的子集。因此，在一些方面，虽然所提供的方法产生细胞组合物或试剂的无偏差分析，但是所得数据集(例如，质谱图谱)可以用于评价被预测或假设为生物学相关的蛋白质靶标的子集。

本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。

I.用质谱法分析细胞组合物：

在本申请的一些方面中提供了用于鉴定细胞组合物(如基因工程化细胞的组合物)的质谱(MS)图谱的方法。在一些实施方案中，所述工程化细胞表达重组蛋白，如重组受体或CAR。在特定实施方案中，所述方法包括使用质谱技术确定来自工程化细胞组合物(例如，测试细胞组合物)的样品的质谱图谱(例如，测试质谱图谱)的步骤。在一些实施方案中，将测试质谱图谱与参考质谱图谱进行比较，如用于鉴定质谱图谱的一种或多种数据组分之间的差异。

本申请的一些方面还提供了用于鉴定基因工程化细胞组合物的质谱(MS)图谱的方法，所述方法包括：(a)使用质谱技术确定来自测试工程化细胞组合物的样品的测试质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞；(b)将测试质谱图谱与参考质谱图谱进行比较；以及(c)鉴定与参考质谱图谱相比，在所述测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，从而鉴定包含所述重组受体的细胞组合物的质谱图谱。

A.质谱图谱

在一些方面，质谱法(MS)是能够从样品中收集大量数据的强大分析工具。在某些方面，质谱法(如以高度简化的方式描述的)包括根据其质荷比(m/z)检测由样品产生的离子。在特定方面，将来自离子的MS信号用于产生质谱，所述质谱表示样品离子或其片段的相对丰度作为所述样品离子或其片段m/z比的函数。在特定实施方案中，可以随后在所采集数据的很多信息性水平上(包括在MS离子信息、肽和/或蛋白质鉴定/序列信息、翻译后修饰信息和定量信息的任何组合的水平上)分析从单个或一系列质谱分析获得的数据，如将其与从另一样品或另一质谱分析获得的数据进行比较。在本文公开的方法中，样品或细胞组合物的质谱图谱可以包括至少一种数据组分，其选自来自单个或一系列质谱分析的所采集数据的任何单个信息性水平或信息性水平的任何组合，所述至少一种数据组分包括来自所采集MS信号数据的任何后续分析以及由此得到的信息的任何数据组分。在一些实施方案中，所述数据组分是单个数据点，如鉴定的肽的存在或所述鉴定的肽(包括其翻译后修饰)的量。在一些实施方案中，所述数据组分是数据点的集合，如多个肽的存在或所述多个肽(包括其翻译后修饰)的量。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括MS离子信息，如MS离子的信号。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括一种或多种蛋白质和/或肽种类(包括其翻译后修饰)的MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括一种或多种蛋白质和/或肽离子种类(包括其翻译后修饰)的MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括蛋白质和/或肽种类(包括其翻译后修饰)的一种或多种片段的MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括蛋白质和/或肽离子种类(包括其翻译后修饰)的一种或多种片段的MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括一次或多次MS分析的MS离子信息或其一部分。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括总离子电流色谱图。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括来自多于一次MS分析的总离子电流色谱图。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括总离子电流色谱图的一部分。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括被操纵以包括和/或排除一种或多种MS离子的MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图(XIC或EIC)。在某些方面，用于产生提取离子色谱图的方法是本领域中熟知的，并且包括从针对一个或多个目的m/z值(例如，与一个或多个目的肽相关的m/z值)的MS分析中分离出MS离子信息。在一些实施方案中，目的m/z值包括m/z范围公差，例如包括目的m/z值的m/z窗口。在一些实施方案中，m/z范围公差是基于用于获得质谱图谱的质谱仪。在一些实施方案中，m/z范围公差小于约50ppm，如小于约40ppm、30ppm、20ppm、10ppm或5ppm中的任一者。在一些实施方案中，m/z范围公差为约50ppm，如约40ppm、30ppm、20ppm、10ppm或5ppm中的任一者。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于一种或多种蛋白质种类和/或一种或多种目的肽种类(包括其翻译后修饰)的特性，如所述一种或多种蛋白质种类和/或一种或多种目的肽种类(包括其翻译后修饰)的MS离子的m/z。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于一种或多种蛋白质种类和/或一种或多种目的肽种类(包括其翻译后修饰)的一种或多种带电状态。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于理论MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于计算机MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于代表理论上蛋白酶消化的蛋白质的计算机MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于实验MS离子信息。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于重组受体的特性，例如重组受体(包括其任何翻译后修饰)的MS离子的m/z。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于代表理论上蛋白酶消化的重组受体(包括其任何翻译后修饰)的计算机MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于重组受体(包括其任何翻译后修饰)的实验MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于跨膜蛋白的特性，例如跨膜蛋白(包括其任何翻译后修饰)的MS离子的m/z。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于代表理论上蛋白酶消化的跨膜蛋白(包括其任何翻译后修饰)的计算机MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于跨膜蛋白(包括其任何翻译后修饰)的实验MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于细胞表面蛋白的特性，如细胞表面蛋白(包括其任何翻译后修饰)的MS离子的m/z。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于代表理论上蛋白酶消化的细胞表面蛋白(包括其任何翻译后修饰)的计算机MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于细胞表面蛋白(包括其任何翻译后修饰)的实验MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于嵌合抗原受体(CAR)的特性，例如CAR(包括其任何翻译后修饰)的MS离子的m/z。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于代表理论上蛋白酶消化的CAR(包括其任何翻译后修饰)的计算机MS离子信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括提取离子色谱图，其中提取离子信息是基于CAR(包括其任何翻译后修饰)的实验MS离子信息。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括一个或多个肽MS离子信号峰。在一些实施方案中，所述一个或多个肽MS离子信号峰包括肽(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态。在一些实施方案中，所述一个或多个肽MS离子信号峰包括肽(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态，其中所述肽来自重组受体。在一些实施方案中，所述一个或多个肽MS离子信号峰包括肽(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态，其中所述肽来自跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述一个或多个肽MS离子信号峰包括肽(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态，其中所述肽来自细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述一个或多个肽MS离子信号峰包括肽(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态，其中所述肽来自嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括一个或多个蛋白质MS离子信号峰。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白质MS离子信号峰包括蛋白质(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白质MS离子信号峰包括蛋白质(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态，其中所述蛋白质来自重组受体或其片段。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白质MS离子信号峰包括蛋白质(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态，其中所述蛋白质来自跨膜蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白质MS离子信号峰包括蛋白质(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态，其中所述蛋白质来自细胞表面蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白质MS离子信号峰包括蛋白质(包括其任何翻译后修饰)的一个或多个带电状态，其中所述蛋白质来自嵌合抗原受体(CAR)或其片段。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括包含肽鉴定信息的数据组分。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括一种或多种肽(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的所鉴定肽的任何特征、特性或观察结果，例如由液相色谱仪获得的丰度和洗脱时间。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括单个蛋白质的一种或多种肽(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括蛋白质的预选择的肽子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括氨基酸序列信息。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括重组受体的一种或多种肽(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的所鉴定肽的任何特征、特性或观察结果。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括重组受体的预选择的肽子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括重组受体(包括其任何翻译后修饰)或其一个或多个片段的氨基酸序列信息。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括跨膜蛋白的一种或多种肽(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的所鉴定肽的任何特征、特性或观察结果。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括跨膜蛋白的预选择的肽子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括跨膜蛋白(包括其任何翻译后修饰)或其一个或多个片段的氨基酸序列信息。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括细胞表面蛋白的一种或多种肽(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的所鉴定肽的任何特征、特性或观察结果。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括细胞表面蛋白的预选择的肽子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括细胞表面蛋白(包括其任何翻译后修饰)或其一个或多个片段的氨基酸序列信息。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括嵌合抗原受体(CAR)的一种或多种肽(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的所鉴定肽的任何特征、特性或观察结果。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括CAR的预选择的肽子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述肽鉴定信息包括CAR蛋白(包括其任何翻译后修饰)或其一个或多个片段的氨基酸序列信息。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括包含蛋白质鉴定信息的数据组分。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括一种或多种蛋白质(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的所鉴定蛋白质的任何特征、特性或观察结果，例如由液相色谱仪获得的丰度和洗脱时间。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括一种或多种重组受体(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的一种或多种重组受体的任何特征、特性或观察结果。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括预选择的重组受体子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括重组受体(包括其任何翻译后修饰)或其一个或多个片段的氨基酸序列信息。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括一种或多种跨膜蛋白(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的一种或多种跨膜蛋白的任何特征、特性或观察结果。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括预选择的跨膜蛋白子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括跨膜蛋白(包括其任何翻译后修饰)或其一个或多个片段的氨基酸序列信息。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括一种或多种细胞表面蛋白(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的一种或多种细胞表面蛋白的任何特征、特性或观察结果。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括预选择的细胞表面蛋白子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括细胞表面蛋白(包括其任何翻译后修饰)或其一个或多个片段的氨基酸序列信息。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括一种或多种嵌合抗原受体(CAR)(包括其任何翻译后修饰)的身份，包括通过质谱技术分析获得的一种或多种CAR的任何特征、特性或观察结果。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括预选择的CAR子集(包括其任何翻译后修饰)的身份。在一些实施方案中，所述蛋白质鉴定信息包括CAR(包括其任何翻译后修饰)或其一个或多个片段的氨基酸序列信息。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括定性信息，包括MS离子、肽和/或蛋白质(包括其任何翻译后修饰)的存在。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括重组受体或其一个或多个片段的定性信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括跨膜蛋白或其一个或多个片段的定性信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括细胞表面蛋白或其一个或多个片段的定性信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括嵌合抗原受体(CAR)或其一个或多个片段的定性信息。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括定量信息(即，丰度信息)。本领域已知多种定量质谱技术。定量质谱技术能够提供例如绝对定量(例如，通过所选的反应监测)、半定量(例如，通过化学标记)和相对定量(例如，通过光谱计数)。在一些实施方案中，所述定量信息是基于绝对定量。在一些实施方案中，所述定量信息是基于半定量。在一些实施方案中，所述定量信息是基于相对定量。

在一些实施方案中，所述质谱图谱包括包含结构信息的数据组分。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括翻译后修饰，包括内源性发生和在样品制备期间发生的修饰。

在一些实施方案中，所述质谱图谱还包括包含理论信息的数据组分。在一些实施方案中，所述理论信息是基于从任何方法获得的已知信息，所述方法包括但不限于质谱技术。例如，参考质谱图谱可以包括基于蛋白质或肽的已知序列的理论MS离子信息。

在一些实施方案中，本申请所公开的方法设想了包括至少一种数据组分的质谱图谱，其中所述至少一种数据组分包括一个或多个数据点。在一些实施方案中，其中质谱图谱包括两种或更多种数据组分，所述两种或更多种数据组分可以包括来自通过质谱技术采集的数据的很多信息性水平的信息，例如肽鉴定信息及其定量信息。本文公开的质谱图谱不限于通过一种质谱分析和/或技术获得的信息。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括平均或组合信息，其中所述平均或组合信息包括来自两种或更多种质谱分析和/或技术的数据。

在一些实施方案中，本申请中公开的方法设想了质谱图谱(如参考质谱图谱或测试质谱图谱)的产生和/或使用，其解释了跨越多个质谱图谱或质谱分析或者在一种或多种分析的样品(如多种测试工程化细胞组合物)中一个或多个数据组分的变异性或变化。例如，本领域普通技术人员将容易理解的是，对同一样品的两次或更多次质谱分析可产生具有一些变异性的数据，包括所测量的色谱洗脱时间、m/z值、相对强度或丰度值以及相关或所得测量值(如质量和AUC)的差异。在一些实施方案中，所述质谱图谱(例如参考质谱图谱或测试质谱图谱)是两次或更多次质谱分析的平均值。此外，在一些实施方案中，可能需要编译来自两次或更多次质谱分析的两个或更多个质谱图谱或数据的至少一部分，以产生用于本文所述的方法中的质谱图谱，如参考质谱图谱。用于由来自两次或更多次质谱分析的两个或更多个质谱图谱或数据产生质谱图谱(如参考质谱图谱或测试质谱图谱)的方法是本领域已知的，并且包括例如可用的蛋白质组学软件。

在一些实施方案中，所测量种类(如肽或蛋白质，包括其翻译后修饰)的m/z值在质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量m/z值变化是由于质谱仪或跨越不同质谱仪进行的测量中的波动。

在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的相对强度或丰度值在同一样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的相对强度或丰度值在来自同一细胞组合物的多个样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的相对强度或丰度值在来自多个细胞组合物的样品的质谱图谱或分析之间变化。

在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的曲线下面积(AUC)值在同一样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的AUC值在来自同一细胞组合物的多个样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的AUC值在来自多个细胞组合物的样品的质谱图谱或分析之间变化。

在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的洗脱时间在同一样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的洗脱时间在来自同一细胞组合物的多个样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的洗脱时间在来自多个细胞组合物的样品的质谱图谱或分析之间变化。

在一些实施方案中，所述质谱图谱(如参考质谱图谱或测试质谱图谱)基于跨越多个质谱图谱或分析的一个或多个数据组分来构建。在一些实施方案中，每种数据组分包括一个或多个MS离子信号峰。

在一些实施方案中，所述质谱图谱(如参考质谱图谱或测试质谱图谱)是平均质谱图谱。在一些实施方案中，所述平均质谱图谱包括跨越多个质谱图谱或分析的所测量种类(例如肽)的平均强度值。在一些实施方案中，所述平均质谱图谱包括跨越多个质谱图谱或分析的所测量种类(例如肽)的平均AUC值。在一些实施方案中，所述平均质谱图谱包括跨越多个质谱图谱或分析的所测量种类(例如肽)的平均洗脱时间。在一些实施方案中，所述平均质谱图谱包括跨越多个质谱图谱或分析的所测量种类(例如肽)的平均m/z。确定平均数据组分的示例性方法包括但不限于获取原始数据组分、归一化数据组分或预加工数据组分的存在、不存在或水平的均值、中值、加权平均值或模式。

在一些实施方案中，所述参考质谱图谱还包括来自跨越多个质谱图谱的所有MS离子信号峰的未平均强度值。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱还包括跨越多个质谱图谱的所有MS离子信号峰的未平均AUC值。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱包括跨越多个质谱图谱的所有MS离子信号峰的未平均洗脱时间。

本文公开的质谱图谱可以从多种细胞样品获得，所述细胞样品又可以以很多不同方式制备并通过质谱技术分析。在一些实施方案中，所述质谱图谱包括数据组分，所述数据组分包括从包含蛋白质的样品获得的信息，其中使用至少两种不同样品制备技术制备所述样品的至少两个等分试样以用于通过一种或多种质谱技术进行分析。鉴于本公开文本，本领域技术人员将容易地认识到可以构成质谱图谱的广泛范围，并且本申请的公开文本不限于本文提供的示例性描述。

本申请公开的方法设想了从例如测试样品和参考样品获得的质谱图谱。在一些实施方案中，所述质谱图谱是测试质谱图谱，其中所述测试质谱图谱是来自测试工程化细胞组合物的样品的质谱图谱。在一些实施方案中，所述质谱图谱是测试质谱图谱，其中所述测试质谱图谱是来自测试工程化细胞组合物的样品的质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞。在一些实施方案中，所述质谱图谱是测试质谱图谱，其中所述测试质谱图谱包括含有来自测试工程化细胞组合物的样品的信息的一种或多种数据组分。在一些实施方案中，所述质谱图谱是测试质谱图谱，其中所述测试质谱图谱包括含有来自测试工程化细胞组合物的样品的信息的一种或多种数据组分，所述测试工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞。在一些实施方案中，所述测试质谱图谱包括含有来自一次或多次质谱分析的信息的一种或多种数据组分，其中所述一次或多次质谱分析是相同或不同的。在一些实施方案中，所述测试质谱图谱包括含有来自一次或多次质谱分析的信息的一种或多种数据组分，其中所述一次或多次质谱分析是使用一种或多种不同样品制备技术制备的样品的质谱分析。在一些实施方案中，所述测试质谱图谱包括含有来自一次或多次质谱分析的信息的一种或多种数据组分，其中所述一次或多次质谱分析是相同或不同的，并且其中所述一次或多次质谱分析是使用一种或多种不同的样品制备技术制备的样品的质谱分析。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用质谱技术测定来自测试工程化细胞组合物的样品的测试质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用质谱技术获得来自测试工程化细胞组合物的样品的测试质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞。

在一些实施方案中，质谱图谱是参考质谱图谱。在一些实施方案中，所述质谱图谱是参考质谱图谱，其中参考质谱图谱是来自参考细胞组合物的样品的质谱图谱。在一些实施方案中，所述质谱图谱是参考质谱图谱，其中所述参考质谱图谱是来自参考细胞组合物的样品的质谱图谱，所述参考细胞组合物包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述质谱图谱是参考质谱图谱，其中所述参考质谱图谱是来自参考细胞组合物的样品的质谱图谱，所述参考细胞组合物包含在用重组受体转染之前的免疫细胞。

在一些实施方案中，所述质谱图谱是参考质谱图谱，其中所述参考质谱图谱包括含有来自参考细胞组合物的样品的信息的一种或多种数据组分。在一些实施方案中，所述质谱图谱是参考质谱图谱，其中所述参考质谱图谱包括含有来自参考细胞组合物的样品的信息的一种或多种数据组分，所述参考细胞组合物包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述质谱图谱是参考质谱图谱，其中所述参考质谱图谱包括含有来自参考细胞组合物的样品的信息的一种或多种数据组分，所述参考细胞组合物包含在用重组受体转染之前的免疫细胞。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱包括含有来自一次或多次质谱分析的信息的一种或多种数据组分，其中所述一次或多次质谱分析是相同或不同的。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱包括含有来自一次或多次质谱分析的信息的一种或多种数据组分，其中所述一次或多次质谱分析是使用一种或多种不同样品制备技术制备的样品的质谱分析。在一些实施方案中，所述参考质谱图谱包括含有来自一次或多次质谱分析的信息的一种或多种数据组分，其中所述一次或多次质谱分析是相同或不同的，并且其中所述一次或多次质谱分析是使用一种或多种不同的样品制备技术制备的样品的质谱分析。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用质谱技术测定来自参考工程化细胞组合物的样品的参考质谱图谱，所述参考工程化细胞组合物包含免疫细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用质谱技术获得来自参考工程化细胞组合物的样品的参考质谱图谱，所述参考工程化细胞组合物包含免疫细胞。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用质谱技术测定来自参考工程化细胞组合物的样品的参考质谱图谱，所述参考工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用质谱技术获得来自参考工程化细胞组合物的样品的参考质谱图谱，其中参考工程化细胞组合物含有或富集了表达重组受体的免疫细胞，或其中此类免疫细胞含有编码重组受体的异源多核苷酸。

B.比较质谱图谱

在一些实施方案中，本文公开的方法包括比较质谱图谱。在一些实施方案中，本文公开的方法包括比较一种或多种测试质谱图谱。在一些实施方案中，本文公开的方法包括比较一种或多种参考质谱图谱。在一些实施方案中，本文公开的方法包括将测试质谱图谱与参考质谱图谱进行比较。在一些实施方案中，本文公开的方法包括将一种或多种测试质谱图谱与一种或多种参考质谱图谱进行比较。

在一些实施方案中，所提供的比较细胞组合物之间和之中的质谱图谱的方法可用于阐明：工程化细胞组合物的特征或特性(包括重组受体或其一部分或组分的特征和特性)，其可能与用于产生工程化细胞组合物的特定过程有关或与之相关；某些孵育或培养条件(包括某些试剂的存在或不存在)的影响；在刺激、工程化(例如，转导)或重组受体依赖性激活后(如暴露于抗原或抗独特型抗体后)所述工程化细胞组合物的变化或改变。在一些方面，此类方法可用于鉴定功能性细胞杠杆，其可提供信息或促进用于产生工程化细胞组合物的过程。在一些方面，与用于评估表征细胞蛋白的现有方法(如流式细胞术和基于转录组的分析方法)相比，所提供的方法更强大和/或提供正交信息。例如，本文公开的基于质谱的方法能够提供以无偏差的方式(例如，没有先前的目标假设)在至少以下方面同时对细胞样品进行谱分析的能力：肽和蛋白质表达、测序信息、定量、细胞定位(例如，通过选择的样品制备技术，如细胞表面蛋白的分离)和翻译后修饰。

因此，在一些实施方案中，本文所述的方法的实用性可依赖于第一质谱图谱和第二质谱图谱(如测试质谱图谱和参考质谱图谱)，其能够提供有科学意义的比较，例如蛋白质或肽的存在和/或丰度方面的差异。在一些实施方案中，因此，质谱图谱的产生将需要样品设计和/或制备技术的选择和/或质谱技术，使得第一样品的第一质谱图谱和第二样品的第二质谱图谱可以包含可归因于单个蛋白质和/或肽(如果所述单个蛋白质和/或肽存在于所述第一样品和所述第二样品中的话)的部分或全部重叠的数据组分。例如，在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用相同或相似的样品制备技术和相同或相似的质谱技术分析来自第一细胞组合物的第一样品和来自第二细胞组合物的第二样品，以产生第一样品的第一质谱图谱和第二样品的第二质谱图谱，从而允许比较所述第一质谱图谱和所述第二质谱图谱。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括鉴定与参考质谱图谱相比，在测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，从而鉴定包含重组受体的细胞组合物的质谱图谱。如贯穿本申请所述，在质谱图谱内包括的至少一种数据组分包括从单个或一系列质谱分析获得的任何单个信息性数据段或信息性数据的任何组合，包括来自所采集的MS信号数据的任何后续分析以及由此得到的信息的任何数据段。因此，例如，质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异可以包括以下方面的差异：MS离子信息、总离子色谱仪(TIC)或其一部分、提取离子色谱图(XIC)或其一部分、肽MS离子信号峰、蛋白质MS离子信号峰、肽鉴定信息(如肽序列的差异)、蛋白质鉴定信息、定性信息、定量信息、结构信息和翻译后修饰。

在一些实施方案中，本申请公开的方法设想计算跨越多个质谱图谱或质谱分析或者在一个或多个所分析样品(如多个测试工程化细胞组合物)中的一个或多个数据组分的变异性或变化的量。例如，本领域普通技术人员将容易理解的是，对同一样品的两次或更多次质谱分析可产生具有一些变异性的数据，包括所测量的色谱洗脱时间、m/z值、相对强度或丰度值以及相关或所得测量值(如质量和AUC)的差异。

在一些实施方案中，所测量种类(如肽或蛋白质，包括其翻译后修饰)的m/z值在质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量m/z值变化是由于质谱仪或跨越不同质谱仪进行的测量中的波动。在一些实施方案中，计算所测量种类(例如，肽)的所测量m/z值的变异性或变化的量。

在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的相对强度或丰度值在同一样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的相对强度或丰度值在来自同一细胞组合物的多个样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的相对强度或丰度值在来自多个细胞组合物的样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，计算所测量种类(例如，肽)的相对强度或丰度值的变异性或变化的量。

在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的曲线下面积(AUC)值在同一样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的AUC值在来自同一细胞组合物的多个样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的AUC值在来自多个细胞组合物的样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，计算所测量种类(例如，肽)的AUC值的变异性或变化的量。

在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的洗脱时间在同一样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的洗脱时间在来自同一细胞组合物的多个样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，所测量种类(例如，肽)的洗脱时间在来自多个细胞组合物的样品的质谱图谱或分析之间变化。在一些实施方案中，计算所测量种类(例如肽)的洗脱时间的变异性或变化的量。

确定跨越数据组分的变异性的量的示例性方法包括但不限于获取原始数据组分、归一化数据组分或预加工数据组分的水平的标准偏差、范围或四分位范围，或获取原始数据组分、归一化数据组分或预加工数据组分的存在或不存在的概率或比例。

C.质谱技术

本申请设想了多种质谱技术，其适用于与本文公开的方法和方法步骤(包括确定质谱图谱)一起使用。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用一种或多种质谱技术分析来自测试工程化细胞组合物的样品。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用一种或多种质谱技术分析来自参考细胞组合物的样品。如本文所讨论的，在一些实施方案中，质谱技术可以采集提供关于样品的大量信息的数据，包括MS离子信息、肽和/或蛋白质鉴定/序列信息、翻译后修饰信息和定量信息的任何组合的数据组分。进而例如使用由质谱仪技术采集的数据组分或多个数据组分来产生质谱图谱。在本部分以及贯穿本申请例示的以下质谱技术是可用于产生质谱图谱的质谱技术的示例性技术。然而，本文公开的方法不限于本文公开的质谱技术。鉴于本文的公开内容，本领域普通技术人员将理解可用于本文公开的方法的质谱技术的程度。

在一些实施方案中，所述质谱技术包括液相色谱质谱技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括液相色谱串联质谱技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括液相色谱技术。

本申请设想了适于本文公开的方法的多种液相色谱技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括适于蛋白质组学应用的液相色谱技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括适于分离肽的液相色谱技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括通过液相色谱技术分离肽。

本申请设想的液相色谱技术包括用于分离肽的方法和与质谱技术兼容的液相色谱技术。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括高效液相色谱技术。因此，在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括超高效液相色谱技术。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括高流(high-flow)液相色谱技术。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括低流(low-flow)液相色谱技术，如微流(micro-flow)液相色谱技术或纳流(nano-flow)液相色谱技术。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括与质谱仪耦合的联机液相色谱技术。在一些实施方案中，所述联机液相色谱技术是高效液相色谱技术。在一些实施方案中，所述联机液相色谱技术是超高效液相色谱技术。

本文设想的液相色谱技术包括使用液相色谱仪。在一些实施方案中，所述液相色谱仪包括高效液相色谱仪。在一些实施方案中，所述液相色谱仪包括超高效液相色谱仪。在一些实施方案中，所述液相色谱仪包括高流液相色谱仪。在一些实施方案中，所述液相色谱仪包括低流液相色谱仪，如微流液相色谱仪或纳米流量液相色谱仪。在一些实施方案中，所述液相色谱仪包括与质谱仪耦合的联机液相色谱仪。在一些实施方案中，所述液相色谱仪包括联机高效液相色谱仪，其中所述联机高效液相色谱仪与质谱仪耦合。在一些实施方案中，所述液相色谱仪包括联机超高效液相色谱仪，其中所述联机超高效液相色谱仪与质谱仪耦合。

设想用于本申请公开的方法中的液相色谱技术和液相色谱仪适于使用色谱柱分离包含蛋白质混合物和/或肽混合物的样品，之后将所述样品引入质谱仪中。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括反相液相色谱技术。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括正相液相色谱技术。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括尺寸排阻液相色谱技术。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括高效阴离子交换色谱技术。在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括亲水相互作用色谱技术。

在一些实施方案中，所述液相色谱技术包括毛细管电泳(CE)技术。

在一些实施方案中，所述质谱技术包括自动进样器技术。在一些实施方案中，所述液相色谱仪与自动进样器耦合。

在一些实施方案中，所述质谱技术包括电离技术。本申请设想的电离技术包括能够使蛋白质和肽带电以通过质谱仪进行分析的技术。在一些实施方案中，所述电离技术是电喷雾电离(ESI)。在一些实施方案中，所述电离技术是纳米电喷雾电离(nESI)。在一些实施方案中，所述电离技术是大气压化学电离。在一些实施方案中，所述电离技术是大气压光电离。在某些实施方案中，所述电离技术是基质辅助激光解吸电离(MALDI)。在一些实施方案中，所述质谱技术包括电喷雾电离、纳米电喷雾电离或基质辅助激光解吸电离(MALDI)技术。

本文公开的质谱技术包括用质谱仪系统分析包含蛋白质混合物和/或肽混合物的样品。设想与本文公开的方法一起使用的质谱仪系统包括高分辨质谱仪、低分辨质谱仪及其任何组合的混合体以及与之相关的技术。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括离子阱。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括四极杆离子阱。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括轨道阱。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括四极杆轨道阱。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括飞行时间(TOF)质谱仪。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括四极杆离子阱飞行时间(QIT-TOF)质谱仪。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括三重四极杆(QQQ)。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括傅里叶变换离子回旋共振(FT)质谱仪。在一些实施方案中，所述质谱仪系统包括四极杆傅里叶变换离子回旋共振(Q-FT)质谱仪。

在一些实施方案中，所述质谱仪系统与液相色谱仪(如联机液相色谱仪)耦合。在一些实施方案中，所述质谱仪系统与液相色谱仪和自动进样器耦合。

在一些实施方案中，所述质谱技术包括正离子模式技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括负离子模式技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括飞行时间(TOF)质谱技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括离子迁移质谱技术。在一些实施方案中，低分辨质谱技术(如离子阱或单个四极杆或三重四极杆方法)是合适的。

在一些实施方案中，所述质谱技术包括以120,000扫描分辨率执行MS

在一些实施方案中，所述质谱技术包括串联质谱技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括数据依赖性采集技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括数据独立性采集技术。在一些实施方案中，所述质谱技术包括靶向质谱采集技术，包括选择性离子监测(SIM)、选择性反应监测(SRM)和多反应监测(MRM)。

在一些实施方案中，所述质谱技术是定量质谱技术。在一些实施方案中，所述定量质谱技术是绝对定量技术，如SRM或MRM。在一些实施方案中，所述定量质谱技术是半定量技术，如基于标记的定量方法。在一些实施方案中，所述定量质谱技术是相对定量技术，如光谱计数。在一些实施方案中，所述定量质谱技术是基于标记的定量技术。在一些实施方案中，所述定量质谱技术是无标记定量技术。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括加工通过质谱技术采集的数据。在一些实施方案中，所述质谱技术包括加工获得的肽或蛋白质的MS离子信号。在一些实施方案中，所述质谱技术包括峰检测。在一些实施方案中，所述质谱技术包括确定肽离子的电离强度。在一些实施方案中，所述质谱技术包括确定肽离子的峰高。在一些实施方案中，所述质谱技术包括确定肽离子的MS信号的峰面积。在一些实施方案中，所述质谱技术包括确定肽和/或蛋白质的峰体积。在一些实施方案中，所述质谱技术包括定量肽离子和/或蛋白质离子。在一些实施方案中，所述质谱技术包括定量肽和/或蛋白质。在一些实施方案中，所述质谱技术包括例如经由蛋白质组学软件鉴定肽和/或蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述蛋白质组学软件使用生物体的基因或蛋白质序列的已知数据库(如人或小鼠蛋白质数据库)来鉴定肽和/或蛋白质序列。在一些实施方案中，所述蛋白质组学软件从头鉴定肽和/或蛋白质序列。在一些实施方案中，所述质谱技术包括手动验证肽和/或蛋白质的鉴定。在一些实施方案中，所述质谱技术包括经由光谱文库鉴定肽和/或蛋白质。通常，光谱文库的使用允许填补(imputation)获得的有关肽和/或蛋白质系统的知识，并且导致数据分析速度提高和误差减少。

D.样品制备技术

在本发明的一些方面中，本文公开的方法包括执行样品制备技术。通常，细胞样品可能需要进行加工以与质谱技术具有兼容性，所述加工包括蛋白质/肽分离、洗涤剂的去除、任何阶段的样品的浓缩/汇集和/或蛋白水解消化。在一些实施方案中，所述样品制备技术包括多肽分离技术。在一些实施方案中，所述多肽分离技术将细胞蛋白质组的子集(例如，细胞表面蛋白)与其他细胞组分分离。在一些实施方案中，所述多肽分离技术将所述细胞蛋白质组与其他细胞组分分离(例如，用于全细胞蛋白质组分析)。在一些实施方案中所述，所述样品制备技术包括多肽加工技术。在本文公开的方法的一些实施方案中，所述方法包括获得与质谱技术兼容的样品。

1.多肽分离技术

在一些实施方案中，本文公开的方法提供多肽分离技术，其中所述多肽分离技术适于将细胞蛋白质组的子集与其他细胞组分分离。在一些实施方案中，本文公开的方法包括多肽分离技术，其中执行所述多肽分离技术将重组受体与其他细胞组分分离。在一些实施方案中，本文公开的方法包括多肽分离技术，其中执行所述多肽分离技术将跨膜蛋白与其他细胞组分分离。在一些实施方案中，本文公开的方法包括多肽分离技术，其中执行所述多肽分离技术将细胞表面蛋白与其他细胞组分分离。在一些实施方案中，本文公开的方法包括多肽分离技术，其中执行所述多肽分离技术将嵌合抗原受体(CAR)与其他细胞组分分离。

在一些实施方案中，所述多肽分离技术包括：(a)标记存在于来自细胞组合物样品的样品中的一种或多种蛋白质，从而产生标记的细胞组合物样品；(b)使所述标记的细胞组合物样品的细胞裂解，从而产生裂解的细胞组合物样品；以及(c)从裂解的细胞组合物分离一种或多种蛋白质，以获得一种或多种分离的蛋白质。在一些实施方案中，所述多肽分离技术包括：(a)标记存在于工程化细胞组合物样品的细胞上的一种或多种细胞表面蛋白，所述工程化细胞组合物样品的细胞包含重组受体，从而产生标记的细胞组合物样品；(b)使所述标记的细胞组合物样品的细胞裂解，从而产生裂解的细胞组合物样品；以及(c)从所述裂解的细胞组合物样品分离所述一种或多种细胞表面蛋白，以获得一种或多种分离的蛋白质。

在一些实施方案中，使细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育。在一些实施方案中，所述洗涤剂是非离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂、阳离子型洗涤剂或两性离子型洗涤剂。示例性洗涤剂包括但不限于麦芽糖苷、硫代麦芽糖苷、烷基糖苷和二醇。示例性洗涤剂包括但不限于正癸基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正十一烷基-β-D-麦芽糖苷、Cymal-5、Cymal-6、正十二烷基-β-D-硫代吡喃糖苷、辛基葡萄糖、新戊二醇、聚氧乙烯、Triton X-100、Triton X-114、C8E4、C8E5、C12E8、anapoe-35(Brij-35)、anapoe-58(Brij-58)、N-40、Tween 20、Tween 80、乙基三甲基溴化铵、辛基葡萄糖苷和辛基硫代葡萄糖苷。

在一些实施方案中，使细胞裂解包括在非离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂、阳离子型洗涤剂、两性离子型洗涤剂或其两种或更多种洗涤剂的任何组合的存在下孵育。

在一些实施方案中，使细胞裂解包括在变性洗涤剂的存在下孵育。在一些实施方案中，所述变性洗涤剂是阴离子型洗涤剂或阳离子型洗涤剂。示例性变性洗涤剂包括但不限于十二烷基硫酸钠和乙基三甲基溴化铵。在一些实施方案中，所述变性洗涤剂是或包含十二烷基硫酸钠(SDS)。

在一些实施方案中，使细胞裂解包括在非变性洗涤剂的存在下孵育。在一些实施方案中，所述非变性洗涤剂是非离子型洗涤剂或两性离子型洗涤剂。示例性非变性洗涤剂包括但不限于Triton X-100、胆汁盐(如胆酸盐)和CHAPS。

在一些实施方案中，所述洗涤剂是质谱兼容性洗涤剂。

在一些实施方案中，使细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育，其中洗涤剂的浓度为约0.1％至约5％，如约0.1％至约4.5％、约0.1％至约4％、约0.5％至约3％、约0.5％至约2.5％、约0.5％至约2％、约0.5％至约1.5％、约0.8％至约1.2％或约0.9％至约1.1％中的任一种。在一些实施方案中，使细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育，其中洗涤剂的浓度小于约5％，如小于4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或0.5％中的任一种。在一些实施方案中，使细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育，其中洗涤剂的浓度大于约0.5％，如大于约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％中的任一种。在一些实施方案中，使细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育，其中洗涤剂的浓度为约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。

在一些实施方案中，标记所述表面蛋白包括用亲和剂或亲和柄标记。在一些实施方案中，标记所述表面蛋白包括用亲和剂或亲和柄标记，其中亲和剂或亲和柄是细胞不可渗透的。在一些实施方案中，标记所述表面蛋白包括生物素标记。在一些实施方案中，标记所述表面蛋白包括对伯胺进行生物素标记。在一些实施方案中，标记所述表面蛋白包括用点击化学试剂标记。

在一些实施方案中，使用包含亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin

在一些实施方案中，所述多肽分离技术将所述细胞蛋白质组与其他细胞组分分离(例如，用于全细胞蛋白质组分析)。

在一些实施方案中，多肽分离技术还包括多肽纯化步骤，所述步骤包括从样品中去除与质谱技术不兼容的物质，例如表面活性剂或洗涤剂。

2.多肽加工技术

在一些实施方案中，本文公开的方法包括进行多肽加工技术。通常，在多肽分离技术之后，多肽样品可能需要进行加工以与质谱技术具有兼容性，所述加工包括溶剂修饰、蛋白水解消化和/或浓缩。此类多肽分离技术为本领域中熟知的，并且设想与本公开的方法一起使用。本文提供了示例性多肽加工技术，本发明的方法不应限于此。

在一些实施方案中，所述多肽加工技术是全蛋白质加工技术。在一些实施方案中，所述全蛋白质加工技术包括修饰或调节多肽样品的溶剂。在一些实施方案中，所述全蛋白质加工技术包括浓缩多肽样品。在一些实施方案中，所述全蛋白质加工技术包括使多肽样品中的蛋白质变性。在一些实施方案中，所述全蛋白质加工技术包括纯化多肽样品中的蛋白质。在一些实施方案中，修饰或调节多肽样品的溶剂，例如向多肽样品中添加酸，如三氟乙酸或甲酸。

在一些实施方案中，所述多肽加工技术是基于消化的多肽加工技术。在一些实施方案中，所述基于消化的多肽加工技术包括使多肽样品中的蛋白质变性。在一些实施方案中，所述基于消化的多肽加工技术包括修饰或调节多肽样品的溶剂。在一些实施方案中，所述基于消化的多肽加工技术包括向多肽样品中添加还原剂和/或氨基酸调节剂，例如碘乙酰胺。在一些实施方案中，所述基于消化的多肽加工技术包括多肽消化技术，例如通过蛋白水解和/或化学消化。在一些实施方案中，所述多肽消化技术包括使用蛋白酶的酶消化。在一些实施方案中，所述蛋白酶是以下中的一种或多种；胰蛋白酶、Lys-C、IdeS、IdeZ、PNG酶F、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、arg-c、TEV、Glu-C、Asp-N和因子Xa。在一些实施方案中，样品消化包括化学消化，如酸水解。在一些实施方案中，所述基于消化的多肽加工技术包括使多肽样品脱盐。在一些实施方案中，所述基于消化的多肽加工技术包括浓缩多肽样品。在一些实施方案中，所述基于消化的多肽加工技术包括纯化多肽样品中的肽。在一些实施方案中，修饰或调节多肽样品的溶剂，例如向多肽样品中添加酸，如三氟乙酸或甲酸。

在一些实施方案中，所述多肽样品被分成第一等分试样和第二等分试样，其中使用第一多肽加工技术加工所述第一等分试样，其中使用第二多肽加工技术加工所述第二等分试样，并且其中所述第一多肽加工技术和所述第二多肽加工技术是相同的。在一些实施方案中，所述多肽样品被分成第一等分试样和第二等分试样，其中使用第一多肽加工技术加工所述第一等分试样，其中使用第二多肽加工技术加工所述第二等分试样，并且其中所述第一多肽加工技术和所述第二多肽加工技术是不同的。

E.测量聚糖

在特定实施方案中，可以通过检测细胞表面上N-聚糖的存在来评估、分析或确定酶(例如，糖基转移酶)表达的变化或差异。在某些方面，所述聚糖通过翻译后修饰附着至蛋白质，例如以产生糖蛋白或蛋白聚糖。通常，聚糖发现于细胞的外表面上，如与表面蛋白缀合。在一些方面，聚糖含有寡糖或糖苷连接的大量单糖。

特定实施方案设想的是，由于特定聚糖种类通过特定酶(例如，特定糖基转移酶)与蛋白质缀合，因此一种或多种特定聚糖的存在、不存在、水平或量的检测指示具有相应活性(例如，作为翻译后修饰的特定聚糖与蛋白质的缀合)的特定酶(例如，特定糖基转移酶)的存在、不存在、水平、量或活性。在一些实施方案中，通过添加特定聚糖对蛋白质进行的翻译后修饰是由特定糖基转移酶介导的。此类糖基转移酶包括但不限于由基因MGAT1、MGAT2、MGAT3、MGAT4A、MGAT4B、MGAT5和MGAT5B编码的那些。在一些实施方案中，存在于细胞表面上的聚糖(例如，N-聚糖)的存在、不存在、水平或量被检测或测量为一种或多种糖基转移酶的存在、不存在、水平或量的读出。在特定实施方案中，存在于细胞表面上的聚糖(例如N-聚糖)的存在、不存在、水平或量被检测或测量为由MGAT1、MGAT2、MGAT3、MGAT4A、MGAT4B、MGAT5或MGAT5B编码的一种或多种糖基转移酶的存在、不存在、水平或量的读出。

在某些实施方案中，可以通过能够鉴定和/或定量单独的聚糖种类的量的技术来进行聚糖的检测。在某些实施方案中，一个聚糖种类包括具有与其他聚糖种类结构不同的相同结构的聚糖。在特定实施方案中，所述技术是质谱技术和/或液相色谱(LC)技术，如高效液相色谱法(HPLC)或超效液相色谱法(UPLC)。在一些实施方案中，使用本文(例如，在第I部分中)提供的任何合适的技术检测聚糖。

在某些实施方案中，在适合于从组合物的细胞表面去除、释放或脱离聚糖(例如N-聚糖)的条件下孵育、培养或处理细胞的组合物。在某些实施方案中，将细胞的组合物用药剂处理、与药剂一起孵育和/或与药剂接触以从细胞表面去除、分开或脱离聚糖(例如N-聚糖)。在特定实施方案中，所述细胞是完整的，即在用药剂处理之前细胞不被裂解或均质化。在某些实施方案中，所述细胞是活细胞。在一些实施方案中，用药剂处理细胞、将细胞与药剂一起孵育和/或使细胞与药剂接触不破坏细胞膜和/或使细胞膜破裂。在一些实施方案中，所述细胞是活细胞，并且用药剂处理细胞、将细胞与药剂一起孵育和/或使细胞与药剂接触不会杀死细胞。在某些实施方案中，所述细胞是活细胞，并且用药剂处理细胞、将细胞与药剂一起孵育和/或使细胞与药剂接触不诱导细胞死亡，例如细胞的凋亡或坏死。

在一些实施方案中，将细胞组合物用药剂(如N-糖苷酶，例如PNG酶F)处理、与其一起孵育和/或与其接触，导致聚糖(例如，N-聚糖)从表面暴露的糖缀合物中去除、分开和/或脱离。在一些实施方案中，所述糖缀合物是蛋白质，例如糖蛋白。在特定实施方案中，将细胞组合物用药剂处理、与药剂接触和/或与药剂一起孵育导致聚糖从表面暴露的蛋白质中去除、分开和/或脱离。在特定实施方案中，释放的、去除的和/或脱离的N-聚糖是完整的。在一些实施方案中，所述聚糖从表面暴露的蛋白质中去除、分开和/或脱离不损害、消化和/或以其他方式改变聚糖的结构。在特定实施方案中，所述聚糖从表面暴露的蛋白质中去除、分开和/或脱离不损害、消化和/或以其他方式改变已经释放聚糖的部分(例如蛋白质)的结构。在一些实施方案中，所述聚糖从表面暴露的蛋白质中去除、分开和/或脱离导致天冬酰胺转化为天冬氨酸，但不以其他方式损害、消化和/或改变已经释放聚糖的蛋白质的结构。

在一些实施方案中，所述药剂是促进聚糖(例如N-聚糖)从糖缀合物(例如糖蛋白)中去除、分开和/或脱离的任何药剂。在某些实施方案中，所述药剂从糖缀合物中化学地去除聚糖，例如但不限于肼解或碱性β-消除。

在某些实施方案中，所述药剂是酶。在特定实施方案中，所述药剂是从糖缀合物中特异性去除、分开和/或脱离N-或O-连接型聚糖的酶。在某些实施方案中，所述药剂是酰胺酶。在一些实施方案中，所述药剂是或包括糖苷酶，例如N-糖苷酶。在特定实施方案中，所述药剂是或包括内切糖苷酶H(Endo H)、内切糖苷酶F(EndoF)、N-糖苷酶A(PNG酶A)或N-糖苷酶F(PNG酶F)或其组合。在一些实施方案中，所述药剂是或包括肽-N4-(N-乙酰-β-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶类别的酰胺酶。在特定实施方案中，所述药剂是或包括PNG酶F。

在一些实施方案中，所述药剂是从具有N-连接型碳水化合物的蛋白质和肽中释放或能够释放全长寡糖的酶。在一些实施方案中，所述药剂是从具有N-连接型碳水化合物的蛋白质和肽中释放或能够释放全长寡糖的PNG酶F。在某些实施方案中，所述药剂不是或不包括内切糖苷酶，如Endo F、Endo H和Endo D。在一些实施方案中，内切糖苷酶(如Endo F、Endo H和Endo D)不从糖蛋白中释放全长寡糖和/或不切割所有常见类别的N-连接型寡糖。

在某些实施方案中，所述药剂不是蛋白酶。在一些实施方案中，所述药剂不包括蛋白酶。在特定实施方案中，所述药剂不是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬酰胺肽裂解酶。在某些实施方案中，所述药剂不是并且不包括内切肽酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶。在特定实施方案中，所述药剂不是并且不包括胰蛋白酶。

在特定实施方案中，在适合于从细胞表面去除、释放或脱离聚糖的条件下孵育包括将细胞与药剂接触、用药剂处理和/或与药剂一起孵育。在特定实施方案中，所述药剂是或包括PNG酶F。PNG酶F是肽-N4-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶类的酰胺酶。在一些实施方案中，PNG酶F是从天冬酰胺释放N-聚糖的细菌酶。在特定实施方案中，PNG酶F从天冬酰胺释放整个(即完整的)N-聚糖。在某些实施方案中，PNG酶F去除与天冬酰胺附着的寡甘露糖、杂合体和复合N-聚糖。在特定实施方案中，PNG酶F释放与天冬酰胺的氮附着的N-聚糖，从而将天冬酰胺转化为天冬氨酸。在某些实施方案中，所述切割发生在与天冬酰胺残基相邻的碳水化合物的位置。在特定实施方案中，所述药剂是或包括展现出肽-N-(N-乙酰-β-N-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶活性的酶。在某些实施方案中，将细胞组合物用药剂处理、与药剂接触或与药剂一起孵育，所述药剂是或包括PNG酶F。

在一些实施方案中，PNG酶F是重组PGN酶F。在某些实施方案中，PNG酶F是突变PNG酶F。在一些实施方案中，PNG酶F是从脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)克隆的重组PNG酶F。在特定实施方案中，PNG酶F是从脑膜炎脓毒性黄杆菌的整个PNG酶F基因克隆的。在某些实施方案中，脑膜炎脓毒性黄杆菌的整个PNG酶F基因是在Tarentino等人,Journal of Biological Chemistry,265(12):6961-6966(1990)中描述的PNG酶F基因。在特定实施方案中，整个PNG酶F基因是对指定为Uniprot登录号P21163.2的PNG酶F多肽进行编码的PNG酶F基因。在一些实施方案中，整个PNG酶F基因是对具有SEQID NO:61所示氨基酸序列的PNG酶F多肽进行编码的PNG酶F基因。

在特定实施方案中，所述药剂是或包括PNG酶F，所述PNG酶F由从整个PNG酶(其是来自脑膜炎脓毒性黄杆菌基因组的完整肽N-糖苷酶F(PNG酶F)基因)克隆、在T7表达载体pET 29-b(Novagen)和pQE-T7(Qiagen)中表达并纯化的多核苷酸产生。在某些实施方案中，编码PNG酶F的多核苷酸含有框内C末端组氨酸标签。在一些实施方案中，将编码PNG酶F HIS标记的构建体的多核苷酸转化到携带在lacUV5启动子控制下的T7 RNA聚合酶基因的细菌菌株BL21 Star(DE3)中，所述lacUV5启动子允许从T7表达载体(如pET和pQE)由异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)高水平地诱导表达基因产物。在特定实施方案中，进行细菌转化和细胞培养生长，通过离心收获细菌细胞，并用含有蛋白酶抑制剂(SigmaFast，不含EDTA)的缓冲液洗涤细胞沉淀。在特定实施方案中，使用Avestin C5高压均化器制备总细胞蛋白裂解物。在一些实施方案中，用于重组PNG酶F组氨酸标记的蛋白的FPLC纯化方法使用Ni-NTA(Qiagen)和IMAC HisTrap HP(GE Healthcare)柱。在一些实施方案中，将来自IPTG诱导培养物的细菌细胞裂解物加载到柱上，并使PNG酶F多肽与C末端His标签结合，并使用在结合缓冲液中的咪唑阶梯梯度进行洗涤和洗脱。在一些实施方案中，将具有C末端的纯化PNG酶F透析并在PBS缓冲液中储存。在特定实施方案中，药剂是或包括PNG酶，所述PNG酶是具有C末端His标签的重组PNG酶F或者是与通过在Powers等人Analytical Chemistry,85(20):9799-806(2013)中描述的方法生产的PNG酶F相同的PNG酶F。

在一些实施方案中，所述药剂是或包括PNG酶F，其是可商购的PNG酶F。可商购的PNG酶F包括但不限于PNG酶F蛋白质组学等级(目录号P 7367，Sigma)；PNG酶F(目录号P0704S和P0704L，New England Biolabs)、PNG酶F(目录号V4831，Promega)、N-GLYCANASE(目录号：GKE-5006A、GKE-5006B、GKE-5006D、GKE-5016A、GKE-5016B、GKE-5016D、GKE-5010B、GKE-5016D、GKE-5020B、GKE-5020D和GKE-5003，ProZyme)和PNG酶F(目录号：E-PNG01，QABio)、RAPID PNG酶F(目录号P0710S，New England Biolabs)、PNG酶F PRIME(N-Zyme Scientifics)。在某些实施方案中，PNG酶F是PNG酶F PRIME(N-Zyme Scientifics)或与其相同。

在特定实施方案中，将细胞从含有释放的表面聚糖的样品、溶液或培养基中去除。在某些实施方案中，将聚糖从培养基或溶液中去除和/或分开。在一些实施方案中，将溶液或培养基蒸发。在特定实施方案中，通过真空离心(例如用speedvac)将溶液或培养基蒸发。在特定实施方案中，将聚糖从培养基或溶液中去除和/或分开，然后重悬。在一些实施方案中，可以将聚糖重悬于一定体积的缓冲液或溶液中。在一些实施方案中，所述缓冲液或溶液适于储存。在某些实施方案中，所述缓冲液适合与用于检测、鉴定和/或检测聚糖的技术一起使用。在某些实施方案中，所述缓冲液或溶液适合用于化学反应，例如衍生反应，例如添加可检测的标记。

在某些实施方案中，将聚糖(例如N-聚糖)修饰以改善和/或增强对聚糖的检测。在许多情形中，由于不存在可通过液相色谱和/或质谱检测到的强发色团或荧光团或活性部分，聚糖可能不容易被检测到。在一些实施方案中，聚糖的吸光度和荧光反应可能相对较弱或低于检测的阈值。在一些实施方案中，使测定的灵敏度最大化的一种策略是将目的化合物(即聚糖)转化为对所利用的特定检测方法展现出更好反应的衍生物。在某些实施方案中，所述衍生化药剂通过最大化衍生分子的灵敏度、产率和/或稳定性来影响(affect或influence)分析的最终灵敏度和准确性。因此，在一些实施方案中，在任何分析或检测程序之前将已经从细胞表面释放的聚糖(例如N-聚糖)衍生化。

在一些实施方案中，在通过HPLC和/或质谱分析之前将聚糖衍生化。在一些实施方案中，可以通过衍生化步骤来改善和/或增强通过现有技术(例如高效液相色谱(HPLC)和/或光谱或质谱(MS)检测)对N-聚糖检测的灵敏度。

在一些实施方案中，将聚糖(例如N-聚糖)衍生化以允许或改善通过质谱的检测。在某些实施方案中，将聚糖衍生化以允许聚糖更容易接受电荷。在某些实施方案中，能够接受电荷的聚糖和/或衍生聚糖可通过质谱仪检测。在一些实施方案中，通过添加氨基基团(例如叔氨基基团)将聚糖衍生化。

在一些实施方案中，所述衍生化是或包括将可检测标记添加至聚糖(例如N-聚糖)。在一些实施方案中，所述添加是共价附着。在某些实施方案中，与不含有附着的可检测标记的N-聚糖的检测相比，附着的可检测标记在N-聚糖的检测期间增加信号和/或降低背景噪声。在某些实施方案中，根据本公开文本可以使用多种可检测标记中的任何一种，包括但不限于荧光标记、放射性标记和/或化学发光标记。在某些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记。在某些实施方案中，所述荧光标记的附着(例如共价附着)不改变N-聚糖在柱(例如适于HPLC的柱)中的迁移。在特定实施方案中，所述标记是荧光标记，并且使聚糖与未标记的聚糖相比更容易接受电荷。

在一些实施方案中，通过本领域的标准技术进行N-聚糖的衍生化。许多N-聚糖衍生化技术在Ruhaak等人,Analytical and Bioanalytical Chemistry 397(8):3457–3481(2010)中进行了描述和综述。在一些实施方案中，所述衍生化通过包括两个或更多个反应步骤的化学反应进行。在一些实施方案中，通过反应还原胺化、过甲基化、迈克尔加成或酰肼标记进行衍生化。在某些实施方案中，可以使用为标记反应提供所需官能团的各种化合物。在某些实施方案中，通过使用单个反应步骤的化学反应进行衍生化。通过使用单个反应步骤的化学反应将标记添加至聚糖、适合于衍生化和/或将可检测标记共价附着至N-聚糖的标记剂包括含有与胺快速反应的官能团(如异氰酸酯或琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯)的药剂。此类标记剂和荧光标记描述于美国专利申请号US 20140242709中。

在某些实施方案中，通过还原胺化标记N-聚糖。在此反应中，含有伯胺基团的标记在缩合反应中与聚糖的醛基团反应，产生亚胺或希夫碱，其被还原剂还原以产生仲胺。在一些实施方案中，所述反应在含有乙酸、四氢呋喃或甲醇的二甲亚砜中进行。在一些实施方案中，还原胺化导致每个N-聚糖化学计量附着一个标记，从而允许基于荧光或UV-吸光度强度进行直接定量。

已经将各种标记用于聚糖的还原胺化。在一些实施方案中，将荧光标记添加到聚糖中，所述荧光标记是或包括2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基吡啶(PA)、2-氨基吖啶酮(AMAC)、2-氨基萘三磺酸(ANTS)、和1-氨基芘-3,6,8-三磺酸(APTS)、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)、6-氨基喹啉(6-AQ)、7-氨基甲基-香豆素(AMC)、2-氨基(6-酰胺基-生物素基)吡啶(BAP)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)-酰肼、1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基-苯(DMB)、或邻苯二胺(OPD)。

在特定实施方案中，将N-聚糖用可商购的标记进行标记。标记试剂盒可用于标签2-AB、2-AA和PA(Ludger)以及用于使用APTS(Beckmancoulter)和ANTS(Prozyme)进行标记。在一些实施方案中，所述标记剂和/或荧光标记是RapiFluor-MS(Waters TechnologiesCorporation)。

在一些实施方案中，所述标记剂含有荧光部分以及与胺快速反应的官能团(如异氰酸酯或琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯)。在一些实施方案中，所述标记剂含有叔氨基基团或其他MS活性原子、荧光部分、以及与胺快速反应的官能团(如异氰酸酯或琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯)中的一个或多个。

在特定实施方案中，制备含有聚糖的细胞外溶液的样品进行分析(例如质谱分析)。在一些实施方案中，在分析之前纯化聚糖(例如N-聚糖)的样品。在一些实施方案中，纯化包括能够将N-聚糖从任何实体分开的任何方法，所述实体将或将潜在地破坏、阻碍和/或削弱对N-聚糖的检测。在一些实施方案中，进行纯化步骤以从细胞碎片、去糖基化蛋白质、PNG酶F、缓冲液/配制品组分、表面活性剂、标记反应副产物、和/或过量的标记和/或衍生化试剂中去除N-聚糖。在特定实施方案中，在标记的聚糖(例如N-聚糖，例如具有共价附着的可检测标记的聚糖)上进行纯化步骤。在某些实施方案中，通过用于纯化聚糖的任何合适技术进行纯化，所述合适技术包括但不限于固相萃取(SPE)、液-液萃取、凝胶过滤、纸色谱、和沉淀。

在某些实施方案中，所述聚糖(例如，N聚糖)是通过质谱法来分析，如通过本文(例如在第I部分中)所述的任何合适的质谱技术来分析。在特定实施方案中，细胞组合物(例如，测试T细胞组合物)是通过从细胞表面去除聚糖、纯化聚糖和使其衍生化以及使用质谱技术(例如，LC-MS)测量聚糖来分析。在一些实施方案中，存在于细胞表面上的聚糖(例如，N-聚糖)的存在、不存在、水平或量被检测或测量为一种或多种糖基转移酶的存在、不存在、水平或量的读出。在特定实施方案中，检测或测量存在于细胞表面上的聚糖(例如，N-聚糖)的存在、不存在、水平或量，其与在样品中检测到(例如基因组技术如RNA-seq或使用测序的转座酶可及染色质测定(ATAC-seq))的一种或多种糖基转移酶的存在、不存在、水平或量相关。在特定实施方案中，存在于细胞表面上的聚糖(例如N-聚糖)的存在、不存在、水平或量被检测或测量为由MGAT1、MGAT2、MGAT3、MGAT4A、MGAT4B、MGAT5或MGAT5B编码的一种或多种糖基转移酶的存在、不存在、水平或量的读出。

II.细胞组合物

在一些实施方案中，本文提供的方法可用于通过鉴定细胞组合物的质谱图谱来确定、测量或评估细胞组合物的蛋白质(例如，表面蛋白)的存在、水平、量或表达。在一些实施方案中，通过本文(例如，在第I部分中)所述的任何提供的方法来鉴定质谱图谱。在某些实施方案中，所述方法是或包括质谱技术。在一些实施方案中，所提供的方法可以用于评估或分析一种或多种蛋白质在组合物细胞表面上的存在、不存在、量、水平和/或相对丰度。

在某些实施方案中，质谱图谱(例如，测试质谱图谱)由测试细胞组合物产生。在特定实施方案中，测试细胞组合物可以是任何细胞组合物，其中通过本文(例如，在第I部分中)提供的任何方法，如通过产生质谱图谱来测量或期望测量一种或多种标记、特征、特性、表型或属性。在一些实施方案中，所述测试组合物是哺乳动物细胞的组合物。特别地，所述测试组合物是人细胞的组合物。在特定实施方案中，所述测试细胞组合物是或含有适于基因工程化(例如，产生细胞疗法)的细胞，在用于基因工程化(例如，产生细胞疗法)期间收集，或已进行基因工程化(例如，含有基因工程化细胞的细胞疗法)。

在特定实施方案中，所述质谱图谱由测试细胞组合物(例如含有CAR T细胞的免疫细胞组合物)产生，以评估或评价蛋白质(例如表面蛋白)的水平、量或变化。在一些实施方案中，蛋白质(例如，表面蛋白)的水平、量或变化指示例如与活力、代谢活性、分化状态、增殖能力、激活状态或溶细胞活性中的一种或多种有关的细胞的功能和/或表型特征、特性或属性。

在一些实施方案中，所述测试细胞组合物是细胞疗法。在特定实施方案中，所述测试细胞组合物是细胞疗法，所述细胞疗法是用于施用于受试者(例如人受试者)的候选者。在某些实施方案中，所述测试细胞组合物是自体细胞疗法。在某些实施方案中，所述测试细胞组合物是免疫细胞疗法。在某些实施方案中，所述测试细胞组合物是自体CAR T细胞疗法。在一些实施方案中，所述测试细胞组合物是将被开发、加工或工程化成细胞疗法的细胞组合物。在特定实施方案中，所述测试细胞疗法是将被开发、加工或工程化成自体CAR T细胞疗法的细胞组合物。在某些实施方案中，所述测试细胞组合物是在产生细胞疗法或使其工程化的过程期间收集的细胞的组合物。在各种实施方案中，所述测试细胞组合物是在使自体T细胞疗法工程化的过程期间收集的细胞的组合物。

在一些实施方案中，所述测试细胞组合物是人细胞(例如人免疫细胞，诸如T细胞)的组合物，其将经历用于一般工程化的过程，例如以产生工程化T细胞的组合物。在某些实施方案中，所述细胞适于或将经历本文(例如，在第III部分中)所述的用于基因工程化的过程中的任一种。在某些实施方案中，所述测试细胞组合物是人细胞(例如，人免疫细胞)的组合物，其包含已经历用于一般工程化的过程的基因工程化细胞，例如以产生工程化T细胞的组合物。在某些实施方案中，所述细胞已经历本文(例如，在第III部分中)所述的用于基因工程化的过程中的任一种。在特定实施方案中，所述测试细胞组合物是T细胞组合物，所述T细胞组合物适于或将经历本文(例如，在第III部分中)所述的用于基因工程化的过程中的任一种，以产生含有表达重组受体(例如，CAR)的T细胞的工程化T细胞组合物。在某些实施方案中，所述测试细胞组合物是含有表达重组受体(例如，CAR)的T细胞的工程化T细胞组合物。在某些实施方案中，所述工程化T细胞组合物已经历本文(例如，在第III部分中)所述的用于使细胞基因工程化的过程中的任一种。

在各种实施方案中，所述测试细胞组合物是在产生工程化T细胞的组合物的过程期间收集的人细胞(例如，人免疫细胞，如T细胞)的组合物。在某些实施方案中，在本文(例如，在第III部分中)所述的用于产生工程化细胞的过程中的任一种的任何阶段或时间点期间收集细胞。在特定实施方案中，所述测试细胞组合物包含激活的或刺激的T细胞。在某些实施方案中，激活的或刺激的T细胞已在刺激条件(如本文(例如，在第III部分中)所述那些中的任一种)下孵育。在某些实施方案中，所述测试细胞组合物含有转化或转染的T细胞。在某些实施方案中，异源多核苷酸(如编码重组受体或CAR的一种)已被引入或递送至T细胞。在特定实施方案中，本文例如，在第III-C部分中所述。在特定实施方案中，所述测试细胞组合物含有培育的或扩增的T细胞。在某些实施方案中，所述T细胞已根据本文(例如，在第III-D部分中)提供的任何方法培育或扩增。

在一些实施方案中，所述测试细胞组合物包含或含有表达重组受体的免疫细胞。在特定实施方案中，所述测试细胞组合物包含表达重组受体的T细胞，例如CD4+或CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述重组受体是抗原受体。在特定实施方案中，所述重组受体是CAR。在某些实施方案中，所述重组受体是本文(例如，在第II-C-1-a或II-C-1-b部分中)所述的任何CAR。在特定实施方案中，所述重组受体是重组TCR，例如本文(例如在第II-C-1-c部分)所述的重组TCR。在一些实施方案中，所述重组受体是抗CD19 CAR。在某些实施方案中，所述重组受体是抗BCMACAR。

在某些实施方案中，质谱图谱由多于一个测试细胞组合物产生。在某些实施方案中，质谱图谱由两个、三个、四个、五个、多于五个、多于十个、多于二十个、多于五十个或多于100个测试细胞组合物产生。在某些实施方案中，质谱图谱由多于一个测试细胞组合物产生，以确定多个测试细胞组合物中一种或多种蛋白质(例如，表面蛋白)的均值、中值或平均水平或量。在一些实施方案中，质谱图谱由多于一个测试细胞组合物产生，以确定多个测试细胞组合物之中一种或多种蛋白质(例如，表面蛋白)的水平或量的变异性或变化。

在一些实施方案中，所述测试细胞组合物含有表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，将测试细胞组合物的质谱图谱与表达不同重组受体的细胞组合物的图谱进行比较。在某些实施方案中，将测试细胞组合物的质谱图谱与不表达重组受体的细胞组合物进行比较。在一些实施方案中，可以将来自测试细胞组合物的质谱图谱与来自通过不同过程产生的细胞组合物的质谱图谱进行比较。在一些实施方案中，将测试细胞组合物的质谱图谱与来自制造过程的不同阶段或步骤的不同细胞组合物进行比较。

在特定实施方案中，将测试细胞组合物的质谱图谱与在工程化过程的较早阶段(例如，早于在收集测试细胞组合物的细胞时)收集的细胞组合物的质谱图谱进行比较。在一些实施方案中，将测试细胞组合物的质谱图谱与在工程化过程的较晚阶段(例如，晚于在收集测试细胞组合物的细胞时)收集的细胞组合物的质谱图谱进行比较。在一些实施方案中，将来自测试细胞组合物的质谱图谱与来自细胞组合物的质谱图谱进行比较，所述细胞组合物处于制造过程的相同阶段但暴露于不同条件(例如，不同于来自测试细胞组合物的细胞所暴露的条件)。

在一些实施方案中，将测试细胞组合物的质谱图谱(例如，测试质谱图谱)与参考质谱图谱进行比较。在某些实施方案中，所述参考质谱图谱是理论图谱。在一些实施方案中，所述理论图谱是基于预测在细胞组合物的细胞中或由所述细胞表达的蛋白质(及其水平、量或修饰)。在特定实施方案中，所述理论图谱是基于被认为是理想细胞组合物的细胞组合物的细胞中或由所述细胞表达的蛋白质(及其水平、量或修饰)。

在一些实施方案中，所述参考质谱图谱是从参考细胞组合物获得的。

在某些实施方案中，参考细胞组合物含有表达重组受体的细胞。在特定实施方案中，所述重组受体还由测试细胞组合物所含有的细胞表达。在某些实施方案中，参考细胞组合物和测试细胞组合物各自含有表达相同重组受体的细胞。在一些实施方案中，参考细胞组合物由从与测试组合物相同的受试者获得的细胞产生。在某些实施方案中，参考细胞组合物由从与获得用于产生测试组合物的细胞的受试者不同的受试者获得的细胞产生。在特定实施方案中，所述参考细胞组合物(i)是从与用于产生测试细胞组合物的细胞相同的受试者获得的细胞产生的，并且(ii)含有表达不同重组受体的细胞作为测试组合物中的细胞。在各种实施方案中，所述参考细胞组合物(i)是从与用于产生测试细胞组合物的细胞不同的受试者获得的细胞产生的，并且(ii)含有表达相同重组受体的细胞作为测试组合物中的细胞。在某些实施方案中，所述重组受体是CAR。

在一些实施方案中，参考细胞组合物含有在比收集测试细胞组合物的细胞的阶段更早的工程化过程阶段收集的细胞。在某些实施方案中，所述参考细胞组合物含有在比收集测试细胞组合物的细胞时更晚的工程化过程阶段收集的细胞。在某些实施方案中，所述参考细胞组合物含有在与测试组合物的细胞相同的制造过程阶段收集的细胞。在特定实施方案中，所述参考细胞组合物含有在与测试组合物的细胞相同的制造过程阶段收集但暴露于不同条件的细胞。

在特定实施方案中，所述参考质谱图谱是从多个参考细胞组合物获得的。在某些实施方案中，所述多个参考细胞组合物包括、包括约或包括至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500或1,000个参考细胞组合物。在特定实施方案中，所述参考质谱图谱是或包括从参考质谱图谱获得的质谱图谱的平均值、均值或中值。

A.细胞类型

特定实施方式设想的是，可以根据所提供的方法评估任何含有细胞的组合物。在一些实施方案中，所述细胞群体是或包含细胞系或原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞群体是或包含原代细胞，如获自受试者(例如人受试者)的原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞群体是或包含干细胞，如诱导多能干细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物，例如源组合物或其一部分，如测试细胞组合物，是与制造细胞组合物的过程相关(包括与具有重组核酸的工程化细胞有关)的组合物。在一些实施方案中，所述细胞组合物是药物组合物。

在某些实施方案中，所述细胞是或包括真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞组合物的细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述组合物的细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是小鼠细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞或非人灵长类细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是细胞系的细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、由5V40转化的猴肾CV1系(C057)；人胚肾系293；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利细胞(TM4)；猴肾细胞(CVI-76)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT)；大鼠肝癌细胞(HTC)；HIH/3T3细胞，和TRI细胞。对于哺乳动物细胞系的广泛列表，本领域技术人员可以参考美国典型培养物保藏中心目录(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯(Mamassas,VA))。在一些实施方案中，所述细胞可以属于多个细胞类型，例如成纤维细胞、成肌细胞、巨噬细胞或上皮细胞。

在特定实施方案中，组合物的细胞是或包括干细胞。在某些实施方案中，所述细胞组合物的细胞是多能干细胞、多潜能干细胞、寡能干细胞和/或单能干细胞。在特定实施方案中，所述细胞是诱导的，例如诱导多能干细胞(ipsc)。在特定实施方案中，所述组合物的细胞是例如正在重新编程(例如朝着多能性)过程中的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是在分化过程中的干细胞。

在一些实施方案中，所述组合物的细胞是免疫细胞。在特定实施方案中，所述细胞组合物含有T细胞、B细胞和/或NK细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述细胞组合物的细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和抑制T细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。

在一些实施方案中，所述细胞组合物是或包括T细胞。在特定实施方案中，T细胞是或包括T细胞的亚型和亚群，如幼稚T(T

在某些实施方案中，评估原代细胞的表面蛋白。在一些实施方案中，细胞组合物含有原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整个T细胞群体、CD4+T细胞、CD8+T细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。

在一些实施方案中，所述组合物的一种或多种细胞是工程化细胞。在一些情况下，所述一种或多种细胞被工程化以含有重组核酸，例如含有异源核酸和/或表达异源蛋白质。在一些实施方案中，所述重组核酸编码重组蛋白。在一些情况下，所述重组蛋白可以是期望由重组细胞组合物表达或产生的任何蛋白质。在一些实施方案中，所述重组蛋白是重组受体。在一些实施方案中，所述重组核酸是或包括被转入或引入细胞中以表达重组蛋白的病毒载体，例如慢病毒或逆转录病毒载体。

B.工程化细胞组合物

在某些实施方案中，所述工程化细胞含有编码重组受体的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合受体或抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在某些实施方案中，通过本文(例如，在第III部分中)所述的任何方法生产、制造或产生所述工程化细胞。在某些实施方案中，从已由本文(例如，在第III部分中)所述的方法生产、制造或产生的工程化细胞测量、测定或获得质谱图谱。

在一些实施方案中，组合物中的全部或部分细胞含有或被工程化以含有工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在特定实施方案中，组合物中的全部或部分细胞表达工程化受体。在一些实施方案中，含有工程化细胞的组合物富集了此类细胞。在某些实施方案中，富集或选择某种类型的细胞，如T细胞或CD8+或CD4+T细胞。在特定实施方案中，所述细胞组合物是治疗性和/或药物细胞组合物，如用于过继细胞疗法。在一些实施方案中，从治疗性细胞组合物(例如，细胞疗法)测量、测定或获得质谱图谱。在一些实施方案中，从含有CAR+T细胞的工程化细胞组合物测量、测定或获得质谱图谱。

1.重组受体

在一些实施方案中，从表达一种或多种重组受体的工程化细胞(如免疫细胞，如T细胞)测量、测定或获得质谱图谱。受体包括抗原受体以及含有其一种或多种组分的受体。重组受体可以包括嵌合受体(如含有配体结合结构域或其结合片段和细胞内信号传导结构域或区域的那些)、功能性非TCR抗原受体、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)(诸如重组或转基因TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和任何前述的组分。重组受体(如CAR)通常包括(在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)与一个或多个细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。在一些实施方案中，所述工程化细胞表达含有不同组分、结构域或区域的两种或更多种受体。在一些方面，两种或更多种受体允许在空间或时间上调节或控制重组受体的特异性、活性、抗原(或配体)结合、功能和/或表达。

在一些实施方案中，比较从表达相同重组受体(例如，CAR或重组TCR)的不同细胞组合物获得的质谱图谱。在某些实施方案中，比较从表达通过不同工程化过程产生的相同重组受体的不同细胞组合物获得的质谱图谱。在一些实施方案中，可以比较质谱图谱以评价响应于不同工程化过程的细胞特性的变化。在一些实施方案中，比较质谱图谱以检测存在于细胞表面上的重组受体的水平或量的相似性或差异。在特定实施方案中，比较质谱图谱以检测重组受体的翻译后修饰(例如，聚糖的缀合)的水平或量的相似性或差异。

在一些实施方案中，收集从表达相同重组受体(例如，CAR或重组TCR)的不同细胞组合物获得的质谱图谱，例如以确定或计算平均值、中值或均值质谱图谱或其部分。在特定实施方案中，收集从表达相同重组受体的不同细胞组合物获得的质谱图谱，如以确定或计算在组合物的细胞表面上表达的一种或多种单独蛋白质的平均值、中值或均值水平或量。在特定实施方案中，收集从表达相同重组受体的不同细胞组合物获得的质谱图谱，以确定或计算在细胞表面表达的一种或多种蛋白质的一种或多种单独翻译后修饰的平均值、中值或均值水平或量。在一些实施方案中，所述平均值、均值或中值质谱图谱或其部分可以用作参考蛋白质图谱。

在具体实施方案中，收集从表达相同重组受体(例如，CAR或重组TCR)的不同细胞组合物获得的质谱图谱，以确定或计算跨越质谱图谱或其部分的变异性或变化。在特定实施方案中，收集从表达相同重组受体的不同细胞组合物获得的质谱图谱，以确定或计算在细胞表面上表达的一种或多种单独蛋白质的量跨越细胞组合物的变异性或变化。在一些实施方案中，收集从表达相同重组受体的不同细胞组合物获得的质谱图谱，以确定或计算一种或多种单独的翻译后修饰的量跨越细胞组合物的变异性或变化。

a.嵌合抗原受体(CAR)

在一些实施方案中，所述工程化细胞(如T细胞)表达对特定抗原(或标记或配体)(如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方案中，所述抗原是多肽。在一些实施方案中，所述抗原是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织(例如在健康细胞或组织中)相比，抗原在疾病或病症的细胞例如肿瘤细胞或致病细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，所述抗原在正常细胞上表达和/或在工程化的细胞上表达。在一些方面，所述重组受体(例如，CAR)包含一个或多个区域或结构域，其选自细胞外配体(例如，抗原)结合或区域或结构域(例如本文所述的任何抗体或片段)以及细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，所述配体(例如，抗原)结合区域或结构域是或包含scFv或单结构域V

示例性抗原受体(包括CAR)和用于将此类受体工程化并引入细胞中的方法包括例如在以下文献中所述的那些：国际专利申请公开国际专利申请公开号WO 2000/14257、WO2013/126726、WO 2012/129514、WO 2014/031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；以及Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75所述的那些。在一些方面，所述抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO 2014/055668中描述的那些。CAR的例子包括如任何前述参考文献所公开的CAR，所述参考文献是如WO2014/031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、US 7,446,190、US 8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci TranslMed.2013 5(177)。

在一些实施方案中，所述重组受体(例如抗原受体)含有结合(例如，特异性结合)抗原、配体和/或标记的细胞外抗原结合结构域或配体结合结构域。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，抗原受体是含有特异性结合抗原的细胞外抗原识别结构域的CAR。在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原、标记或配体的特异性，所述特定抗原、标记或配体是例如在由过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如癌症标记)和/或旨在诱导衰减反应的抗原(例如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种配体(例如，抗原)结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(V

在一些实施方案中，CAR含有抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别在细胞表面上表达的抗原或配体(如完整抗原)。在一些实施方案中，所述抗原或配体是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述抗原或配体是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，所述抗原或配体在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，所述抗原在正常细胞上表达和/或在工程化的细胞上表达。

在一些实施方案中，所述嵌合受体靶向的抗原包括在通过过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

在一些实施方案中，所述抗原或配体是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，所述抗原或配体所述抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如若干已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，所述抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原，如病毒抗原(例如，来自HIV、HCV、HBV的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段(例如scFv或V

在一些实施方案中，scFv和/或V

在一些实施方案中，scFv和/或V

在一些方面，CAR含有结合或识别(例如特异性结合)通用标签或通用表位的配体(例如，抗原)结合结构域。在一些方面，结合结构域可以结合分子、标签、多肽和/或表位，所述分子、标签、多肽和/或表位可以被连接至识别与疾病或障碍相关的抗原的不同结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)。示例性标签或表位包括染料(例如，荧光素异硫氰酸盐)或生物素。在一些方面，结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)与标签连接，所述标签识别与具有表达对所述标签特异的CAR的工程化细胞的疾病或障碍相关的抗原(例如，肿瘤抗原)，以实现所述工程化细胞的细胞毒性或其他效应子功能。在一些方面，CAR对与疾病或障碍相关的抗原的特异性由标记的结合分子(例如，抗体)提供，并且不同的标记的结合分子可以用于靶向不同的抗原。对通用标签或通用表位特异的示例性CAR包括例如在U.S.9,233,125，WO 2016/030414，Urbanska等人,(2012)Cancer Res 72:1844–1852，以及Tamada等人,(2012).Clin Cancer Res 18:6436–6445中所描述的那些。

在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，例如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别作为主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(例如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的部分在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非T细胞受体(TCR)抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，含有针对肽-MHC复合物展现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在MHC分子的背景下在细胞表面上被识别。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域经由接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或接近经由天然抗原受体(如TCR)的信号，以及任选地经由这种受体与共刺激受体的组合的信号。

提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机器加工的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是具有跨膜α链的异二聚体，在一些情况下具有三个α结构域和非共价缔合的β2微球蛋白。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所必需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，在此处MHC-肽复合物被T细胞(如通常是CD8

术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物在细胞表面上存在或展示。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性识别。

在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，例如用于由抗原受体识别。通常，所述肽源自或基于较长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，所述肽通常具有约8至约24个氨基酸的长度。在一些实施方案中，对于MHC II类复合物中的识别，肽的长度为从或从约9至22个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC I类复合物中的识别，肽的长度为从或从约8至13个氨基酸。在一些实施方案中，在识别MHC分子(如MHC-肽复合物)的背景中的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，从而诱导T细胞反应，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞反应或其他反应。

在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可以通过已知的方法产生(参见例如，美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US 2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际申请公开号WO 03/068201)。

在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够与MHC结合的抗原的表位，所述抗原是例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主施用有效量的免疫原以用于引发免疫反应，其中免疫原保持其三维形式持续足以引发针对所述肽在MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫反应的时间段。然后测定从宿主中收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目的肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。

在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中所述文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如，美国专利申请公开号US20020150914、US20140294841；和Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。

本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)

在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，所述抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。

所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab’)

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为V

单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。示例性的单结构域抗体包括sdFv、纳米抗体、V

抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是scFv。

“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR，并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

因此，在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv。在一些方面，所述抗体或抗原结合片段可以通过筛选多个(例如文库)抗原结合片段或分子，例如通过筛选scFv文库以结合特定抗原或配体来获得。

在一些方面，所述重组受体(例如嵌合抗原受体)包括细胞外部分，其含有一个或多个配体(例如抗原)结合结构域(如抗体或其片段)；和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些方面，所述重组受体(例如CAR)还包括间隔子和/或跨膜结构域或部分。在一些方面，所述间隔子和/或跨膜结构域可以连接含有配体(例如，抗原)结合结构域的细胞外部分和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域。

在一些实施方案中，所述重组受体(例如CAR)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，例如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或C

在一些方面，所述间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ IDNO:1所示的仅铰链间隔子，且由SEQ ID NO:2所示的序列编码。在其他实施方案中，所述间隔子是与C

在一些实施方案中，所述间隔子可以全部或部分地源自IgG4和/或IgG2。在一些实施方案中，所述间隔子可以是含有源自IgG4、IgG2和/或IgG2和IgG4的铰链、C

在一些方面，所述间隔子是多肽间隔子，如选自以下的一种或多种：(a)包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或由其组成或包含约15个氨基酸或更少，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域，(b)包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成和/或包含约15个氨基酸或更少，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域，或(c)是为或约12个氨基酸的长度和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成；或(d)由以下项组成或包含以下项：SEQ ID NO:1、3-5或27-34所示的氨基酸序列或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的前述任一项的变体；或(e)包含式X

在一些实施方案中，CAR的配体(例如，抗原)结合或识别结构域与一种或多种细胞内信号传导组分(如细胞内信号传导区域或结构域)和/或模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)进行激活和/或经由另一种细胞表面受体发送信号的信号传导组分连接。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导区域或结构域连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一些实施方案中，使用天然地与受体(例如CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。

在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，所述结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区域包括源自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)或CD154(即，至少包含它们的一个或多个跨膜区域)的跨膜区域。可替代地，在一些实施方案中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面，所述合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分或其变体。所述细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。

在一些实施方案中，所述受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8展现至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的部分的跨膜结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，所述重组受体(例如，CAR)包含细胞内信号传导区域或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域或结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中刺激和/或诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域(例如CD3-Zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述重组受体(例如，CAR)包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区域或结构域。

在一些实施方案中，所述重组受体(例如CAR)包括至少一种或多种细胞内信号传导组分，如细胞内信号传导区域或结构域。细胞内信号传导区域包括模拟或接近以下的那些：经由天然抗原受体的信号、经由这种受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。

在一些实施方案中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区域刺激和/或激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些背景下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区域或结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如如果其转导效应子功能信号的话。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域(例如，包含一个或多个细胞内结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景中与这种受体协同起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。在一些实施方案中，例如包含一个或多个细胞内结构域的细胞内信号传导区域包括参与提供共刺激信号的区域或结构域的胞质序列。

在一些实施方案中，所述受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合或抗原识别结构域连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，所述细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(例如Fc受体γ(FcRγ)、CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR包括在CD3zeta(CD3ζ)或FcRγ与CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16中的一种或多种之间的嵌合分子。

在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要经由TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(一种或多种次级胞质信号传导区域或结构域)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中之一或两者。

在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级刺激和/或激活的初级胞质信号传导区域。以刺激方式起作用的一种或多种初级胞质信号传导区域可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。一个或多个含有ITAM的初级胞质信号传导区域的例子包括源自TCR或CD3 zeta(CD3ζ)、Fc受体(FcR)γ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，CAR中的胞质信号传导区域或结构域含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。在一些实施方案中，所述细胞内(或胞质)信号传导区域包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含SEQ ID NO:13、14或15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13、14或15展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

因此，在一些实施方案中，为了促进完全刺激和/或激活，用于产生次级或共刺激信号的一种或多种组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在相同细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。

在一些实施方案中，CAR包含共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、ICOS和/或其他共刺激受体)的信号传导区域和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR包含初级胞质信号传导区域和共刺激信号传导组分二者。

在一些实施方案中，一种或多种不同的重组受体可以含有一个或多个不同的细胞内信号传导区域或结构域。在一些实施方案中，所述初级胞质信号传导区域被包括于一个CAR内，而共刺激组分由另一种受体(例如，识别另一种抗原的另一种CAR)提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。

在某些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含连接至CD3(例如，CD3ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。

在一些实施方案中，CAR在胞质部分中包含一个或多个(例如两个或更多个)共刺激结构域和初级胞质信号传导区域。示例性CAR包含CD3ζ、CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS的细胞内组分，如一个或多个细胞内信号传导区域或结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导区域或结构域，例如来自CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS，在一些情况下，在跨膜结构域与细胞内信号传导区域或结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域或结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41氨基酸结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域和/或结构域可以包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10或11展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞内区域包含CD137(4-1BB)的细胞内共刺激信号传导区域或结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸的胞质结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代、第三代或第四代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后例如经由CD3链诱导的信号单独地提供初级刺激或激活信号的一种CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这样的信号和共刺激信号的一种CAR，例如包括来自一种或多种共刺激受体如CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS和/或其他共刺激受体的一个或多个细胞内信号传导区域或结构域的一种CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体(例如选自CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS和/或其他共刺激受体)的多个共刺激结构域的一种CAR；在一些方面，第四代CAR是包括不同共刺激受体(例如选自CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS和/或其他共刺激受体)的三个或更多个共刺激结构域的一种CAR。

在一些实施方案中，所述细胞被工程化以表达一种或多种另外的分子和/或多肽，和/或组合和/或多重靶向方法用于调节(regulate)、控制或调节(modulate)CAR的功能和/或活性。例如，在下文描述的组合方法和多重靶向部分中描述了用于CAR和组合方法的示例性方法。

在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导区域或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，所述受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。

b.嵌合自身抗体受体(CAAR)

在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR结合(例如特异性结合)或识别自身抗体。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(如工程化以表达CAAR的T细胞)可以用于结合至并杀伤表达自身抗体的细胞，而不是表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫性疾病，如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为用于治疗干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀伤自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，所述重组受体是CAAR，如美国专利申请公开号US2017/0051035中所述的任一种。

在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中刺激和/或诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域(例如CD3-Zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。

在一些实施方案中，所述自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，所述自身抗原的选择可能是由于其识别与特定疾病状态(例如自身免疫性疾病，例如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞(例如B细胞)上的自身抗体。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。

c.T细胞受体(TCR)

在一些实施方案中，工程化细胞(如T细胞)表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的细胞内和/或肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。在一些方面，所述重组受体是或包括重组TCR。

在一些实施例中，“T细胞受体”或“TCR”是如下分子，该分子含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)或其抗原结合部分，并且能够特异性结合与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上总体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。

除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是小于全长TCR但结合至MHC分子中所结合的特定肽(如结合至MHC-肽复合物)的抗原结合部分。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR或其抗原结合片段的可变结构域(如TCR的可变α(V

在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之中展示较低变异性(参见例如Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上在三个CDR之中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经加工肽部分的相互作用最重要。在一些背景下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些背景下，β链的CDR1可以与肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，β链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，所述高变区通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)ClinicalMicrobiology Reviews,8:411-426)。

在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。

在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat编号的链的位置117至259；或β链恒定结构域或C

在一些实施方案中，所述TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，所述TCR链含有胞质尾。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子(像CD3)及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。

在一些实施方案中，TCR含有各种结构域或区域。在一些情况下，确切结构域或区域可能取决于特定结构或同源性建模或用于描述特定结构域的其他特征而变化。应理解，提及氨基酸(包括提及用于描述重组受体(例如，TCR)的结构域组织的作为SEQ ID NO所示的特定序列)是出于说明性目的，并且不意图限制所提供的实施方案的范围。在一些情况下，所述特定结构域(例如可变或恒定)可以长或短几个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。在一些方面，TCR的残基是已知的或可以根据国际免疫遗传学信息系统(International Immunogenetics Information System；IMGT)编号系统进行鉴定(参见例如www.imgt.org；还参见Lefranc等人(2003)Devel opmental and ComparativeImmunology,2&；55-77；以及The T Cell Factsbo ok第2版,Lefranc and LeFrancAcademic Press 2001)。使用此系统，TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR1序列对应于残基编号27-38之间存在的氨基酸(包含端值)，TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR2序列对应于残基编号56-65之间存在的氨基酸(包含端值)，并且TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR3序列对应于残基编号105-117之间存在的氨基酸(包含端值)。

在一些实施方案中，TCR的α链和β链各自还含有恒定结构域。在一些实施方案中，α链恒定结构域(Cα)和β链恒定结构域(Cβ)单独地是哺乳动物(如人或鼠)恒定结构域。在一些实施方案中，所述恒定结构域与细胞膜相邻。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。

在一些实施方案中，Cα和Cβ结构域中的每一个是人的。在一些实施方案中，Cα是由TRAC基因编码(IMGT命名法)，或者是其变体。在一些实施方案中，Cβ是由TRBC1或TRBC2基因编码(IMGT命名法)，或者是其变体。在一些实施方案中，任何所提供的TCR或其抗原结合片段可以是人/小鼠嵌合TCR。在一些情况下，TCR或其抗原结合片段具有包含小鼠恒定区的α链和/或β链。在一些方面，Cα和/或Cβ区是小鼠恒定区。在一些任何此类实施方案中，TCR或其抗原结合片段是由已经进行密码子优化的核苷酸序列编码。

在一些任何此类实施方案中，所述结合分子或TCR或其抗原结合片段是分离的或纯化的或者是重组的。在一些任何此类实施方案中，所述结合分子或TCR或其抗原结合片段是人的。

在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β的异二聚体，它是如通过一个或多个二硫键连接的。在一些实施方案中，TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。在一些实施方案中，所述恒定和可变结构域中的每一个包含由半胱氨酸残基形成的二硫键。

在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有如通过一个或多个二硫键连接的两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。

在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα、Vβ链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是可容易获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。

在一些实施方案中，所述重组受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定、分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见例如，肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)JImmunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349-354)。

在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对所述TCR序列的知识以合成方式产生。

在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来产生，所述T细胞是从受试者中分离的，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，TCR文库可以从CD4+或CD8+细胞产生。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如在从人获得的样品(如T细胞)中通过RT-PCR扩增。在一些实施方案中，文库(如单链TCR(scTv)文库)可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中经扩增的产物被克隆或组装以通过接头隔开。根据受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。

在一些方面，使TCR经受例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰经选择的TCR。在一些实施方案中，可以如通过筛选以评估针对肽的CTL活性来选择抗原特异性T细胞。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，例如对抗原的特定亲和力或亲合力来选择。

在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经被修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法实现定向进化，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad SciU S A,97,5387-92)；噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲代或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生经诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。

在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原，其可以是神经胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、B细胞成熟抗原(BCMA、BCM)、B细胞激活因子受体(BAFFR、BR3)、和/或跨膜激活剂和CAML相互作用子(TACI)、Fc受体样5(FCRL5、FcRH5)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、黑色素-A/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1(例如MUC1-8)、p53、Ras、细胞周期蛋白B1、HER-2/neu、癌胚抗原(CEA)、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、β-连环蛋白、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、端粒酶、TARP、pp65、CDK4、波形蛋白、S100、eIF-4A1、IFN诱导型p78、和黑素转铁蛋白(p97)、尿路斑块蛋白II、前列腺特异性抗原(PSA)、人激肽释放酶(huK2)、前列腺特异性膜抗原(PSM)、和前列腺酸性磷酸酶(PAP)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、BA-46、β-连环蛋白、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、半胱天冬酶8或B-Raf抗原。其他肿瘤抗原可以包括源自以下的任何抗原：FRa、CD24、CD44、CD133、CD 166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、雌激素受体、孕酮受体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、GD-2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II和IGF-I受体。特定肿瘤相关抗原或T细胞表位是已知的(参见例如，van derBruggen等人(2013)Cancer Immun，可在www.cancerimmunity.org/peptide/获得；Cheever等人(2009)Clin Cancer Res,15,5323-37)。

在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原。许多病毒抗原靶标已经被鉴定并且是已知的，包括源自HIV、HTLV和其他病毒中的病毒基因组的肽(参见例如，Addo等人(2007)PLoS ONE,2,e321；Tsomides等人(1994)J Exp Med,180,1283-93；Utz等人(1996)J Virol,70,843-51)。示例性病毒抗原包括但不限于来自以下的抗原：甲型肝炎、乙型肝炎(例如，HBV核心和表面抗原(HBVc、HBVs))、丙型肝炎(HCV)、EB病毒(例如EBVA)、人乳头瘤病毒(HPV；例如，E6和E7)、人免疫缺陷1型病毒(HIV1)、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、拉沙病毒、HTLN-1、HIN-1、HIN-II、CMN、EBN或HPN。在一些实施方案中，所述靶蛋白是细菌抗原或其他致病性抗原，如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MT)抗原、锥虫(例如，克氏锥虫(Tiypansoma cruzi，T.cruzi))抗原如表面抗原(TSA)、或疟疾抗原。特定病毒抗原或表位或其他致病抗原或T细胞表位是已知的(参见例如，Addo等人(2007)PLoS ONE,2:e321；Anikeeva等人(2009)Clin Immunol,130:98-109)。

在一些实施方案中，所述抗原是源自与癌症相关的病毒(如致癌病毒)的抗原。例如，致癌病毒是如下病毒，其中已知某些病毒的感染会导致发生不同类型的癌症，例如甲型肝炎、乙型肝炎(例如，HBV核心和表面抗原(HBVc、HBVs))、丙型肝炎(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒感染、EB病毒(EBV)、人疱疹病毒8(HHV-8)、人T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)、人T细胞白血病病毒-2(HTLV-2)或巨细胞病毒(CMV)抗原。

在一些实施方案中，所述病毒抗原是HPV抗原，其在一些情况下可以导致发生宫颈癌的风险更大。在一些实施方案中，所述抗原可以是HPV-16抗原、和HPV-18抗原、和HPV-31抗原、HPV-33抗原或HPV-35抗原。在一些实施方案中，所述病毒抗原是HPV-16抗原(例如，HPV-16的E1、E2、E6和/或E7蛋白的血清反应性区域，参见例如美国专利号6,531,127)或HPV-18抗原(例如，HPV-18的L1和/或L2蛋白的血清反应性区域，如美国专利号5,840,306中所述)。在一些实施方案中，所述病毒抗原是来自HPV-16的E6和/或E7蛋白的HPV-16抗原。在一些实施方案中，TCR是针对HPV-16E6或HPV-16E7的TCR。在一些实施方案中，TCR是例如WO2015/184228、WO2015/009604和WO 2015/009606中所述的TCR。

在一些实施方案中，所述病毒抗原是HBV或HCV抗原，其在一些情况下可以导致比HBV或HCV阴性受试者更大的发生肝癌的风险。例如，在一些实施方案中，所述异源抗原是HBV抗原，如乙型肝炎核心抗原或乙型肝炎包膜抗原(US2012/0308580)。

在一些实施方案中，所述病毒抗原是EBV抗原，其在一些情况下可以导致比EBV阴性受试者更大的发生伯基特淋巴瘤、鼻咽癌和霍奇金氏病的风险。例如，EBV是人疱疹病毒，在一些情况下，发现其与不同组织来源的多种人肿瘤相关。虽然主要发现为无症状感染，但是EBV阳性肿瘤的特征可以是病毒基因产物如EBNA-1、LMP-1和LMP-2A的活跃表达。在一些实施方案中，所述异源抗原是EBV抗原，其可以包括EB核抗原(EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前导蛋白(EBNA-LP)、潜伏膜蛋白LMP-1、LMP-2A和LMP-2B、EBV-EA、EBV-MA或EBV-VCA。

在一些实施方案中，所述病毒抗原是HTLV-1或HTLV-2抗原，其在一些情况下可以导致比HTLV-1或HTLV-2阴性受试者更大的发生T细胞白血病的风险。例如，在一些实施方案中，所述异源抗原是HTLV抗原，如TAX。

在一些实施方案中，所述病毒抗原是HHV-8抗原，其在一些情况下可以导致比HHV-8阴性受试者更大的发生卡波西肉瘤的风险。在一些实施方案中，所述异源抗原是CMV抗原，如pp65或pp64(参见美国专利号8361473)。

在一些实施方案中，所述抗原是自身抗原，如与自身免疫性疾病或障碍相关的多肽的抗原。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病或障碍可以是多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(RA)、舍格伦综合征、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、系统性红斑狼疮、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力(MG)、大疱性类天疱疮(针对真皮-表皮接合部的基膜的抗体)、天疱疮(针对粘多糖蛋白复合物或细胞内粘合质的抗体)、肾小球肾炎(针对肾小球基膜的抗体)、肺出血肾炎综合征、自身免疫溶血性贫血(针对红细胞的抗体)、桥本病(针对甲状腺的抗体)、恶性贫血(针对内因子的抗体)、特发性血小板减少性紫癜(针对血小板的抗体)、格雷夫斯病或艾迪生病(针对甲状腺球蛋白的抗体)。在一些实施方案中，所述自身抗原(如与前述自身免疫性疾病中的一种相关的自身抗原)可以是胶原蛋白(如II型胶原蛋白)、分枝杆菌热激蛋白、甲状腺球蛋白、乙酰胆碱受体(AcHR)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)或蛋白脂质蛋白(PLP)。特定自身免疫相关表位或抗原是已知的(参见例如，Bulek等人(2012)Nat Immunol,13:283-9；Harkiolaki等人(2009)Immunity,30:348-57；Skowera等人(2008)JClin Invest,1(18):3390-402)。

在一些实施方案中，用于产生或产生目的TCR的靶多肽的肽是已知的或者可以容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目的靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些例子中，使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序以及蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点是已知的。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。

在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已发生改变。在一些实施方案中，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。

在一些实施方案中，所述重组TCR是全长TCR。在一些实施方案中，所述重组TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(scTCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如例如国际专利申请公开号WO 03/020763、WO04/033685和WO 2011/044186中所述的结构。

在一些实施方案中，所述重组TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何重组TCR(包括dTCR或scTCR)可以与信号传导结构域连接，从而在T细胞表面上产生活性TCR。在一些实施方案中，所述重组TCR在细胞表面上表达。在dTCR或scTCR含有引入的或工程化的链间二硫键的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸被取代为另一种残基，如丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，引入或工程化的二硫键可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成。TCR的示例性非天然二硫键描述于公开的国际PCT号WO2006/000830中。

在某些实施方案中，TCR含有一个或多个修饰，以引入能够在TCRα链与TCRβ链之间形成一个或多个非天然二硫桥的一个或多个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，TCR包含含有TCRα恒定结构域的TCRα链或其一部分，所述TCRα恒定结构域含有能够与TCRβ链形成非天然二硫键的一个或多个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述转基因编码含有TCRβ恒定结构域的TCRβ链或其一部分，所述TCRβ恒定结构域含有能够与TCRα链形成非天然二硫键的一个或多个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，TCR包含TCRα和/或TCRβ链和/或TCRα和/或TCRβ链恒定结构域，其含有一个或多个修饰以引入一个或多个二硫键。在一些实施方案中，所述转基因编码TCRα和/或TCRβ链和/或TCRα和/或TCRβ，其具有一个或多个修饰以例如在由所述转基因得到的TCRα与内源TCRβ链之间，或在由所述转基因得到的TCRβ与内源TCRα链之间去除或防止天然二硫键。在一些实施方案中，形成和/或能够形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸被取代为另一残基，例如丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，参考TCRα恒定结构域的编号，在残基Thr48、Thr45、Tyr10、Thr45和Ser15中的一个或多个处引入半胱氨酸。在某些实施方案中，可以在TCRβ链恒定结构域的Glu15的残基Ser57、Ser77、Ser17、Asp59处引入半胱氨酸。TCR的示例性非天然二硫键描述于公开的国际PCT号WO2006/000830、WO 2006/037960和Kuball等人(2007)Blood,109:2331-2338。

在一些实施方案中，所述重组TCR是二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键二者。在一些实施方案中，所述TCR含有跨膜序列以锚定至膜。

在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链，所述TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附着至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序；以及TCRβ链，所述TCRβ链包含可变β结构域、恒定β结构域和附着至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。

在一些实施方案中，所述重组TCR是单链TCR(scTCR或scTv)。通常，可以使用已知方法产生scTCR，参见例如，Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际专利申请公开号WO 96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO2011/044186；以及Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然二硫键链间键以促进TCR链的结合(参见例如，国际专利申请公开号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中融合至其C末端的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际专利申请公开号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有通过肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际专利申请公开号WO 99/18129)。

在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成)、第二区段(其由与对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成)和接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。

在一些实施方案中，scTCR的连接第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单个多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，所述接头序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，第一和第二区段配对，使得其可变区序列被定向用于这种结合。因此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段的C末端与所述第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少所述scTCR与所述靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有为或为约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头具有式-PGGG-(SGGGG)

在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键二者。

在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡解离常数(K

III.用于产生工程化细胞的方法

在一些方面，本文提供了用于刺激、激活、工程化、培育和/或扩增一种或多种细胞群体(例如，富集的T细胞)的方法。在一些实施方案中，例如通过在刺激条件下和/或在刺激试剂存在下孵育所述细胞来刺激或激活所述一种或多种细胞群体。在某些实施方案中，例如通过向所述一种或多种群体的细胞引入异源性多核苷酸来使所述一种或多种富集的T细胞群体基因工程化。在某些实施方案中，培育所述一种或多种富集的T细胞群体，例如在促进或允许T细胞分裂、生长或扩增的条件下培育，如持续固定量的时间或直到达到扩增的阈值极限。在一些实施方案中，所述工程化过程包括刺激细胞以及然后转导细胞的步骤。在特定实施方案中，所述工程化过程包括刺激、转导以及然后扩增细胞的步骤。在某些实施方案中，所述细胞未扩增。

在特定实施方案中，本文提供了用于从一个或多个初始(例如源)T细胞群体产生基因工程化T细胞组合物的方法。在一些实施方案中，在刺激条件下孵育富集的T细胞群体，从而产生刺激群体。在某些实施方案中，将异源多核苷酸引入到刺激群体的细胞，从而产生转化群体。在某些实施方案中，然后扩增转化群体，例如持续一定量的时间或直到达到阈值扩增，从而产生扩增群体。在特定实施方案中，收获或收集转化群体或扩增群体，并且任选地配制，例如用于施用于受试者或用于冷冻保存。在一些实施方案中，所述群体是或包含CD4+T细胞和CD8+T细胞。

在某些实施方案中，本文提供了用于从两个初始(例如源)T细胞群体产生基因工程化T细胞组合物的方法。在一些实施方案中，在刺激条件下分别孵育所述两个富集的T细胞群体，从而产生两个单独的刺激群体。在某些实施方案中，将异源多核苷酸引入到两个单独的刺激群体的细胞中，从而产生两个单独的转化群体。在某些实施方案中，然后扩增两个单独的转化群体，例如持续一定量的时间或直到达到阈值扩增，从而产生两个单独的扩增群体。在特定实施方案中，收获或收集两个单独的转化群体或两个单独的扩增群体，并任选地配制，例如用于施用于受试者或用于冷冻保存。在特定实施方案中，所述两个单独的群体源自或来源于相同的生物样品或来自相同个体受试者的不同的生物样品。在一些实施方案中，所述两个单独的群体是或包含富集的CD4+T细胞群体和单独的CD8+T细胞群体。

在一些实施方案中，本文提供的方法可用于在完成用于产生工程化细胞的过程之前、期间或之后确定、测量或评估细胞的蛋白质(例如表面蛋白)的存在、水平、量或表达。在一些实施方案中，所述质谱图谱是通过本文(例如，在第I部分中)所述的任一种提供的方法获得的。在一些实施方案中，所提供的方法可用于测量、监测或评估工程化过程对一种或多种蛋白质(例如表面蛋白)的存在、不存在、量、水平和/或相对丰度的作用。

在某些实施方案中，所述质谱图谱是从工程化细胞组合物的细胞获得的。在特定实施方案中，所述质谱图谱是从将经历或正在经历用于使细胞工程化的过程的细胞获得的，所述过程例如如本文(例如在第III部分中)所述的任何工程化过程。在某些实施方案中，所述细胞已经历本文(例如，在第III部分中)所述的用于基因工程化的过程中的任一种。在一些实施方案中，用于使细胞工程化的过程是或包括用于产生表达重组受体的细胞的步骤。在特定实施方案中，所述重组受体是CAR。在某些实施方案中，所述重组受体是本文(例如，在第II-C-1-a或II-C-1-b部分中)所述的任何CAR。在特定实施方案中，所述重组受体是重组TCR，例如本文(例如在第II-C-1-c部分)所述的重组TCR。在一些实施方案中，所述重组受体是抗CD19 CAR。在某些实施方案中，所述重组受体是抗BCMACAR。在某些实施方案中，所述质谱图谱从细胞组合物获得，以测量或鉴定由工程化细胞表达的CAR。在特定实施方案中，所述质谱图谱从在用于使表达CAR的细胞工程化的过程期间的细胞组合物获得。

在特定实施方案中，质谱图谱从含有在工程化过程的不同阶段或时间点收集的细胞的两种或更多种细胞组合物获得。在一些实施方案中，所述两种或更多种细胞组合物从同一受试者产生。在某些实施方案中，可以对所述质谱图谱进行分析或彼此比较，以鉴定工程化过程对细胞的影响，例如表面蛋白的表达或在一些方面特征、特性或属性的变化，例如但不限于活力、分化、或者增殖潜力。

在特定实施方案中，质谱图谱是从含有在不同工程化过程(例如，用于产生表达相同重组受体的细胞的不同工程化过程)的相同阶段或时间点收集的细胞的两种或更多种细胞组合物获得的。在特定实施方案中，所述两种或更多种细胞组合物从同一受试者产生。在某些实施方案中，可以对质谱图谱进行分析或彼此比较，以鉴定不同工程化过程对细胞的影响。

在一些实施方案中，产生表达由不同工程化过程产生的相同重组受体(例如，CAR)的质谱图谱，如以比较或确定工程化过程对所得工程化细胞的影响。在某些实施方案中，所述制造过程在所述过程的一个或多个步骤或试剂方面是不同的。在一些实施方案中，所述过程的不同之处在于使用至少一种试剂。在一些实施方案中，所述试剂是刺激试剂，例如本文(例如在第III-B部分中)所述的任何刺激试剂。在一些实施方案中，所述试剂可以包括抗体(例如抗CD3抗体)、细胞因子(例如IL-2、可溶性抗CD3和/或抗CD28抗体)、基于珠或寡聚颗粒的刺激试剂或经辐照的抗原表达细胞。在一些实施方案中，所述试剂是用于基因递送的载体，例如病毒载体。

特定实施方式设想的是，所提供的方法也可用于分析或表征与工程化T细胞组合物的产生或维持结合使用的试剂。在某些实施方案中，所述试剂(例如本文(例如，在第III部分中)所述的任何试剂)可以含有蛋白质，并且因此可以根据本文所述的方法通过质谱法进行研究。

在一些方面，在细胞组合物的单位剂量之中的变异性可以归因于在产生或制造工程化细胞疗法中使用的制造过程的一个或多个方面。在一些情况下，原料的变化或其处理或储存可能影响本文观察到的影响毒性风险和/或结果的变量。在一些方面，在跨越若干受试者进行的过程之中原料的批次间变异性或储存/处理和/或不同原料的使用可能有影响，如通过增加所产生的细胞组合物的变异性或者增加或减少所产生的细胞组合物的某些方面，例如如果有变化则会导致被施用细胞疗法的受试者之中(特别是在某些患者特有属性有所不同的此类受试者之中)的毒性风险或临床结果的变异性的方面。

在一些实施方案中，提供了如下途径，其涉及通过任何提供的方法评估、测试和/或控制由于一种或多种(如任何或全部)原料、一个或多个批次、一种或多种试剂或其储存或处理、或其变化引起的对一个或多个此类产品属性或风险或可能性的潜在影响或在一个或多个此类产品属性或风险或可能性方面的变异性。在一些实施方案中，此类途径包括测定，如在使用这种原料、批次、储存或处理之前、在生产待施用于受试者的细胞组合物中或在这种施用之前进行的那些测定。在一些方面，测定评估原料、批次、变化、或处理或储存方法对在细胞组合物中的一个或多个属性(如本文中观察到的那些)的影响，所述一个或多个属性例如为影响毒性风险或结果或者加剧患者间变异性在此类结果中的影响的那些。在一些方面，测定评估与另一种材料、批次、或储存或处理方法相比，在此类一个或多个属性中是否存在可接受的低变异性或变化程度或对此类一个或多个属性是否具有可接受的低影响。在某些实施方案中，所述测定是或包括使用质谱法，如本文提供(例如，在第I部分中)的任何方法。在某些实施方案中，所述测定是或包括产生质谱图谱。

在一些方面中，如果(例如，仅当)或仅在测定(例如，涉及质谱的那些测定，例如通过本文所述的方法)证实了此变异性或变化或影响在可接受的范围或值或极限内，用于储存或处理的原料、批次或方法被释放以用于在制造待施用于患者的细胞疗法(或此细胞疗法被施用于患者)中使用。在一些实施方案中，使用新的原料或批次或储存或处理方法确定一个或多个此类属性的变异性低于某一水平，可以在实施此类新的原料或批次或储存或处理方法后减轻毒性风险或反应降低。在一些实施方案中，此类所提供的方法包括在产品释放之前测定组合物和/或基于此类参数调整给药策略的方法。

观察结果符合如下解释：可能有利的是，例如在鉴定安全且有效的细胞组合物剂量时，从由源自不同受试者的细胞产生的组合物的角度，和/或在存在原料或试剂的一种或多种不同储存或处理条件(例如使用不同批次的试剂或其他原料)的情况下，考虑(例如，在将产品和/或因子释放到给药策略中之前的测定)可能有助于组合物中的某些细胞/抗原特异性活性的因子的变异性程度。在一些方面中，有利的是降低此类参数的变异性和/或确认在此类不同条件/批次之中的可接受的变异性范围，例如当引入在不同条件下储存或处理的新批次或试剂时，如使用如本文(例如在第I部分中)所述的质谱测定。

在一些实施方案中，所提供的方法、制品、组合物、剂量和给药策略的优点在于它们考虑并且在相关的情况下调整或校正潜在的变异性来源，所述潜在的变异性来源包括源自试剂的变化的那些和/或患者与患者之间的变异性。例如，在一些实施方案中，通过涉及使用T细胞刺激/扩增试剂(或其批次)的过程产生工程化T细胞可能是有利的，所述T细胞刺激/扩增试剂(或其批次)已通过放行测定被验证为低于与参数(例如质谱图谱或试剂的一种或多种蛋白质的水平、量、浓度或修饰)的阈值水平相比的变异性或变化的可接受范围或者在其之内。

在一些实施方案中，所述试剂是或含有蛋白质的试剂。在特定实施方案中，所述试剂在工程化过程期间用于刺激、激活、转导、转染、转化、培育或扩增细胞。在一些实施方案中，所述蛋白质图谱是或是

A.从样品分离或选择细胞

在一些实施方案中，所述加工步骤包括从生物样品中分离细胞或其组合物，所述生物样品是如获得自或源自受试者(如患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者)的那些。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中分离、加工和/或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。在一些实施方案中，所述细胞包括CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞包括CD4+或CD8+T细胞。所述样品包括组织、流体和直接取自受试者的其他样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。

在一些方面，所述细胞通常是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如髓系或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。所述细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现成的技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞，对其进行制备、加工、培养和/或工程化，如本文所述，并且在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一患者体内。

T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(T

在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。

在一些实施方案中，所述工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于工程化的细胞可以从样品(如生物样品，例如获得自或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出所述细胞的受试者是患有所述疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如所分离、加工和/或工程化的细胞所用于的过继细胞疗法)的人。

因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。所述样品包括直接取自所述受试者的组织、流体和其他样品，以及从一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)得到的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。

在一些方面，所述细胞所来源的或分离出细胞的样品是血液或血液源样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的情境下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方案中，所述细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，所述细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。

在一些实施方案中，所述细胞的分离包括一个或多个制备和/或并非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下进行洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分，针对所需组分进行富集，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。

在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。

在一些实施方案中，洗涤从所述受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或多种或全部二价阳离子。在一些方面，洗涤步骤是在半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)中根据制造商的说明书完成的。在一些方面，洗涤步骤是通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明书完成的。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方案中，所述制备方法在分离、选择和/或富集和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后包括冷冻(例如冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除细胞群体中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个例子包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将所述细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。

在一些实施方案中，所述细胞或群体的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下进行洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分，针对所需组分进行富集，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。

在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。

在一些实施方案中，所述分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记(例如，表面蛋白)、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的分离方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过与和此类标记特异性结合的选择试剂(如抗体或结合配偶体)一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞分离。

在一些实施方案中，至少一部分选择步骤包括将细胞与选择试剂一起孵育。与一种或多种选择试剂一起孵育，例如作为选择方法的一部分可以使用一种或多种选择试剂来进行，以用于基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的利用一种或多种选择试剂基于此类标记进行分离的方法。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过与特异性结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞。在一些实施方案中，所述选择和/或过程的其他方面如国际专利申请公开号WO/2015/164675中所述。

在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法使得在分离的细胞与特异性结合至细胞上的标记的分子(例如，固体表面(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间产生有利的能量相互作用。在一些实施方案中，方法是使用颗粒诸如珠，例如磁珠进行，所述颗粒包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中所述选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，使用在国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统、装置或设备进行分离或分开。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。

在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中进行此类选择步骤或其部分(例如，与抗体包被的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，如各种溶液的体积、在加工期间溶液的添加及其时间安排，从而可以提供与其他可用方法相比的多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数量。这又可以增强正在加工的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。

在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分是在离心室中进行，其包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类工艺的一些方面，将一定体积的细胞与一定量所需的基于亲和力的选择试剂混合，所述体积和所述量显著少于在管或容器中根据制造商的说明书进行类似选择以选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常所用的体积和量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量是根据制造商的说明书用于在基于管或容器的孵育中针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。

在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有选择缓冲液，所述选择缓冲液含有选择试剂，所述选择试剂例如特异性结合至希望富集和/或耗尽的细胞上而不是组合物中其他细胞上的表面标记的分子，例如抗体，所述分子任选地偶联到支架，例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL试剂的孵育的目标体积，例如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，所述选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。

在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间为或为约5分钟至6小时，例如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。

在一些实施方案中，所述孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。

在一些实施方案中，这种过程是在与所述室为整体的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如预先洗涤步骤洗涤含有细胞的样品，例如单采术样品)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和推出所述室并进行离心，以便使用自动化程序在单个封闭系统中完成洗涤和结合步骤。

在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，使所孵育的细胞经受分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与选择试剂一起孵育之后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移到系统中用于基于免疫亲和力来分离细胞。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。

此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至所述抗体或结合配偶体的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除了所需群体以外的细胞表达的标记来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。

在一些实施方案中，所述加工步骤还包括如使用可进行基于亲和力的选择的系统或设备对孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择。在一些实施方案中，通过以下方式进行分离：通过阳性选择富集特定细胞群体，或通过阴性选择耗尽特定细胞群体。在一些实施方案中，阳性或阴性选择通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记

分离无需导致特定细胞群或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致全部此类细胞的完全去除。

在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如之后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的各种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择各种细胞类型。

例如，在一些方面，T细胞的特定亚群(如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28

在一些实施方案中，通过以下方式进行分离：通过阳性选择富集特定细胞群体，或通过阴性选择耗尽特定细胞群体。在一些实施方案中，阳性或阴性选择通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记

在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，使用CD4

在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8

在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8

在一些实施方案中，中枢记忆T(T

在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经受CD4

通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群体，将CD4

在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4

在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与诸如含有小型可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads或MACS珠))的选择试剂一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的存在于一种或多种细胞或细胞群体上的分子(例如，表面标记)特异性结合。

在一些实施方案中，磁粒或磁珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。存在多种熟知的用于磁分离方法的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(例如在Owen美国专利号4,795,698和Liberti等人,美国专利号5,200,084中所述的那些)是其他的例子。

通常在如下条件下进行孵育，借此附着至磁粒或磁珠的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与样品内细胞上的细胞表面分子(如果存在)特异性结合。

在一些方面，将样品置于磁场中，并且附着有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或使其经受进一步的分离步骤。

在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁粒经由对一种或多种标记具有特异性的一抗的包被而附着至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用。

在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着至细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附着至用于施用于患者的细胞。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，所述可磁化颗粒是可生物降解的。

在一些方面，在其中将样品置于磁场中的过程中实现分离，并且具有附着至其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或使其经受进一步的分离步骤。

在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)来进行。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择具有附着至其上的磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成这个第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些方面，非靶细胞被标记并从异质细胞群体中耗尽。

在某些实施方案中，使用进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个的系统、装置或设备进行分离或分开。在一些方面，使用所述系统在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以使错误、用户操作和/或污染降至最低。在一个例子中，所述系统是如国际PCT公开号WO 2009/072003或US 20110003380A1中描述的系统。

在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、加工、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。

在一些方面，所述分离和/或其他步骤是使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)来进行的，例如用于在封闭且无菌的系统中以临床规模水平自动化分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的全部部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并且与夹紧阀一起确保经过所述系统的缓冲液的受控流动和细胞的连续悬浮。

在一些方面，CliniMACS系统使用在无菌、无热原溶液中供应的抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁粒标记细胞之后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由预装配的无菌管路(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，系统将细胞样品自动施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群体未被标记并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群体被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述方法一起使用的细胞群体在去除磁场之后从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。

在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许通过离心自动化洗涤和分级细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，可以将外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞培育室，其实现细胞培养方案，如例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660，Terakura等人(2012)Blood.1:72–82，以及Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。

在一些实施方案中，经由流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群体，其中流体流中携载针对多种细胞表面标记染色的细胞。在一些实施方案中，经由制备规模(FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群体。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群体(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10:1567-1573；以及Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355–376)。在两种情况下，可以用多种标记来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞子集。

在一些实施方案中，用一种或多种可检测的标记来标记抗体或结合配偶体，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以是基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。

在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除细胞群体中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个例子包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。

在一些实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从被感染的受试者分离T细胞并在体外用相同抗原刺激所述细胞，针对巨细胞病毒抗原来产生抗原特异性T细胞系或克隆。

B.T细胞的激活和刺激

在一些实施方案中，所述一个或多个加工步骤包括刺激分离的细胞(如选择的细胞群体)的步骤。所述孵育可以在基因工程化之前或与之结合，如在用编码重组受体(例如CAR)的核酸或载体转导细胞之前或与之结合。在一些实施方案中，所述刺激导致例如在转导之前细胞的激活和/或增殖。在一些实施方案中，所述细胞在刺激条件下孵育。

在一些实施方案中，所提供的用于产生工程化细胞的方法包括培育、孵育、培养和/或基因工程化步骤中的一种或多种。例如，在一些实施方案中，提供了用于孵育耗尽的细胞群体和培养起始组合物和/或将它们工程化的方法。在一些实施方案中，在培养起始组合物中孵育所述细胞群体。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其他容器。

在一些实施方案中，在基因工程化之前或结合基因工程化孵育和/或培养所述细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组受体，例如CAR)。

所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。

在一些实施方案中，所述刺激条件或药剂包括一种或多种药剂(例如，配体)，其能够激活TCR复合物的细胞内信号传导区域。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括抗体，如对TCR具有特异性的那些，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括能够刺激共刺激受体的一种或多种药剂(例如配体)，例如抗CD28。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以与固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。在一些方面，IL-2浓度为至少约50单位/mL、至少约100单位/mL或至少约200单位/mL。

在一些方面，根据多种技术进行孵育，例如以下文献中所述的那些：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177、Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651–660、Terakura等人(2012)Blood.1:72-82和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。

在一些实施方案中，通过以下方式刺激T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞，如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；并且孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，所述非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群体之前将饲养细胞添加至培养基中。

在一些实施方案中，在抗原表达细胞(如非分裂的抗原表达细胞)的存在下刺激细胞。在一些情况下，所述孵育可以还包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。

在一些实施方案中，在存在一种或多种刺激条件或刺激剂的情况下的孵育的至少一部分是在离心室的内腔中，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO 2016/073602中所述。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述刺激条件或刺激剂远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的刺激条件或刺激剂。

在一些实施方案中，将刺激剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL(如至少或约至少或约或10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL)试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，在添加细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将孵育缓冲液和刺激剂单独添加至细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许使用较少的总体刺激剂，同时实现细胞的刺激和激活。

在一些实施方案中，所述孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。

在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，例如至少或约至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，另外的孵育进行在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间的时间，包含端值。

在特定实施方案中，所述刺激条件包括与刺激试剂一起孵育、培养和/或培育细胞。在某些实施方案中，所述刺激试剂含有或包含珠。在某些实施方案中，当将细胞与刺激试剂一起孵育或接触时发生刺激的开始。在特定实施方案中，所述刺激试剂含有或包含寡聚试剂，例如链霉亲和素突变蛋白寡聚物。在特定实施方案中，所述刺激试剂激活和/或能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，所述刺激条件或刺激试剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些实施方案中，如本文设想的药剂可以包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(例如，酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质、凝集素或对所希望的靶标具有亲和力的任何其他生物分子。在一些实施方案中，所需靶标是T细胞受体和/或T细胞受体的组分。在某些实施方案中，所需靶标是CD3。在某些实施方案中，所需靶标是T细胞共刺激分子，例如CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。所述一种或多种药剂可以通过在本领域中已知和可用的各种方法直接或间接附着至珠上。所述附着可以是共价的、非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过各种附着手段(包括例如化学手段、机械手段或酶促手段)来实现。在一些实施方案中，所述药剂是抗体或其抗原结合片段，如Fab。在一些实施方案中，生物分子(例如，生物素化的抗CD3抗体)可以通过直接附着至珠的另一种生物分子(例如，抗生物素抗体)间接附着至珠。

在一些实施方案中，所述刺激试剂含有一种或多种药剂(例如抗体)，所述一种或多种药剂附着至珠(例如顺磁珠)并且与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性结合：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(例如，δ样1/4、Jagged 1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3或其片段，包括这些大分子的相应配体或其片段。在一些实施方案中，附着至珠上的药剂(例如抗体)特异性结合细胞(例如T细胞)上的一种或多种以下大分子：CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA、和/或CD45RO。

在一些实施方案中，附着至珠的一种或多种药剂是抗体。所述抗体可以包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。在一些实施方案中，所述刺激试剂是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。应当理解，任何同种型的恒定区都可以用于本文设想的抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且此类恒定区可以从任何人或动物物种(例如，鼠物种)获得。在一些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别T细胞受体的一种或多种组分的抗体。在特定实施方案中，所述药剂是抗CD3抗体。在某些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别共同受体的抗体。在一些实施方案中，所述刺激试剂包括抗CD28抗体。

在某些实施方案中，所述刺激试剂含有与能够激活和/或扩增细胞(例如，T细胞)的一种或多种药剂(例如，生物分子)缀合或连接的颗粒(例如，珠)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂结合至珠。在一些实施方案中，所述珠是生物相容的，即由适合于生物学用途的材料构成。在一些实施方案中，所述珠对培养的细胞(例如培养的T细胞)是无毒的。在一些实施方案中，所述珠可以是能够以允许药剂与细胞之间相互作用的方式附着药剂的任何颗粒。

在一些实施方案中，所述刺激试剂含有珠和直接与细胞表面上的大分子相互作用的一种或多种药剂。在某些实施方案中，所述珠(例如顺磁珠)经由对细胞上的一种或多种大分子(例如一种或多种细胞表面蛋白)具有特异性的一种或多种药剂(例如抗体)与细胞相互作用。在某些实施方案中，将珠(例如顺磁珠)用本文所述的第一药剂(例如一抗(例如抗生物素抗体)或其他生物分子)标记，然后添加第二药剂(例如二抗(例如，生物素化的抗CD3抗体)或其他第二生物分子(例如，链霉亲和素)，由此所述二抗或其他第二生物分子与颗粒上的此类一抗或其他生物分子特异性结合。

在一些实施方案中，所述刺激试剂包括附着至珠的一种或多种药剂，所述珠包含金属氧化物核(例如，氧化铁内核)和涂层(例如，保护涂层)，其中所述涂层包含聚苯乙烯。在某些实施方案中，所述珠是单分散的顺磁(例如超顺磁)珠，其包含顺磁(例如超顺磁)铁核(例如，包含磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿(γFe2O3)的核)和聚苯乙烯涂层(coat或coating)。在一些实施方案中，所述珠是无孔的。在一些实施方案中，所述珠含有所述一种或多种药剂附着的官能化表面。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂与珠在表面上共价结合。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和/或抗CD28抗体、以及能够结合标记的抗体(例如生物素化的抗体)(如标记的抗CD3或抗CD28抗体)的抗体或其抗原片段。在某些实施方案中，所述珠具有约1.5g/cm3的密度和约1m2/g至约4m2/g的表面积。在特定实施方案中，所述珠是单分散的超顺磁珠，其具有约4.5μm的直径和约1.5g/cm3的密度。在一些实施方案中，所述珠是单分散的超顺磁珠，其具有约2.8μm的平均直径和约1.3g/cm3的密度。

在特定实施方案中，所述刺激试剂含有寡聚试剂(例如链霉亲和素突变蛋白试剂)，其被缀合、连接或附着至一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如配体)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂具有能够在特定的结合位点(例如结合位点Z)上结合寡聚试剂的附着的结合结构域或结合配偶体(例如，结合配偶体C)。在一些实施方案中，多种药剂可逆地结合至寡聚试剂。在各种实施方案中，寡聚试剂具有多个特定结合位点，所述多个特定结合位点在某些实施方案中在结合结构域(例如，结合配偶体C)处可逆地结合多种药剂。在一些实施方案中，在竞争试剂(例如还能够结合特定结合位点(例如结合位点Z)的试剂)的存在下结合药剂的量被降低或减少。

在一些实施方案中，所述刺激试剂是或包括其中至少一种药剂(例如，能够在细胞(如T细胞)中产生信号的药剂)与寡聚试剂相关(例如可逆地相关)的可逆系统。在一些实施方案中，所述试剂含有能够与试剂结合(例如可逆地结合)的多个结合位点。在一些情况下，所述试剂是具有能够在细胞(如T细胞)中产生信号的至少一种附着的药剂的寡聚颗粒试剂。在一些实施方案中，所述药剂含有可以特异性结合分子的表位或区域的至少一个结合位点(例如结合位点B)并且还含有与试剂的至少一个结合位点(例如，试剂的结合位点Z)结合的结合配偶体(在本文中也称为结合配偶体C)。在一些实施方案中，所述结合配偶体C与所述至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是非共价相互作用。在一些情况下，所述结合配偶体C与所述至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是共价相互作用。在一些实施方案中，所述结合配偶体C与所述至少一个结合位点Z之间的结合相互作用(例如非共价相互作用)是可逆的。

在此类可逆系统中可用作寡聚试剂的物质是已知的，参见例如美国专利号5,168,049；5,506,121；6,103,493；7,776,562；7,981,632；8,298,782；8,735,540；9,023,604；和国际公开PCT申请号WO2013/124474和WO2014/076277。描述了能够形成可逆相互作用的试剂和结合配偶体以及能够逆转这种结合的物质(例如竞争试剂)的非限制性例子。

在一些实施方案中，所述刺激试剂是由多种链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体构成和/或含有多种链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体的寡聚颗粒试剂。在某些实施方案中，本文提供的寡聚颗粒试剂含有可逆地结合或能够可逆地结合一种或多种药剂(例如刺激剂和/或选择剂)的多个结合位点。在一些实施方案中，所述寡聚颗粒具有在约80nm与约120nm之间(包含端值)的半径(例如，平均半径)；在7.5x 10

C.用于引入异源多核苷酸的方法

在一些实施方案中，所述加工步骤包括引入编码重组蛋白的核酸分子。用于引入基因工程化组分例如重组受体(例如CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码多肽或受体的核酸的那些方法，包括经由病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子(例如睡美人(SleepingBeauty)转座子系统)。基因转移的方法可以包括转导、电穿孔或导致基因转移到细胞中的其他方法。

在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将所述细胞与诱导反应(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达所测量的)的刺激物组合，然后转导被激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。

在一些情境下，可能需要防止刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能潜在地导致受试者中不希望的结果或较低的功效(如受试者中与毒性相关的因素)的可能性。因此，在一些情境下，所述工程化细胞包括导致细胞在体内(如在过继免疫疗法中施用时)对阴性选择易感的基因区段。例如，在一些方面，将所述细胞工程化，使得它们可以由于施用它们的患者的体内条件的变化而被消除。阴性选择性表型可以由赋予对所施用的药剂(例如，化合物)的敏感性的基因的插入而产生。阴性选择性基因包括单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell 2:223,1977)，其赋予更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因；细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。

在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(如例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557)。

在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述若干说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human GeneTherapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。

慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。

在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。

用于转移编码所述重组产物的核酸的其他方法和载体是例如在国际专利申请公开号WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。

在一些实施方案中，可以将所述细胞(例如，T细胞)在扩增期间或之后例如用编码重组受体(例如，T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))的核酸进行转染。例如，用于引入所需多肽或受体的基因的这种转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的受体进行刺激。所述第二种类型的刺激物可以包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer AnnualReview of Medicine第65卷:333-347(2014)。

在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的同一时间或至少一部分期间将细胞工程化。

在一些方面，对细胞进一步工程化以促进细胞因子或其他因子的表达。另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善治疗功效的那些，如通过促进转移细胞的活力和/或功能；用于提供选择和/或评估细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如Lupton S.D.等人,Mol.andCell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开案，其描述了通过将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而得到的双功能选择性融合基因的使用。参见例如Riddell等人，美国专利号6,040,177，第14-17栏。

如上所述，在一些实施方案中，在基因工程化之前或与基因工程化结合孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活、繁殖和/或冷冻以保存(例如冷冻保存)。

在一些实施方案中，所述引入是通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。此类方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的那些方法中的任一种。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于

在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他加工步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中描述的离心室系统进行的一个或多个加工步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US2008/0171951中。

在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，所述容器(如袋子)包括一个或多个容器(例如袋子)，其在同一容器或单独容器(例如同一袋子或单独袋子)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统还包括一个或多个容器(如袋)，所述容器含有介质，例如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。

在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，所述离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他加工步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个加工步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。

在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，例如速度低于用于沉淀细胞的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，所述旋转是以为或为约100g至3200g(例如，为或为约或至少为或为约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。

在一些实施方案中，在基因工程的至少一部分(例如转导)期间，和/或在基因工程之后，将细胞转移到容器如袋中，用于培养经基因工程化的细胞，例如用于培育或扩增细胞，如上所述。在一些实施方案中，用于培育或扩增细胞的容器是生物反应器袋，如灌注袋。

1.核酸和载体

在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达此类核酸的重组或基因工程化的产物。在一些实施方案中，所述核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或这种细胞所来源的生物中发现。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。

在一些实施方案中，所述重组受体由一种或多种多核苷酸(例如，核酸分子)编码。在一些实施方案中，用于过继细胞疗法的细胞使用用于基因工程化的载体进行工程化。

在一些方面，所述多核苷酸含有单个编码序列。在其他情况下，所述多核苷酸含有至少两种不同的编码序列。在一些方面，所述重组受体是或含有嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，所述重组受体是或含有T细胞受体(TCR)，例如转基因TCR。在一些实施方案中，所述多核苷酸和载体用于在细胞中表达重组受体。

在一些情况下，编码所述重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在其他方面，所述信号序列可以编码异源或非天然信号肽，如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ IDNO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下编码重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:26所示的CD8α信号肽。

在一些实施方案中，编码所述重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作连接以控制所述重组受体的表达。在一些例子中，所述多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。

在核酸分子编码两条或更多条不同多肽链的某些情况下，所述多肽链中的每一条可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两种单独的核酸，并且每一种可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。

在一些实施方案中，如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的信息共表达基因产物(例如编码细胞表面标记或其修饰形式和编码重组受体)。可替代地，在一些情况下，单个启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码细胞表面标记和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶(furin))的序列彼此分开。ORF由此编码单个多肽，所述多肽在翻译期间(在2A的情况下)或在翻译后被加工为单独蛋白质。在一些情况下，所述肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。

在一些实施方案中，编码细胞表面标记的核酸和编码重组受体的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些实施方案中，编码细胞表面标记的核酸和编码重组受体的核酸与两个不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码细胞表面标记的核酸和编码重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。

在一些实施方案中，所述载体含有编码一种或多种标记的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。

在一些实施方案中，所述标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可用于检测已经引入多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，所述转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，所述替代标记是经制备在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，所述替代标记是由编码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞结合用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还用于促进细胞自杀。

示例性替代标记可以包括细胞表面多肽的截短的形式，如以下截短的形式，其是非功能性的，并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号，和/或不内化或不能内化。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，SEQ ID NO:7或16所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有抗体西妥昔单抗

在一些实施方案中，所述标记是选择标记。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。

在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或16展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码细胞表面标记和/或重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如细胞表面标记和/或重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码细胞表面标记的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码细胞表面标记的核酸和编码重组受体的核酸与两个不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码细胞表面标记的核酸的下游。

2.病毒载体和病毒载体的制备

在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码所述重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。

还提供了含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。在一些实施方案中，所述载体或构建体含有与编码重组受体的核酸可操作地连接以驱动其表达的一种或多种启动子。在一些实施方案中，所述启动子与一个或一个以上核酸分子或多核苷酸可操作地连接。因此，还提供了载体，如含有本文所提供的任何多核苷酸的那些。在一些实施方案中，所述载体包括编码细胞表面标记的第一多核苷酸和编码重组受体(例如，CAR)的第二多核苷酸。

在一些情况下，所述载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。还提供了载体的集合或组合。在一些实施方案中，载体的所述集合或组合包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含第一多核苷酸，例如编码细胞表面标记的第一多核苷酸，并且所述第二载体包含编码重组受体(例如CAR)的第二多核苷酸。还提供了含有载体的这种组或组合的组合物。在一些实施方案中，所述载体的所述集合或组合一起用于细胞的工程化。在一些实施方案中，将所述集合中的第一载体和第二载体同时或顺序地以任何顺序引入用于工程化的细胞中。

在一些实施方案中，所述载体包括病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子，例如睡美人转座子系统；源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体，源自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。

所述病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。在任何此类例子中，将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸插入或定位在病毒载体的区域中，例如通常在病毒基因组的非必需区域中。在一些实施方案中，将核酸插入病毒基因组的某些病毒序列的位置中以产生具有复制缺陷的病毒。

可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因递送系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分之一或两者时引入生物安全保护措施。

在一些实施方案中，所述包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人,1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef和/或Tat(HIV的主要反式激活因子))。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。

在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了所述一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并且在包装细胞系中单独提供。

在一些实施方案中，用含有产生颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目的序列，即编码抗原受体(如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能产生有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。

在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性、多嗜性或双嗜性包膜，如辛德比斯病毒包膜、GALV或VSV-G。

在一些实施方案中，所述包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装到慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，所述包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。

在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达所述一种或多种病毒蛋白。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。

在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒经由转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。

在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。

在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有重组慢病毒载体，可以回收并滴定所述重组慢病毒载体。

所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。

D.培育和/或扩增

在一些实施方案中，所提供的方法包括用于培育工程化细胞(例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤。在某些实施方案中，所提供的方法不包括用于培育工程化细胞的步骤。在某些实施方案中，与产生细胞的初始源细胞相比，在完成所述过程后存在更多数量的工程化细胞。在各种实施方案中，与产生细胞的初始源细胞相比，在完成所述过程后存在更少数量的工程化细胞。在一些实施方案中，在基因工程化(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)的步骤之后在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。在一些实施方案中，所述培育产生含有表达重组受体(例如CAR)的富集T细胞的组合物的输出组合物。

在一些实施方案中，将工程化细胞在容器中培养，所述容器可以例如经由补料端口填充细胞培养基和/或细胞以用于培养所添加细胞。所述细胞可以来自需要培养细胞(例如，用于扩增和/或增殖细胞)的任何细胞来源。

在一些方面，所述培养基是支持细胞(如T细胞)的生长、培育、扩增或增殖的适应性培养基。在一些方面，所述培养基可以是含有盐、氨基酸、维生素、糖或其任何组合的混合物的液体。在一些实施方案中，所述培养基还含有一种或多种刺激条件或刺激剂，例如在孵育期间刺激细胞的培育、扩增或增殖。在一些实施方案中，所述刺激条件是或包括选自IL-2、IL-7或IL-15的一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，在培养或孵育期间在培养基中的一种或多种细胞因子的浓度独立地是从或从约1IU/mL至1500IU/mL，例如为或为约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL、5IU/mL至10IU/mL、10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL、50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL或200IU/mL至600IU/mL。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子的浓度独立地为至少或至少约1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL或1500IU/mL。

在一些方面，在转移工程化细胞和培养基之后，将细胞孵育至少一部分时间。在一些实施方案中，所述刺激条件通常包括适合于初级免疫细胞如人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。在一些实施方案中，在25至38摄氏度(如30至37摄氏度，例如为或约37摄氏度±2摄氏度)的温度下孵育细胞。在一些实施方案中，将所述孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，所述孵育是大于或大于约或持续约或24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。

在一些实施方案中，在维持细胞培养中目标量的二氧化碳的条件下孵育细胞。在一些方面，这确保了细胞在生长期间的最佳培育、扩增和增殖。在一些方面，二氧化碳(CO

在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞，如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；并且孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，所述非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群体之前将饲养细胞添加至培养基中。

在一些实施方案中，所述刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。任选地，所述孵育可以还包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。

在一些实施方案中，使用与生物反应器结合使用的容器(例如袋)孵育细胞。在一些情况下，所述生物反应器可以经受运动或摇摆，这在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调节摇摆速度和摇摆角度以实现所希望的搅动。在一些实施方案中，所述摇摆角度为或为约20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，所述摇摆角度在6°-16°之间。在其他实施方案中，所述摇摆角度在7°-16°之间。在其他实施方案中，所述摇摆角度在8°-12°之间。在一些实施方案中，所述摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，所述摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间并包含端值。在摇摆运动下进行细胞培养扩增的至少一部分，如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(如在5RPM与15RPM之间，如6RMP或10RPM的速度)摇摆。CD4+和CD8+细胞各自单独扩增，直至它们各自达到阈值量或细胞密度。

在一些实施方案中，在静态条件下进行至少一部分的孵育。在一些实施方案中，在灌注(例如在培养期间灌注出用过的培养基并灌注入新鲜培养基)的情况下进行孵育的至少一部分。在一些实施方案中，所述方法包括将新鲜培养基灌注到细胞培养物中(如通过补料端口)的步骤。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基含有所述一种或多种刺激剂，例如，一种或多种重组细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基与在静态孵育期间使用的培养基相同。

在一些实施方案中，在一种或多种抗独特型抗体(例如结合或识别由工程化细胞表达的重组受体的抗独特型抗体)的存在下扩增或培育细胞。

在一些实施方案中，在孵育之后，将容器(例如，袋)重新连接到进行用于制造、产生或生产细胞疗法的一个或多个其他加工步骤的系统上，例如重新连接到含有离心室的系统上。在一些方面，将培养的细胞从袋转移到室的内腔中用于配制培养的细胞。

E.组合物和配制品

在特定实施方案中，所述质谱图谱从工程化细胞组合物诸如配制的细胞组合物例如细胞疗法获得。在某些实施方案中，所述质谱图谱从细胞组合物获得，以验证所述质谱图谱的至少一部分落在可容忍的范围内，例如不落在阈值变异性或变化之外。在特定实施方案中，所述质谱图谱从细胞组合物获得，以鉴定或验证由所述细胞组合物(例如配制的细胞组合物或细胞疗法)的细胞表达的重组受体的存在。

在一些实施方案中，提供包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的所述剂量的细胞作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品。此类组合物可以根据所提供的方法和/或与所提供的制品或组合物一起使用，例如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法。

术语“药物配制品”是指如下制剂，其呈如下形式以允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且其不含对会被施用所述配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。

“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞或药剂和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。

在一些方面，所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。

所述配制品或组合物还可以含有多于一种活性成分，所述活性成分可用于用细胞或药剂预防或治疗的特定适应症、疾病或病症，其中相应活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物还包含其他药物活性剂或药物，如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，将所述药剂或细胞以盐(例如，药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。

在一些实施方案中，所述药物组合物以有效治疗或预防所述疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用，根据病症，重复所述治疗直到出现疾病症状的所需抑制为止。然而，其他剂量方案可能有用并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用所述组合物、通过多次推注施用所述组合物或通过连续输注施用所述组合物来递送。

所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式施用，例如，通过推注输注，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量是通过细胞或药剂的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量是通过细胞或药剂例如在不超过3天的时间段中多次推注施用来施用，或者通过细胞或药剂的连续输注施用来施用。

对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于要治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用所述药剂或细胞用于预防性目的还是治疗性目的、先前疗法、受试者的临床病史和对所述药剂或所述细胞的反应、以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物适合一次或在一系列治疗中施用受试者。

所述细胞或药剂可以使用标准施用技术、配制品和/或装置来施用。提供了用于储存和施用所述组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。例如，免疫反应性细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并施用于同一受试者或不同但相容的受试者。外周血衍生的免疫反应性细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射施用，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当施用治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫反应性细胞或治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。

配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，所述药剂或细胞群体是肠胃外施用的。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，将所述药剂或细胞群体通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送施用于受试者。

在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外地，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。

无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将所述药剂或细胞掺入溶剂中，如掺入与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。

用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。

IV.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。

除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，“一种/一个(a)”或“一种/一个(an)”意指“至少一种/至少一个”或“一种或多种/一个或多个”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。

在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括所述限值中的之一或两者的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度为多少，此均适用。

如本文所用术语“约”是指容易知道的相应值的通常误差范围。本文提及“约”某一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。

如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(例如序列表中所述)是指，在使用标准比对算法(例如GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，可以例如使用保守且相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应残基。通常，为了鉴定对应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,纽约,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。

如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导与它们操作性连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒和慢病毒)载体。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变型后代。

如本文所用，细胞或细胞群体对于特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常是表面标记)在细胞上或在细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下可通过流式细胞术检测，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。

如本文所用，细胞或细胞群体对于特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常是表面标记)在细胞上或在细胞中不存在实质可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下通过流式细胞术没有被检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比基本上相似。

如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以各种已知方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

氨基酸取代可以包括用一个氨基酸替代多肽中的另一个氨基酸。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入目的结合分子(例如，抗体)和针对所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选的产物中。

通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

在一些实施方案中，保守取代可能包括将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能包括将这些类别之一的成员交换为另一个类别。

如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。

如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。

V.示例性实施方案

所提供的实施方案包括：

1.一种用于鉴定基因工程化细胞组合物的质谱(MS)图谱的方法，所述方法包括：

(a)使用质谱技术确定来自测试工程化细胞组合物或其子集的样品的测试质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物包含含有重组受体的免疫细胞；

(b)将所述测试质谱图谱与参考质谱图谱进行比较；以及

(c)鉴定与所述参考质谱图谱相比，在所述测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，从而鉴定包含所述重组受体的细胞组合物的质谱图谱。

2.根据实施方案1所述的方法，其中所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，或者是来自多种参考组合物的若干样品的平均质谱图谱。

3.根据实施方案1或权利要求2所述的方法，其中所述测试工程化细胞组合物用于自体细胞疗法中。

4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述测试工程化细胞组合物通过包括以下项的过程产生：

(i)从来自受试者的样品选择或分离免疫细胞，从而产生源组合物，任选地其中所述生物样品是白细胞单采术样品、单采术样品或全血样品；

(ii)将所述源组合物的细胞与刺激试剂一起孵育，从而产生刺激组合物，其中所述孵育任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行；

(iii)将编码所述重组受体的核酸引入到所述刺激组合物的免疫细胞中，从而产生转化组合物；以及

(iv)将所述刺激组合物在37℃下培养至少24小时，从而产生所述测试工程化细胞组合物，其中所述培养任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行。

5.根据实施方案2-4中任一项所述的方法，其中所述参考组合物或所述多种参考细胞组合物中的每一种尚未引入编码所述重组受体的核酸分子。

6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，并且所述参考细胞组合物是包含从中衍生或获得所述测试细胞组合物的免疫细胞的源细胞组合物。

7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，其中：

所述测试工程化细胞组合物包含从受试者获得的免疫细胞，所述免疫细胞包含编码所述重组受体的核酸分子；并且

所述参考细胞组合物是包含从所述受试者获得的免疫细胞的输入组合物，所述免疫细胞不包含编码所述重组受体的核酸。

8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述参考质谱图谱是来自参考组合物的样品的质谱图谱，并且所述参考细胞组合物是在用于产生所述测试工程化细胞组合物的制造过程阶段之后、之前或期间获得的组合物。

9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述测试工程化细胞组合物是从先前施用所述工程化细胞组合物的受试者获得的样品。

10.根据实施方案9所述的方法，其中从所述受试者获得的所述样品包含用所述重组受体工程化的免疫细胞，任选地如通过流式细胞术或聚合酶链式反应(PCR)所检测的。

11.根据实施方案9或实施方案10所述的方法，其中从所述受试者获得的所述样品是血液样品或肿瘤样品。

12.根据实施方案9-11中任一项所述的方法，其中从所述受试者获得的所述样品是在向所述受试者施用所述工程化细胞后在或在约6与30天之间、在或在约14与29天之间或者在或在约17与22天之间获得的。

13.根据实施方案9-12中任一项所述的方法，其中所述样品是在或大约在所述受试者的血液中可检测到表达所述重组受体的峰值细胞时或者之后立即从所述受试者获得的。

14.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述测试工程化细胞组合物包含已由药剂接触以产生重组受体依赖性活性的细胞，任选地其中所述药剂是能够被所述重组受体结合的靶抗原或是对所述抗体具有特异性的抗独特型抗体。

15.根据实施方案2-14中任一项所述的方法，其中所述参考质谱图谱是来自多种参考组合物的若干样品的平均质谱图谱。

16.根据实施方案15所述的方法，其中所述多种参考组合物中的每一种包含含有所述重组受体的细胞。

17.根据实施方案15或实施方案16所述的方法，其中所述多种参考组合物中的每一种通过与所述工程化细胞组合物相同的过程或基本上相同的过程产生。

18.一种用于评估产生基因工程化细胞组合物的过程的方法，所述方法包括：

(a)获得多种参考工程化细胞组合物或其子集的样品的平均质谱图谱，其中所述多种参考组合物中的每一种包含通过相同过程或基本上相同过程产生的重组受体；以及

(b)确定所述平均质谱图谱的变化的存在、不存在或水平。

19.根据实施方案18所述的方法，所述方法还包括：如果在所述多种参考组合物之中，所述质谱图谱的变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，或者依据这种平均，变化不超过在所述质谱图谱的数据组分之中的一个标准偏差，则选择用于产生工程化细胞组合物的所述过程。

20.根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述平均质谱图谱是基于多个参考工程化组合物或其子集中的每一种的样品的质谱图谱，其中所述多种参考工程化细胞组合物中的每一种选自(1)参考工程化组合物中的细胞；(2)参考工程化组合物中的CD3+细胞；(3)参考工程化组合物中的CD4+T细胞；(4)参考工程化组合物中的CD8+T细胞；(5)参考工程化组合物中的重组受体+细胞；(6)参考工程化组合物中的重组受体+CD3+细胞；(7)参考工程化组合物中的重组受体+CD8+细胞；或(8)参考工程化组合物中的重组受体+CD4+细胞。

21.根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述多种参考组合物中的每一种通过包括以下项的过程产生：

(i)从来自受试者的样品选择或分离免疫细胞，从而产生源组合物，任选地其中所述生物样品是白细胞单采术样品、单采术样品或全血样品；

(ii)将所述源组合物的细胞与刺激试剂一起孵育，从而产生刺激组合物，其中所述孵育任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行；

(iii)将编码所述重组受体的核酸引入到所述刺激组合物的免疫细胞中，从而产生转化组合物；以及

(iv)将所述刺激组合物在37℃下培养至少24小时，从而产生所述测试工程化细胞组合物，其中所述培养任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行。

22.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述测试质谱图谱和参考质谱图谱单独地是肽图谱。

23.根据实施方案1-17和22中任一项所述的方法，其中所述参考质谱图谱是使用与所述测试质谱图谱相同的质谱技术来确定的。

24.一种用于表征产生基因工程化细胞组合物的过程的方法，所述方法包括：

(a)使用质谱技术确定来自第一细胞组合物或其子集的样品的第一质谱图谱；

(b)使用质谱技术确定来自第二细胞组合物或其子集的样品的第二质谱图谱；以及

(c)鉴定与所述第二质谱图谱相比，在所述第一质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，

其中所述第一细胞组合物和第二细胞组合物包含在用于产生基因工程化细胞组合物的制造过程的不同阶段的组合物。

25.根据实施方案24所述的方法，其中所述第一细胞组合物和所述第二细胞组合物处于产生基因工程化细胞组合物的不同阶段并且选自：

(i)源组合物，其包含从受试者的生物样品选择或分离的免疫细胞，任选地其中所述生物样品是白细胞单采术样品、单采术样品或全血样品；

(ii)刺激组合物，其包含所选组合物中已与刺激试剂接触的免疫细胞，任选地其中所述接触在一种或多种细胞因子的存在下进行；

(iii)转化组合物，其包含所述刺激组合物中含有编码所述重组受体的核酸的细胞；以及

(iv)培养组合物，其包含所述转化组合物中已在37℃或约37℃下培养至少24小时的细胞，任选地其中所述培养在一种或多种细胞因子的存在下进行。

26.根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中与所述第二细胞组合物相比，所述第一细胞组合物是来自所述制造过程的先前阶段或先前时间点的组合物。

27.一种用于表征产生基因工程化细胞组合物的过程的方法，所述方法包括：

(a)使用质谱技术确定来自第一细胞组合物或其子集的样品的第一质谱图谱；

(b)使用质谱技术确定来自第二细胞组合物或其子集的样品的第二质谱图谱；以及

(c)鉴定与所述第二质谱图谱相比，在所述第一质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，

其中所述第一细胞组合物和第二细胞组合物包含通过不同过程产生的基因工程化细胞。

28.根据实施方案27所述的方法，其中所述不同过程在以下中的一个或多个方面不同：血清的存在或浓度；培养的时间；试剂的批次；试剂的处理或储存；刺激试剂的存在或量；刺激试剂的类型；一种或多种细胞因子的存在或量；氨基酸的存在或量；温度；源组合物的来源或免疫细胞类型；源组合物中免疫细胞类型的比率或百分比，任选CD4+/CD8+细胞比率；细胞密度；静态培养；摇摆培养；灌注；病毒载体的类型；载体拷贝数；转导佐剂的存在；冷冻保存时源组合物的细胞密度；所述重组受体的表达程度；或调节细胞表型的化合物的存在。

29.根据实施方案24-28中任一项所述的方法，其中所述第一质谱图谱和所述第二质谱图谱单独地是肽图谱。

30.根据实施方案24-29中任一项所述的方法，其中所述第一质谱图谱和所述第二质谱图谱是使用相同的质谱技术来确定的。

31.一种表征重组受体的方法，所述方法包括使用质谱技术获得来自测试工程化细胞组合物或其子集的样品的重组受体的质谱图谱，所述测试工程化细胞组合物或其子集包含表达或含有所述重组受体的免疫细胞，所述质谱图谱包括至少一种数据组分。

32.根据实施方案31所述的方法，所述方法还包括鉴定与相同但不表达所述重组受体的细胞的质谱图谱相比，所述至少一种数据组分的一种或多种差异。

33.根据实施方案31或实施方案32所述的方法，其中已在刺激试剂的存在下刺激所述测试工程化细胞组合物。

34.根据实施方案31-33中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞组合物包含已由药剂接触以产生重组受体依赖性活性的细胞，任选地其中所述药剂是能够被所述重组受体结合的靶抗原或是对所述抗体具有特异性的抗独特型抗体。

35.根据实施方案31-34中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定与相同但尚未在刺激试剂的存在下被刺激或已在不同刺激试剂的存在下被刺激的工程化细胞组合物的质谱相比，所述质谱图谱中的一个或多个差异。

36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物富集了所述免疫细胞。

37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括淋巴细胞。

38.根据实施方案37所述的方法，其中所述淋巴细胞包括T细胞或自然杀伤(NK)细胞。

39.根据实施方案38所述的方法，其中所述淋巴细胞包括T细胞，并且所述T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。

40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是人的。

41.根据实施方案4、21、25和28-40中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、任选CD4+和/或CD8+T细胞，并且所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。

42.根据实施方案41所述的方法，其中所述刺激试剂包括与TCR复合物的成员特异性结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。

43.根据实施方案42所述的方法，其中所述一级药剂与CD3特异性结合和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。

44.根据实施方案4、21、25和28-43中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包括抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段。

45.根据实施方案42-44中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或所述二级药剂存在于固体支持物的表面上，任选地其中所述固体支持物是珠。

46.根据实施方案42-44中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂存在于包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的可溶性寡聚试剂的表面上。

47.根据实施方案4、21、25和28-46中任一项所述的方法，其中所述培养在促进所述工程化细胞增殖和/或扩增的条件下进行。

48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中所述样品是通过标记一种或多种表面蛋白、使细胞裂解并分离所述一种或多种蛋白质而从所述测试工程化细胞组合物加工得到的。

49.根据实施方案48所述的方法，所述方法还包括消化所述一种或多种分离的蛋白质。

50.一种评估工程化细胞组合物的表面蛋白的方法，所述方法包括：

(a)标记存在于工程化细胞组合物或其子集的细胞上的一种或多种表面蛋白，所述工程化细胞组合物包含表达或含有重组受体的细胞，从而产生标记的细胞组合物；

(b)使所述标记的细胞组合物的细胞裂解，从而产生裂解的细胞组合物；

(c)从所述裂解的细胞组合物分离所述一种或多种表面蛋白，以获得一种或多种分离的蛋白质；以及

(d)使所述一种或多种分离的蛋白质经受质谱技术，以获得包括一种或多种数据组分的质谱图谱。

51.根据实施方案50所述的方法，其中在(d)之前，所述方法还包括消化所述一种或多种分离的蛋白质。

52.根据实施方案49或实施方案51所述的方法，其中所述消化在能够切割一个或多个肽键的一种或多种蛋白酶的存在下通过蛋白水解进行。

53.根据实施方案52所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶是或包括胰蛋白酶。

54.根据实施方案48-53中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质包括细胞表面膜蛋白。

55.根据实施方案48-54中任一项所述的方法，其中使所述细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育。

56.根据实施方案55所述的方法，其中所述洗涤剂是非离子型洗涤剂。

57.根据实施方案56所述的方法，其中所述洗涤剂是或包含有效量的Triton X-100。

58.根据实施方案55所述的方法，其中所述洗涤剂是变性洗涤剂。

59.根据实施方案58所述的方法，其中所述变性洗涤剂是或包含有效量的十二烷基硫酸钠(SDS)。

60.根据实施方案55-59所述的方法，其中在使所述细胞裂解之后，所述方法还包括从所述裂解的组合物中去除所述洗涤剂。

61.根据实施方案48-60中任一项所述的方法，其中标记所述表面蛋白包括对伯胺进行生物素标记。

62.根据实施方案61所述的方法，其中使用包含亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin

63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述质谱技术包括使所述样品经受液相色谱法(LC)，然后经受质谱法。

64.根据实施方案63所述的方法，其中所述液相色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UHPLC)或超效液相色谱法(UPLC)。

65.根据实施方案63或实施方案64所述的方法，其中所述液相色谱法是超效液相色谱法(UPLC)。

66.根据实施方案63-65中任一项所述的方法，其中所述液相色谱法和所述质谱法是联机进行的。

67.根据实施方案63-66中任一项所述的方法，其中所述液相色谱法选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水相互作用色谱法(HILIC)。

68.根据实施方案63-67中任一项所述的方法，其中执行所述质谱法的质谱仪包含四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。

69.根据实施方案68所述的方法，其中所述质谱仪包括离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。

70.根据实施方案69所述的方法，其中所述质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。

71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述数据组分选自MS离子信息、总离子色谱仪(TIC)或其一部分、提取离子色谱图(XIC)或其一部分、肽MS离子信号峰、蛋白质MS离子信号峰、肽鉴定信息、蛋白质鉴定信息、定性信息、定量信息、结构信息、翻译后修饰。

72.根据实施方案71所述的方法，其中所述数据组分是XIC或其一部分，其中所述XIC或其一部分是基于所述重组受体的一种或多种肽组分的一个或多个理论或已知m/z值。

73.根据实施方案72所述的方法，其中所述一种或多种肽组分是经蛋白水解切割或消化的肽组分，任选地其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包括嵌合受体和/或重组抗原受体。

75.根据实施方案1-76中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。

76.根据实施方案75所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或者肿瘤或癌症。

77.根据实施方案75或实施方案76所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。

78.根据实施方案75-77中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。

79.根据实施方案1-78中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包括功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。

80.根据实施方案1-79中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。

81.根据实施方案1-80中任一项所述的方法，其中所述样品是选自以下的细胞组合物或其子集的样品：(1)所述细胞组合物中的细胞；(2)所述细胞组合物中的CD3+细胞；(3)所述细胞组合物中的CD4+T细胞；(4)所述细胞组合物中的CD8+T细胞；(5)所述细胞组合物中的重组受体+细胞；(6)所述细胞组合物中的重组受体+CD3+细胞；(7)所述细胞组合物中的重组受体+CD8+细胞；或(8)所述细胞组合物中的重组受体+CD4+细胞，任选地其中所述重组受体是CAR。

82.一种工程化细胞组合物，其中所述工程化细胞组合物是通过过程产生的，其中在由所述过程产生的多种工程化细胞组合物的平均质谱图谱之中，使用质谱技术获得的来自所述工程化细胞组合物或其子集的样品的质谱图谱变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，或者依据这种平均，变化不超过在所述质谱图谱的数据组分之中的一个标准偏差。

83.根据实施方案82所述的工程化细胞组合物，其中所述工程化细胞组合物包含重组受体。

84.根据实施方案82或实施方案83所述的工程化细胞组合物，其中所述工程化细胞组合物包含免疫细胞。

85.根据实施方案84所述的工程化细胞组合物，其中所述用于产生所述工程化细胞组合物的过程包括：

(i)从来自受试者的样品选择或分离免疫细胞，从而产生源组合物，任选地其中所述生物样品是白细胞单采术样品、单采术样品或全血样品；

(ii)将所述源组合物的细胞与刺激试剂一起孵育，从而产生刺激组合物，其中所述孵育任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行；

(iii)将编码所述重组受体的核酸引入到所述刺激组合物的免疫细胞中，从而产生转化组合物；以及

(iv)将所述刺激组合物在37℃下培养至少24小时，从而产生所述测试工程化细胞组合物，其中所述培养任选地在一种或多种细胞因子的存在下进行。

86.根据实施方案84或实施方案85所述的工程化细胞组合物，其中所述细胞组合物富集了所述免疫细胞。

87.根据实施方案84-86中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述免疫细胞包括淋巴细胞。

88.根据实施方案87所述的工程化细胞组合物，其中所述淋巴细胞包括T细胞或自然杀伤(NK)细胞。

89.根据实施方案88所述的工程化细胞组合物，其中所述淋巴细胞包括T细胞，并且所述T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。

90.根据实施方案84-89中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述免疫细胞是人的。

91.根据实施方案85-90中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述免疫细胞是T细胞、任选CD4+和/或CD8+T细胞，并且所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。

92.根据实施方案91所述的工程化细胞组合物，其中所述刺激试剂包括与TCR复合物的成员特异性结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。

93.根据实施方案92所述的工程化细胞组合物，其中所述一级药剂与CD3特异性结合和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。

94.根据实施方案85-93中任一项所述的工程化细胞组合物，其中刺激试剂包括抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段。

95.根据实施方案92-94中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述一级药剂和/或所述二级药剂存在于固体支持物的表面上，任选地其中所述固体支持物是珠。

96.根据实施方案92-95中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述一级药剂和所述二级药剂存在于包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的可溶性寡聚试剂的表面上。

97.根据实施方案85-96中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述培养在促进所述工程化细胞增殖和/或扩增的条件下进行。

98.根据实施方案82-97中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述样品是通过标记一种或多种表面蛋白、使细胞裂解并分离所述一种或多种蛋白质而从所述工程化细胞组合物加工得到的。

99.根据实施方案98所述的工程化细胞组合物，其还包括消化所述一种或多种分离的蛋白质。

100.根据实施方案98或实施方案99所述的工程化细胞组合物，其中所述消化在能够切割一个或多个肽键的一种或多种蛋白酶的存在下通过蛋白水解进行。

101.根据实施方案100所述的工程化细胞组合物，其中所述一种或多种蛋白酶是或包括胰蛋白酶。

102.根据实施方案98-101中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述一种或多种蛋白质包括细胞表面膜蛋白。

103.根据实施方案98-102中任一项所述的工程化细胞组合物，其中使所述细胞裂解包括在洗涤剂的存在下孵育。

104.根据实施方案55所述的工程化细胞组合物，其中所述洗涤剂是非离子型洗涤剂。

105.根据实施方案104所述的工程化细胞组合物，其中所述洗涤剂是或包含有效量的Triton X-100。

106.根据实施方案105所述的工程化细胞组合物，其中所述洗涤剂是变性洗涤剂。

107.根据实施方案106所述的工程化细胞组合物，其中所述变性洗涤剂是或包含有效量的十二烷基硫酸钠(SDS)。

108.根据实施方案98-107中任一项所述的工程化细胞组合物，其中在使所述细胞裂解之后，所述方法还包括从所述裂解的组合物中去除所述洗涤剂。

109.根据实施方案98-108中任一项所述的工程化细胞组合物，其中标记所述表面蛋白包括对伯胺进行生物素标记。

110.根据实施方案109所述的工程化细胞组合物，其中使用包含亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin

111.根据实施方案82-110中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述质谱技术包括使所述样品经受液相色谱法(LC)，然后经受质谱法。

112.根据实施方案111所述的工程化细胞组合物，其中所述液相色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UHPLC)或超效液相色谱法(UPLC)。

113.根据实施方案111或实施方案112所述的工程化细胞组合物，其中所述液相色谱法是超效液相色谱法(UPLC)。

114.根据实施方案111-113中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述液相色谱法和所述质谱法是联机进行的。

115.根据实施方案111-114中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述液相色谱法选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水相互作用色谱法(HILIC)。

116.根据实施方案111-115中任一项所述的工程化细胞组合物，其中执行所述质谱法的质谱仪包括四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。

117.根据实施方案116所述的工程化细胞组合物，其中所述质谱仪包括离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。

118.根据实施方案117所述的工程化细胞组合物，其中所述质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。

119.根据实施方案82-118中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述数据组分选自MS离子信息、总离子色谱仪(TIC)或其一部分、提取离子色谱图(XIC)或其一部分、肽MS离子信号峰、蛋白质MS离子信号峰、肽鉴定信息、蛋白质鉴定信息、定性信息、定量信息、结构信息、翻译后修饰。

120.根据实施方案119所述的工程化细胞组合物，其中所述数据组分是XIC或其一部分，其中所述XIC或其一部分是基于所述重组受体的一种或多种肽组分的一个或多个理论或已知m/z值。

121.根据实施方案120所述的工程化细胞组合物，其中所述一种或多种肽组分是经蛋白水解切割或消化的肽组分，任选地其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

122.根据实施方案82-121中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述重组受体是或包括嵌合受体和/或重组抗原受体。

123.根据实施方案82-122中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。

124.根据实施方案123所述的工程化细胞组合物，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或者肿瘤或癌症。

125.根据实施方案123或实施方案124所述的工程化细胞组合物，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。

126.根据实施方案123-125中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。

127.根据实施方案82-126中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述重组受体是或包括功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。

128.根据实施方案8中任一项所述的工程化细胞组合物，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。

129.一种评价在产生工程化细胞组合物的过程中使用的试剂的方法，所述方法包括：

(a)将来自第一试剂的样品的质谱图谱与所述试剂的参考质谱图谱进行比较，其中所述质谱图谱是使用质谱技术获得的；以及

(c)鉴定与所述参考质谱图谱相比，在所述测试质谱图谱中至少一种数据组分的存在、不存在或水平方面的一个或多个差异，从而鉴定所述试剂的质谱图谱。

130.根据实施方案129所述的方法，其中所述参考质谱图谱是来自参考试剂的样品的质谱图谱，或者是来自多种不同批次的所述试剂的若干样品的平均质谱图谱。

131.根据实施方案130所述的方法，其中所述参考质谱图谱是多个不同批次的所述试剂的样品的平均质谱图谱。

132.根据实施方案131所述的方法，所述方法还包括确定所述样品的质谱图谱相对于所述平均质谱图谱的变化的存在、不存在或水平。

133.根据实施方案132所述的方法，所述方法还包括：如果在所述多个不同批次的试剂之中，所述质谱图谱的变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％，或者依据这种平均，变化不超过在所述质谱图谱的数据组分之中的一个标准偏差，则选择所述试剂。

134.根据实施方案129-133中任一项所述的方法，其中所述质谱技术包括使所述样品经受液相色谱法(LC)，然后经受质谱法。

135.根据实施方案134所述的方法，其中所述液相色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UHPLC)或超效液相色谱法(UPLC)。

136.根据实施方案135或实施方案135所述的方法，其中所述液相色谱法是超效液相色谱法(UPLC)。

137.根据实施方案134-136中任一项所述的方法，其中所述液相色谱法和所述质谱法是联机进行的。

138.根据实施方案134-137中任一项所述的方法，其中所述液相色谱法选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水相互作用色谱法(HILIC)。

139.根据实施方案134-138中任一项所述的方法，其中执行所述质谱法的质谱仪包括四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。

140.根据实施方案139所述的方法，其中所述质谱仪包括离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。

141.根据实施方案140所述的方法，其中所述质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。

142.根据实施方案129-410中任一项所述的方法，其中所述数据组分选自MS离子信息、总离子色谱仪(TIC)或其一部分、提取离子色谱图(XIC)或其一部分、肽MS离子信号峰、蛋白质MS离子信号峰、肽鉴定信息、蛋白质鉴定信息、定性信息、定量信息、结构信息、翻译后修饰。

143.根据实施方案129-142中任一项所述的方法，其中所述试剂是能够刺激细胞组合物、任选T细胞组合物的细胞中的信号的试剂。

144.根据实施方案143所述的方法，其中所述细胞组合物的细胞包含重组受体、任选嵌合抗原受体。

145.根据实施方案144所述的方法，其中所述试剂能够刺激或诱导所述细胞组合物的细胞中的重组受体依赖性活性。

VI.实施例

以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析在用于产生含有嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞的T细胞组合物的示例性工程化过程之前或之后收集的细胞的表面蛋白表达。通过基于免疫亲和力的富集从人白细胞单采术样品中获得富集了CD4+或CD8+T细胞的初始源T细胞组合物，并对其进行低温冷冻。随后将CD4+或CD8+T细胞解冻，用抗CD3/抗CD28顺磁珠激活，并用编码抗CD19 CAR的病毒载体转导，然后对工程化细胞组合物进行扩增和冷冻保存。抗CD19 CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv、Ig源间隔子、人CD28源跨膜结构域、人4-1BB源细胞内信号传导结构域和人CD3ζ源信号传导结构域。

对初始源和CAR+工程化细胞组合物二者的T细胞样品进行细胞表面蛋白分离后获得的肽样品进行LC-MS/MS分析。简言之，将来自冷冻保存的初始源和CAR+工程化细胞组合物的含有约15-150x10

然后对每个初始源或工程化细胞组合物样品进行如下加工：使用10,000标称分子量极限(NMWL)过滤器通过透析以去除表面活性剂并且缓冲液交换为400μL UA缓冲液(0.1MTris-HCl(pH 8.3)中的8M尿素)以减少二硫键，然后添加100μL的50mM碘乙酰胺以使半胱氨酸上的游离硫醇基团烷基化。在用100μL的50mM碳酸氢铵/3M尿素洗涤过滤器接着离心若干次之后，收集样品。在一些情况下，在执行上文所述的过滤程序之前将样品合并。

然后将所得样品在37℃下进行胰蛋白酶消化过夜。孵育后，通过添加10％三氟乙酸(TFA)来猝灭每个消化。

然后在质谱分析之前，根据需要(基于使用液相色谱法对肽丰度进行的初步评估)将初始源和工程化细胞组合物样品浓缩。在一些情况下，在上文所述的浓缩程序之前将样品合并。使用与液相色谱仪耦合的混合四极杆轨道阱质谱仪，通过串联质谱法分析每个样品。使用依赖于数据的采集技术(选择20种最丰富的离子)采集质谱数据。质谱仪设置包括：MS

使用ProteomeDiscover软件(ThermoScientific v2.1)与从UNIPROT获得的人蛋白质组数据库和从全局蛋白质组机器(Global Proteome Machine)获得的不定(Adventitious)蛋白质数据库的公共储存库一起分析从上文所述的每个LC-MS/MS分析获得的数据集。搜索算法设置包括：胰蛋白酶肽；最大缺失切割2；最小肽长度6；前体质量公差10ppm；碎片质量公差0.02Da；用于甲硫氨酸氧化和赖氨酸生物素标记的动态修饰；用于半胱氨酸羧甲基化的静态修饰；使用具有1％或更少FDR的诱饵；以及1％或更少的错误发现率(FDR)。

使用5ppm提取离子色谱图和可视MS

图1A是来自初始源细胞组合物样品的LC-MS/MS分析的总离子色谱图(TIC)(下半部)和来自相应工程化细胞组合物样品的LC-MS/MS分析的TIC(上半部)的示例性图像。如图1A所示，观察到峰的差异，其对应于初始源与工程化细胞组合物之间细胞表面蛋白的肽离子的差异。使用上文所述的LC-MS/MS技术，共鉴定出1406种细胞表面蛋白，包括源细胞组合物所特有的397种蛋白质和工程化细胞组合物所特有的223种蛋白质。

这些数据与LC-MS/MS分析区分在基因工程化过程的不同阶段收集的T细胞组合物的表面蛋白表达谱的能力一致。

通过使用CAR的组分的理论胰蛋白酶肽质量(从理论上讲公差为5ppm)分离与抗CD19 CAR缔合的离子而产生提取离子色谱图(XIC)，并在初始源和工程化T细胞组合物二者中进行比较。图1B描绘了初始源细胞组合物样品(下半部)和相应CAR+工程化细胞组合物样品(上半部)的示例性组合XIC图像。鉴定出与CAR的细胞外部分和细胞内部分相关的肽峰，其中峰P1至P19代表细胞外区域。与不含有CAR表达细胞的初始源细胞相比，在从包含CAR表达T细胞的工程化细胞组合物获得的XIC中观察到峰的差异(图1B)。在从初始源细胞获得的XIC中观察到一些与抗CD19 CAR相关的峰，这与CAR的组分也表达为内源蛋白的一部分(例如CD3ζ信号传导结构域)一致。

已经观察到，在一些情况下，在用于产生工程化T细胞组合物的过程(在其他方面类似的细胞工程化过程)中使用的一种或多种原料或一种或多种试剂或者不同批次的一种或多种原料或一种或多种试剂的储存或处理条件的变化可能在最终工程化组合物中与特定参数相关，所述特定参数与工程化T细胞产物的活性改变或变化相关。

通过LC-MS/MS分析不同批次的示例性原料以评估批次之间是否存在差异，所述示例性原料在用于产生CAR+工程化T细胞组合物的过程中使用并且由于批次之间和之中的变异性而被鉴定为在所述过程中需要滴定的试剂。已知或怀疑所述原料含有三种不同的蛋白质。试剂的样品取自三个不同的制造批次，每个批次均符合供应商的放行标准。从试剂分离蛋白质，并通过LC-MS/MS以与实施例1中所述类似的过程对其进行分析。

通过反相色谱法分离蛋白质。如图2所示，在三个不同批次之间观察到不同的图谱，这与批次之间蛋白质的相对量或特性的差异一致。然而，仅LC分析证明了若干种蛋白质的共洗脱。为了区分共洗脱的蛋白质，预先选择质荷比(m/z)并在分析中检测(图2，左上角)。如图2的插图所示，不同的共洗脱蛋白质能够被单独检测到，这证明了此方法用于鉴定含有其量或特性(例如翻译后修饰)可能不同的蛋白质的试剂批次之中的差异的实用性。

进一步分析了三种不同滴定水平的原始试剂样品中的两种蛋白质，这两种蛋白质被怀疑最有可能影响用于产生工程化T细胞组合物的过程。定量每种滴定样品中这两种蛋白质中每一种的相对百分比。如图3所示，通过质谱法分析试剂组分表明，试剂的第二蛋白质(加上第二蛋白质的翻译后修饰，PTM)的相对百分比与第三蛋白质的相对百分比逆相关。这些结果与CAR T细胞工程化过程中第三蛋白质和第二蛋白质的建议组合效果一致，如在不同滴定水平下其相对量的逆相关所示。一并考虑，这些结果与使用质谱法结合蛋白质组分对工程化过程的生物学相关性的知识来帮助鉴定试剂的批次之间的变异性以及对制造过程的潜在影响是一致的。

为了绘制细胞组合物的细胞表面N-连接型聚糖图谱，将含有表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的示例性冷冻保存T细胞组合物单独解冻，在加热至37℃的细胞培养基中以1:10稀释，并且将1-2.5x10

将转移的细胞样品离心并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，然后用约198μL PBS重构细胞悬浮液。将约2μL PNG酶F PRIME(N-Zyme Scientifics；可获自Bulldog Bio，目录号NZPP050)添加到含有整个完整细胞的细胞悬浮液中，然后伴随轻轻混合在37℃下孵育30分钟。为了获得释放的表面N-聚糖，将细胞悬浮液离心并将上清液收集到干净的管中，将所述管立即通过真空离心蒸发至干燥。

添加5μL由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)氨基甲酸酯标记基团、喹诺酮荧光团和碱性叔胺(例如Glycoworks

将聚糖使用HILIC液相色谱法分离，并通过荧光(Waters ACQUITY I-Class)(HILIC-FLR)和串联质谱法(正电喷雾电离(ESI)，Q-Exactive

如图4A所示，带注释的HILIC-FLR色谱图揭示到抗CD3/抗CD28激活的CD3+细胞的细胞表面N-聚糖图是聚糖类型的复杂混合物。

对于串联质谱法(MS/MS)，在质谱的第一阶段将颗粒通过ESI电离并依据其质荷比分离。图4B描绘了使用5ppm质量公差从处于+3带电状态的示例性A3S3F N-聚糖的质谱的第一阶段产生的提取离子色谱图(XIC)。观察到具有相同同位素分布的N-聚糖的多个色谱峰，这与聚糖结构的单糖单位之间可能存在的连接差异是一致的。在第一阶段之后，使聚糖经历碎片化，并且在MS/MS的第二阶段中将所得的碎片分离并进行测量。以15的归一化碰撞能量(NCE)通过高能量碰撞解离(HCD)破碎的示例性N-聚糖A3S4F的MS/MS碎片化示于图4C中。结合第一阶段的高分辨率MS数据，A3S4F的碎片化证实了在规范末端半乳糖残基处以及在同一触角的n-乙酰葡糖胺残基上的唯一位点处存在n-乙酰神经氨酸连接(图4C，框)。这些结果证明，根据通过HILIC-FLR进行的分离和检测，MS/MS结合高分辨率MS数据可以鉴定聚糖结构，包括独特的聚糖结构。

分离第一细胞组合物和第二细胞组合物的表面N-连接型聚糖，并将其如实施例3中所述类似地标记。与实施例3中所述类似，将N-聚糖用HILIC液相色谱法分离，并通过荧光和质谱法(即通过HILIC-ESI-MS/MS)检测，以进行相对定量和鉴定。比较第一细胞组合物和第二细胞组合物的所得N-聚糖图谱，以鉴定单独N-聚糖表达的差异。由于特定糖基转移酶基因与N-聚糖连接有关，因此所述结果与从第一组合物和第二组合物的样品获得的基因组数据(如通过RNA-seq或使用测序的转座酶可及染色质测定(ATAC-seq)得到的)相关。所述相关性鉴定了伴随表面N-聚糖表达的特定变化的糖基转移酶基因表达的变化。

本发明在范围上并不旨在受限于具体公开的实施方案，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。此类变化可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践，并且旨在落入本公开文本的范围内。

序列表

<110> 朱诺治疗学股份有限公司

<120> 对工程化细胞组合物进行质谱分析的方法

<130> 735042019040

<140> 尚未分配

<141> 同时随同提交

<150> 62/729,985

<151> 2018-09-11

<160> 61

<170> Windows 4.0版的FastSEQ

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 间隔子 (IgG4铰链)

<400> 1

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 间隔子（IgG4铰链）

<400> 2

gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 铰链-CH3间隔子

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg

1 5 10 15

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

20 25 30

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

35 40 45

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

50 55 60

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

85 90 95

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

100 105 110

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

115

<210> 4

<211> 229

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 铰链-CH2-CH3间隔子

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 5

<211> 282

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> IgD-铰链-Fc

<400> 5

Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala

1 5 10 15

Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys

35 40 45

Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln

65 70 75 80

Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly

85 90 95

Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val

100 105 110

Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly

115 120 125

Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro

145 150 155 160

Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys

165 170 175

Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser

180 185 190

Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu

195 200 205

Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro

210 215 220

Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser

225 230 235 240

Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr

245 250 255

Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg

260 265 270

Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His

275 280

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A

<400> 6

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 7

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> tEGFR

<400> 7

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 8

<211> 27

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 8

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 9

<211> 66

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 9

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val

65

<210> 10

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 10

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 11

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD28

<400> 11

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 12

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 4-1BB

<300>

<308> UniProt Q07011.1

<309> 1995-02-01

<400> 12

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD3ζ

<400> 13

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD3ζ

<400> 14

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> CD3ζ

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 335

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> tEGFR

<400> 16

Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile

20 25 30

Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe

35 40 45

Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr

50 55 60

Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn

65 70 75 80

Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg

85 90 95

Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile

100 105 110

Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val

115 120 125

Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp

130 135 140

Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn

145 150 155 160

Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu

165 170 175

Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser

180 185 190

Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu

195 200 205

Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln

210 215 220

Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly

225 230 235 240

Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro

245 250 255

His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr

260 265 270

Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His

275 280 285

Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro

290 295 300

Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala

305 310 315 320

Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

325 330 335

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A

<400> 17

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 18

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A

<400> 18

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A

<400> 19

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2A

<400> 20

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 21

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F2A

<400> 21

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<220>

<221> 重复序列

<222> (5)...(9)

<223> SGGGG重复5次

<400> 22

Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro

1 5 10

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 23

Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 24

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMCSFRα链信号序列

<400> 24

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 25

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GMCSFRα链信号序列

<400> 25

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 26

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8α信号肽

<400> 26

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 27

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 28

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 29

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 29

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro

1 5 10 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

20 25 30

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro

35 40 45

Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 30

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<220>

<221> 变体

<222> 1

<223> Xaa1 = 甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸

<220>

<221> 变体

<222> 4

<223> Xaa4 = 半胱氨酸或苏氨酸

<400> 31

Xaa Pro Pro Xaa Pro

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 32

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 33

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 34

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 34

Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 CDR L1

<400> 35

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 CDR L2

<400> 36

Ser Arg Leu His Ser Gly Val

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 CDR L3

<400> 37

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly

1 5

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 CDR H1

<400> 38

Asp Tyr Gly Val Ser

1 5

<210> 39

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 CDR H2

<400> 39

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 CDR H3

<400> 40

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

1 5

<210> 41

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 VH

<400> 41

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 VL

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 43

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 scFv

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 CDR L1

<400> 44

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala

1 5 10

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 CDR L2

<400> 45

Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 CDR L3

<400> 46

Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 CDR H1

<400> 47

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 CDR H2

<400> 48

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 49

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 CDR H3

<400> 49

Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 VH

<400> 50

Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 VL

<400> 51

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 52

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 53

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SJ25C1 scFv

<400> 53

Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys

145 150 155 160

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn

180 185 190

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe

210 215 220

Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys Arg

245

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 HC-CDR3

<400> 54

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 LC-CDR2

<400> 55

His Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMC63 LC-CDR3

<400> 56

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 57

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码scFv的序列

<400> 57

gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60

atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120

gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180

cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240

gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300

ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360

ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420

cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480

tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540

accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600

agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660

gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720

gtgaccgtga gcagc 735

<210> 58

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 58

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 59

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 人IgG2 Fc

<300>

<308> Uniprot P01859

<309> 1986-07-21

<400> 59

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 60

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 人IgG4 Fc

<300>

<308> Uniprot P01861

<309> 1986-07-21

<400> 60

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 61

<211> 354

<212> PRT

<213> 脑膜炎脓毒性黄杆菌（Flavobacterium meningosepticum）

<220>

<223> PNG酶F

<400> 61

Met Arg Lys Leu Leu Ile Phe Ser Ile Ser Ala Tyr Leu Met Ala Gly

1 5 10 15

Ile Val Ser Cys Lys Gly Val Asp Ser Ala Thr Pro Val Thr Glu Asp

20 25 30

Arg Leu Ala Leu Asn Ala Val Asn Ala Pro Ala Asp Asn Thr Val Asn

35 40 45

Ile Lys Thr Phe Asp Lys Val Lys Asn Ala Phe Gly Asp Gly Leu Ser

50 55 60

Gln Ser Ala Glu Gly Thr Phe Thr Phe Pro Ala Asp Val Thr Thr Val

65 70 75 80

Lys Thr Ile Lys Met Phe Ile Lys Asn Glu Cys Pro Asn Lys Thr Cys

85 90 95

Asp Glu Trp Asp Arg Tyr Ala Asn Val Tyr Val Lys Asn Lys Thr Thr

100 105 110

Gly Glu Trp Tyr Glu Ile Gly Arg Phe Ile Thr Pro Tyr Trp Val Gly

115 120 125

Thr Glu Lys Leu Pro Arg Gly Leu Glu Ile Asp Val Thr Asp Phe Lys

130 135 140

Ser Leu Leu Ser Gly Asn Thr Glu Leu Lys Ile Tyr Thr Glu Thr Trp

145 150 155 160

Leu Ala Lys Gly Arg Glu Tyr Ser Val Asp Phe Asp Ile Val Tyr Gly

165 170 175

Thr Pro Asp Tyr Lys Tyr Ser Ala Val Val Pro Val Ile Gln Tyr Asn

180 185 190

Lys Ser Ser Ile Asp Gly Val Pro Tyr Gly Lys Ala His Thr Leu Gly

195 200 205

Leu Lys Lys Asn Ile Gln Leu Pro Thr Asn Thr Glu Lys Ala Tyr Leu

210 215 220

Arg Thr Thr Ile Ser Gly Trp Gly His Ala Lys Pro Tyr Asp Ala Gly

225 230 235 240

Ser Arg Gly Cys Ala Glu Trp Cys Phe Arg Thr His Thr Ile Ala Ile

245 250 255

Asn Asn Ala Asn Thr Phe Gln His Gln Leu Gly Ala Leu Gly Cys Ser

260 265 270

Ala Asn Pro Ile Asn Asn Gln Ser Pro Gly Asn Trp Ala Pro Asp Arg

275 280 285

Ala Gly Trp Cys Pro Gly Met Ala Val Pro Thr Arg Ile Asp Val Leu

290 295 300

Asn Asn Ser Leu Thr Gly Ser Thr Phe Ser Tyr Glu Tyr Lys Phe Gln

305 310 315 320

Ser Trp Thr Asn Asn Gly Thr Asn Gly Asp Ala Phe Tyr Ala Ile Ser

325 330 335

Ser Phe Val Ile Ala Lys Ser Asn Thr Pro Ile Ser Ala Pro Val Val

340 345 350

Thr Asn