包含替代性自噬诱导剂的紫外线引发性炎症抑制剂

技术领域

本发明涉及包含诱导替代性自噬的药剂作为有效成分的紫外线引发性炎症的抑制剂。另外，本发明也涉及替代性自噬诱导剂、和以替代性自噬活性为指标的紫外线引发性炎症抑制剂的筛选方法、和针对人皮肤中的紫外线引发性炎症的抵抗力的评价方法。

背景技术

细胞质成分(细胞器、细胞质蛋白质等)在细胞中的分解和再生机制存在负责选择性的蛋白质分解的泛素-蛋白酶体系统、和原则上为非选择性的被称为本体降解系统的利用自噬的机制。自噬也被称为自体吞噬作用，能够通过双层膜(隔离膜)包围供分解的细胞质成分，接着在封闭隔离膜后与溶酶体融合，由此分解作为内容物的细胞质成分。自噬被判明有助于正常时的细胞的新陈代谢，除此以外还有助于分解在暴露于某种应激的情况下在细胞质内过量产生的蛋白质和/或异常蛋白质，具有各种各种的生理功能。例如作为被认为与自噬相关的疾病，报告了癌、神经障碍疾病(肌肉萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病等)、肝炎(急性肝炎、慢性肝炎)、肝硬化、传染病、免疫异常等等，进行了期待通过调节自噬功能来针对所述疾病的治疗效果的药品例如抗癌剂、抗痴呆药和神经退行性疾病治疗药等的开发。

通过开展关于自噬的分子机制的研究，鉴定了30余种与自噬有关的分子，在这些分子中Atg5、Atg7、LC3等被认为对于自噬的执行是必须的。认为LC3是在由细胞质合成后受到Atg7等加工，介由由Atg5等构成的复合物与隔离膜结合。然而，根据近年的研究，报告了存在不需要这些分子的自噬(非专利文献1)，将这些自噬与通用型的Atg5/Atg7依赖性的自噬(有时也简称为Atg5依赖性自噬)区别称为替代性自噬或非Atg5/Atg7依赖性自噬。除了参与通用型的Atg5/Atg7依赖性自噬的Ulk1和Beclin1，替代性自噬还由仅参与替代性自噬的Rab9控制。由于替代性自噬通过细胞应激而诱导，所以认为如果该机制失灵，则会诱发癌等，从而开发出利用替代性自噬的抗癌剂(专利文献1)。另外，通过使用敲除了与Atg5依赖性自噬途径有关的Atg5的小鼠的研究，显示出Atg5依赖性自噬途径会改善作为炎症疾病之一的动脉粥样硬化的发病。另一方面，报告了在使Beclin1杂合性缺损的情况下，动脉粥样硬化的发病没有变化，但通过Atg5的敲除则会促进炎症(非专利文献2)。另外，报告了通用型的自噬会抑制角质形成细胞的炎症(非专利文献4)。非专利文献4中，显示了在敲减了Atg5的角质形成细胞中，在由MALP-2诱导炎症的情况下，作为炎症性细胞因子的TNF-α和IL-6比对照(非Atg5敲减)大幅增加。这样，作为通用型自噬的Atg5依赖性自噬与炎症的关系部分清楚了，但替代性自噬与炎症的关联仍未清楚。

另一方面，紫外线是具有紫外区域的波长的电磁波，分成比约320nm长的长波长区域紫外线(UV-A)、约320～约280nm的中波长区域紫外线(UV-B)、和比约280nm短的短波长区域紫外线(UV-C)。这些之中UV-C被臭氧层吸收，因此在到达地上的太阳光通常不含有，UV-A占到达地上的紫外线的约95％，UV-B占约5％。已知紫外线对生物体会带来黑色素色素生成、DNA损伤、胶原和/或弹性素等真皮层中的弹性纤维变性、活性氧生成等各种各样的不良影响，在美容方面众所周知会带来斑、皱纹、下垂、肌肤褐色化、皮肤老化等各种各样的不良影响。紫外线损伤主要能够分成急性损伤和慢性损伤，作为急性损伤，可以举出太阳灼伤(晒伤、晒黑)、紫外线角膜炎、免疫功能降低等，作为慢性损伤，可以举出皱纹、斑、皮肤癌、白内障等。由紫外线产生的炎症是所述的急性损伤和/或慢性损伤的原因之一，抑制紫外线引发的炎症对于预防和治疗紫外线损伤是重要的。要求阐明紫外线引发的炎症机理，希望按照这样阐明的紫外线引发的炎症机理，探索出抑制炎症的物质的方法。

如上所述，替代性自噬是近年来新发现的自噬途径，关于其对生理机制的影响、对疾病的参与进行了研究，但仍未获得足够的见解。特别是与紫外线引发性炎症的相关性完全不清楚。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/118842号

非专利文献

非专利文献1：Yuya Nishida,et al.,Nature 461,654-658

非专利文献2：Babak Razani et al.,Cell Metabolism 2012,15(4),534-544

非专利文献3：Shaun Steele et al.,PLOS Pathog 2013,vol.9,Issue 8,e1003562

非专利文献4：Hye-Mi Lee et al.,The Journal of Immunology(2011)186(2),1248-58

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于现有技术中的课题而完成的，以阐明紫外线引发性炎症机理的端倪、并且提供该紫外线引发性炎症的抑制剂作为目的。

用于解决课题的方法

本发明者们对皮肤炎症机理进行了深入研究，结果首次发现，非Atg5/Atg7依赖性自噬选择性地有助于减轻由作为皮肤炎症的一个原因的紫外线产生的炎症。具体而言，发现通过在皮肤培养细胞中诱导自噬，能够减轻由紫外线产生的皮肤炎症。对于该紫外线引发性炎症与自噬的关系进一步开展研究后，弄清楚了不是通过作为自噬的代表性途径的Atg5/Atg7依赖性自噬，而是通过非Atg5/Atg7依赖性自噬，而能够减轻由紫外线产生的皮肤炎症，从而完成了本发明。所以本发明涉及以下的发明。

[1]紫外线引发性炎症的抑制剂，以替代性自噬诱导剂为有效成分。

[2]根据项目1所述的抑制剂，所述紫外线引发性炎症是紫外线引发性皮肤炎症。

[3]根据项目2所述的抑制剂，所述抑制剂是皮肤外用剂。

[4]根据项目1～3中任一项所述的抑制剂，所述替代性自噬诱导剂是选自毛叶香茶菜提取物、野芝麻提取物、野燕麦提取液、芍药提取物、山茶籽提取物、保加利亚玫瑰水、向日葵油、莽吉柿提取物、辣木提取物和虎耳草提取物中的至少一种。

[5]根据项目1～3中任一项所述的抑制剂，所述替代性自噬诱导剂能够选择性地诱导替代性自噬。

[6]根据项目5所述的抑制剂，所述替代性自噬诱导剂是毛叶香茶菜提取物。

[7]紫外线引发性炎症的抑制剂的筛选方法，以替代性自噬活性为指标。

[8]根据项目7所述的筛选方法，替代性自噬活性通过Rab9的基因表达量或蛋白质的量进行测定。

[9]根据项目7所述的筛选方法，通过在通用型自噬因子不表达株中测定自噬活性，从而进行。

[10]根据项目9所述的评价方法，自噬活性的测定通过选自Beclin1、Ulk1和Rab9中的一种以上的基因表达或蛋白质的量进行测定。

[11]根据项目9所述的筛选方法，自噬活性的测定通过自噬泡的检测来进行。

[12]对紫外线损伤的抵抗力的评价方法，以皮肤中的替代性自噬活性为指标。

[13]根据项目12所述的评价方法，替代性自噬活性通过选自Beclin1、Ulk1和Rab9中的一种以上的基因表达或蛋白质的量进行测定。

[14]根据项目13所述的评价方法，替代性自噬活性通过Rab9的基因表达或蛋白质的量进行测定。

[15]根据项目12～14中任一项所述的评价方法，所述紫外线损伤是紫外线引发性皮肤炎症。

[16]紫外线引发性炎症的抑制或治疗方法，包括将替代性自噬诱导剂的有效量对需要紫外线引发性炎症的对象给药。

[17]根据项目16所述的方法，所述紫外线引发性炎症是紫外线引发性皮肤炎症。

[18]根据项目17所述的方法，将所述替代性自噬诱导剂经皮给药。

[19]根据项目16～18中任一项所述的方法，所述替代性自噬诱导剂是选自毛叶香茶菜提取物、野芝麻提取物、野燕麦提取液、芍药提取物、山茶籽提取物、保加利亚玫瑰水、向日葵油、莽吉柿提取物、辣木提取物和虎耳草提取物中的至少一种。

[20]根据项目16～18中任一项所述的方法，所述替代性自噬诱导剂能够选择性地诱导替代性自噬。

[21]根据项目20所述的方法，所述替代性自噬诱导剂是毛叶香茶菜提取物。

[22]替代性自噬诱导剂，用于在抑制或治疗紫外线引发性炎症中使用的。

[23]根据项目22所述的替代性自噬诱导剂，所述紫外线引发性炎症是紫外线引发性皮肤炎症。

[24]根据项目23所述的替代性自噬诱导剂，以皮肤外用的方式使用。

[25]根据项目22～24中任一项所述的替代性自噬诱导剂，所述替代性自噬诱导剂是选自毛叶香茶菜提取物、野芝麻提取物、野燕麦提取液、芍药提取物、山茶籽提取物、保加利亚玫瑰水、向日葵油、莽吉柿提取物、辣木提取物和虎耳草提取物中的至少一种。

[26]根据项目22～24中任一项所述的替代性自噬诱导剂，所述替代性自噬能够选择性地诱导替代性自噬。

[27]选自毛叶香茶菜提取物、野芝麻提取物、野燕麦提取液、芍药提取物、山茶籽提取物、保加利亚玫瑰水、向日葵油、莽吉柿提取物、辣木提取物和虎耳草提取物中的至少一种提取物，用于介由诱导替代性自噬而在紫外线引发性炎症的抑制或治疗中使用。

[28]毛叶香茶菜提取物，用于介由选择性地诱导替代性自噬在紫外线引发性炎症的抑制或治疗中使用。

[29]替代性自噬诱导剂用于制造紫外线引发性炎症的治疗/抑制剂的用途。

[30]根据项目29所述的用途，所述紫外线引发性炎症是紫外线引发性皮肤炎症。

[31]根据项目30所述的用途，所述抑制剂是皮肤外用剂。

[32]根据项目29～31中任一项所述的用途，所述替代性自噬诱导剂包含选自毛叶香茶菜提取物、野芝麻提取物、野燕麦提取液、芍药提取物、山茶籽提取物、保加利亚玫瑰水、向日葵油、莽吉柿提取物、辣木提取物和虎耳草提取物中的至少一种。

[33]根据项目29～31中任一项所述的用途，所述替代性自噬诱导剂能够选择性地诱导替代性自噬。

[34]根据项目33所述的用途，所述替代性自噬诱导剂是毛叶香茶菜提取物。

发明的效果

能够通过诱导自噬中特别是替代性自噬来抑制紫外线引发性炎症。紫外线引发性炎症是急性损伤和/或慢性损伤的原因之一，通过减轻紫外线引发性炎症，而可以实现紫外线损伤的减轻。另外，由于替代性自噬参与紫外线引发性炎症的，因此通过以替代性自噬活性为指标，也能够筛选紫外线引发性炎症的抑制剂，和/或评价对紫外线引发性炎症的抵抗力。

附图说明

图1：图1A是显示通过添加作为自噬抑制剂的3-MA从而紫外线诱导性的IL-1β产生增加的图。图1B是显示通过添加作为自噬诱导剂的雷帕霉素从而紫外线诱导性的IL-1β产生被抑制的图。

图2：图2A是显示通过将针对Atg5的siRNA转入细胞从而Atg5表达被抑制的图。图2B是显示通过将针对Atg7的siRNA转入细胞从而Atg7表达被抑制的图。图2C是显示通过将针对Beclin1的siRNA转入细胞从而Beclin1表达被抑制的图。

图3：图3A是显示在转入了针对Atg5的siRNA的细胞中，紫外线诱导性的IL-1β产生没有变化的图。图3B是显示在转入了针对Atg7的siRNA的细胞中，紫外线诱导性的IL-1β产生没有变化的图。图3C是显示在转入针对Beclin1的siRNA的细胞中，紫外线诱导性的IL-1β产生有显著性差异地增加的图。

具体实施方式

本发明的紫外线引发性炎症的抑制剂包含替代性自噬诱导剂。在本发明中被抑制的炎症是由紫外线引起的炎症，更优选为紫外线引发性皮肤炎症。

炎症是以发红、发热、肿胀、以及疼痛为特征的症状，由微生物感染、异物侵入、重金属暴露、紫外线照射等外来侵袭引起，除此以外，也由从坏死细胞等释放的内源刺激物质引起。炎症是可以在生物体的一切组织中产生的症状，根据组织，其原因和/或炎症机理不同。特别是皮肤组织暴露在生物体的外部，作为形成外界与生物体的边界的屏障起作用。已知如果皮肤的屏障功能降低，则会由各种各样的外来侵袭导致经皮致敏，它成为皮肤炎和/或过敏性疾病等皮肤炎症的原因。已知在皮肤屏障的形成中，角质细胞中表达的丝聚蛋白担当重要的作用。报告了丝聚蛋白的突变也与作为炎症性疾病之一的特应性皮肤炎的发病有关。这样皮肤炎症具有与生物体内的组织中的炎症不同的特征性机理。本发明者们发现本发明的替代性自噬途径在炎症中特别是在紫外线引发性炎症中发挥抑制性的作用(实施例、图1和3)。另一方面，本发明者们也发现以往据说是有助于组织炎症的Atg5依赖性自噬途径没有参与紫外线引发性炎症(实施例、图3)。由于在非专利文献4中显示对于经MALP-2诱导的皮肤炎症，Atg5依赖性自噬发挥抑制性的作用，因此不能预测在紫外线引发性炎症中Atg5依赖性自噬途径没有参与。众所周知虽然皮肤炎症与紫外线引发性炎症在最终伴随着炎症性细胞因子的产生这点上是共通的，但其发生机理不同。通过本发明者们的实验首次启示了皮肤炎症与紫外线引发性炎症对于控制机理也是不同的。

在本发明中，紫外线可以指UV-A、UV-B、以及UV-C中的任意者，但从到达地上对皮肤引起炎症的观点考虑，特别优选指UV-A和UV-B。已知UV-A和UV-B都会引起炎症，但可以仅指对炎症贡献高的UV-B。

作为由紫外线引起的炎症带来的症状，可以举出红斑和/或水泡，在重症化的情况下，有时产生湿疹。湿疹在急性期采取红斑、丘疹、小水泡、脓疱、糜烂、结痂、掉皮这样的形态变化，虽然可治愈，但如果急性湿疹没有治愈而慢性化，也有时会产生苔藓化，发生色素沉积。作为由紫外线引起的炎症引发的皮肤疾病，可引起日光性皮炎、光线性唇炎、光接触性皮炎、慢性光敏性皮炎、伯洛克皮炎、光过敏症、光敏性药疹、日光性荨麻疹、色素性干皮症、皮肌炎、卟啉症、糙皮病、慢性光化性皮肤病、多形日光疹、红斑狼疮等疾病。另外，紫外线也可以对眼睛引起炎症，产生紫外线角膜炎，由于这样的炎症，也会产生白内障。因此，本发明的紫外线引发性炎症的抑制剂或替代性自噬诱导剂能够治疗、减轻、抑制、以及预防由炎症引发的上述皮肤疾病和眼疾病，也可以称为这些皮肤疾病和眼疾病的治疗剂、减轻剂、抑制剂以及预防剂。另外，已知皮肤中产生的炎症会促进促黑素细胞激素的分泌，由此也参与皮肤的褐色化和/或斑的形成、和/或由于慢性炎症而助长衰老。因此，本发明的紫外线引发性炎症的抑制剂或替代性自噬诱导剂也可以称为太阳灼伤抑制剂、美白剂、皮肤老化剂。

使用本发明的紫外线引发性炎症抑制剂的对象是需要减少紫外线引发性炎症的对象。以通常的健康人为代表，可以对在室外活动的运动选手和/或操作员、美容上或健康上需要避免太阳灼伤的人、以及患有与上述紫外线损伤相伴的疾病的患者，施与本发明的紫外线引发性炎症的抑制剂。另外，替代性自噬诱导剂可以对替代性自噬活性降低的对象施与。

本发明的紫外线引发性炎症的抑制剂能够抑制由于紫外线照射而在角质形成细胞中分泌增高的选自IL-1β、IL-1α、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TSLP、GM-CSF等中的一种或多种炎性细胞因子、和/或CCL2、CXCL10等趋化因子和/或PGE

所谓替代性自噬，是指不利用自噬相关分子Atg5，而是通过形成自噬小体，进一步溶酶体进行融合，由此分解被摄入到该自噬小体中的细胞内成分的细胞内净化机制。因此，替代性自噬也可以称为非Atg5和/或Atg7依赖性自噬。并不意味着在理论上进行限定，但考虑通过替代性自噬的作用而分解由紫外线影响而变性的异常蛋白质和/或诱发的炎症诱发物质，从而去除炎症的原因。在本说明书中，从与替代性自噬区别的观点考虑，将现有型的自噬、即Atg5和/或Atg7依赖性自噬称为通用型自噬。

所谓替代性自噬诱导剂，只要是能够增强替代性自噬活性的物质，就可以是任意物质。优选能够选择性地增强替代性自噬的物质，但也可以是也非选择性地增强其它自噬的物质。因此，替代性自噬诱导剂可以包含通用型自噬诱导剂，在其它方式中也可以除去通用型自噬的诱导剂。可以将能够同时诱导除替代性自噬以外的自噬(例如通用型自噬)、和替代性自噬的诱导剂叫作替代性自噬非选择性诱导剂，将主要诱导替代性自噬的诱导剂叫作替代性自噬选择性诱导剂。作为替代性自噬选择性诱导剂，可以举出专利文献1中显示的苯并噻吩化合物、和/或非专利文献3中显示的野兔病菌(土拉热弗朗西丝菌，Francisellatularensis)。另外，根据本发明的筛选方法，显示出毛叶香茶菜提取物也是作为替代性自噬选择性诱导剂起作用的物质。作为替代性自噬的非选择性地诱导剂，可以举出雷帕霉素、维拉帕米、可乐定等。根据本发明的筛选方法，显示出毛叶香茶菜提取物、野芝麻提取物、野燕麦提取液、芍药提取物、山茶籽提取物、保加利亚玫瑰水、向日葵油、莽吉柿提取物、辣木提取物、虎耳草提取物是作为替代性自噬非选择性诱导剂起作用的物质。然而，并不意味着将自噬诱导剂限定于这些具体的化合物和/或菌、提取物。

本发明的替代性自噬诱导剂或包含该诱导剂的紫外线引发性炎症的抑制剂能够以减轻紫外线引发性炎症的目的，作为有效成分配合在功能性标示食品、化妆品和/或药品中。作为所配合的化妆品，可以举出防晒、化妆水、美容液、美容霜、晒后护理乳液、防晒油等，只要适用于皮肤，就可以配合在任意的化妆品中。作为药品，可以举出抗炎症用的皮肤外用剂、抗炎症用的口服药剂等。另外，由于发现替代性自噬诱导剂对紫外线引发性炎症有效，因此优选作为能够直接适用于皮肤的皮肤外用剂配合。另外，从出于紫外线损伤减轻抑制的目的使用的观点考虑，也可以将替代性自噬诱导剂配合在用于预防白内障等的滴眼药中。替代性自噬诱导剂或包含该诱导剂的皮肤炎症的抑制剂可以在不损害其效果的范围，根据需要适当配合化妆品和/或药品等中使用的任意配合成分。作为所述任意配合成分，例如可以举出油分、表面活性剂、粉末、色料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、有机硅类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、pH调节剂、中和剂等。作为其它药效成分，可以包含例如抗炎症成分、美白成分等。

本发明还涉及以替代性自噬活性为指标的紫外线引发性炎症抑制剂的筛选方法。该筛选方法包括对培养细胞添加候选药物的工序、和在培养细胞中测定替代性自噬活性的工序。可以在替代性自噬活性比对照增加的情况下，选择候选药物作为紫外线引发性炎症抑制剂或替代性自噬诱导剂。所使用的候选药物可以是任意物质，例如可以使用药品候选化合物库和/或化妆品材料库的物质，不仅化合物，也可以使用混合物和/或提取物等。

作为所使用的培养细胞，可以使用任意细胞，也可以使用确立细胞株、和/或从组织中分离出来培养的原代培养细胞、传代培养细胞。从评价紫外线的影响的观点考虑，可以使用在生物体中受到紫外线影响的细胞、例如皮肤细胞和/或眼细胞。作为皮肤细胞，例如可以是角质细胞、色素细胞和/或真皮成纤维细胞等，作为眼细胞，例如可以是角膜上皮细胞和/或视网膜上皮细胞等。另外，也可以使用将皮肤培养细胞多层培养而得的三维培养皮肤模型。进而在其它方式中，也可以使用不表达通用型自噬因子的至少一种的、通用型自噬因子不表达株作为筛选方法中使用的培养细胞。这样的细胞株可以是通过点突变、同源重组、Crysper-Cas9系统等基因组编辑制作成的基因敲除细胞株，也可以是由转入siRNA而抑制了基因表达的敲减细胞株。通过使用通用型自噬因子不表达株，在使用对替代性自噬没有特异性、通用型自噬也检测到的指标的情况下，也能够筛选替代性自噬的活性诱导剂。作为一例，由于Beclin1和/或Ulk1参与替代性自噬和通用型自噬两者，因此可以通过在通用型自噬因子不表达株中以这些基因表达量或蛋白质的量作为自噬活性的指标，从而筛选诱导替代性自噬的药剂。作为通用型自噬因子不表达株，可以举出Atg5和/或Atg7基因敲除株、Atg5和/或Atg7基因敲减株等作为一例。代替以基因表达量或蛋白质的量作为指标，也可以以在细胞内存在的自噬泡作为自噬活性的指标。自噬泡也称为自噬小体。自噬小体可以在显微镜下观察到，作为一例，可以通过将利用LC等作为标志物来特定。

根据本发明的筛选方法，能够从化妆品材料库中选择下述植物提取物作为紫外线引发性炎症抑制剂或替代性自噬诱导剂：毛叶香茶菜提取物、野芝麻提取物、野燕麦提取液、芍药提取物、山茶籽提取物、保加利亚玫瑰水、向日葵油、莽吉柿提取物、辣木提取物、虎耳草提取物。因此，本发明的一个方式涉及包含选自毛叶香茶菜提取物、野芝麻提取物、野燕麦提取液、芍药提取物、山茶籽提取物、保加利亚玫瑰水、向日葵油、莽吉柿提取物、辣木提取物和虎耳草提取物中的至少一种植物提取物的紫外线引发性炎症抑制剂或者替代性自噬诱导剂。这些提取物也有时具有现有型的自噬诱导活性。另一方面，对于毛叶香茶菜提取物，由于没有现有型自噬诱导活性，但另一方面显示出强的替代性自噬诱导活性，因此能够称为替代性自噬选择性诱导剂。

本发明中使用的各植物的植物体或其提取物是将各个植物体的各种部位(花、穗状花序、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或整株等)直接或干燥后粉碎而制成干燥粉末的物质，或者直接或干燥·粉碎后经溶剂提取而得的物质。考虑叶、根、茎、花作为提取部位，但提取部位不限定于此。

在提取物的情况下，提取中使用的提取溶剂是只要通常提取中使用的溶剂就可以，特别是可以单独或组合使用甲醇、乙醇或1,3-丁二醇等醇类、含水醇类、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，其中，特别优选醇类、含水醇类，特别优选甲醇、乙醇、1,3-丁二醇、含水乙醇或含水1,3-丁二醇。另外所述溶剂优选以室温～溶剂的沸点以下的温度使用。含水1,3-丁二醇包含20～80质量％的1,3-丁二醇，优选30～70质量％，进一步优选40～60质量％。作为一例，可以使用50质量％的1,3-丁二醇水溶液作为提取溶剂。

提取方法没有特别限制，通常常温至常压下的溶剂沸点的范围即可，提取后可以使用过滤或离子交换树脂，进行吸附、脱色、纯化，制成溶液状、糊状、凝胶状、粉末状。更多情况下可以以原本状态直接利用，如果有需要，可以在不影响其效果的范围内进一步加入除臭、脱色等纯化处理，作为除臭、脱色等纯化处理手段，可以使用活性碳柱等，也可以根据提取物质任意选择一般适用的通常手段。本发明中使用的提取物全部作为化妆品材料有市售，其制法可以根据销售商而不同。

毛叶香茶菜(学名：Isodon japonicus)是唇形科香茶菜属的日本原产植物，自然生长于本州、四国、九州。毛叶香茶菜提取物是将毛叶香茶菜的整株经上述提取溶剂提取而得的提取物。作为一例，毛叶香茶菜提取物可以通过将作为生药市售的毛叶香茶菜整株的干燥物用水、丙二醇、1,3-丁二醇或它们的混合液等提取而获得。正如称为毛叶香茶菜(延命草)那样，在日本作为民间药被利用。已知保湿、促进血液循环、收敛、抗菌作用等作为主要的药效，也用作苦味健胃药。

野芝麻(学名：Lamium album Linne)是唇形科的日本原产植物，自然生长于北海道、本州、四国、九州、朝鲜半岛、以及中国等广泛范围。野芝麻提取物(White NettleExtract)是由野芝麻的花、茎、或叶通过上述提取溶剂提取而得的提取物。作为一例，由野芝麻的花、茎、叶用水、丙二醇、1,3-丁二醇或它们的混合液提取而获得。

野燕麦是禾本科燕麦属的植物，为欧洲到西亚地区原产，在广泛地区存在野生种和栽培种。作为野生种，常见野燕麦(学名：Avena fatua)，另一方面，栽培种的燕麦(学名：Avena sativa)也可以用作提取物的原材料。野燕麦提取物是由茎、叶、种子、谷粒用上述提取溶剂提取而得的提取物。作为一例，由野燕麦的谷粒用丙二醇、1,3-丁二醇或它们的混合液提取而获得。

芍药是芍药科的多年生草本植物，为亚洲大陆东北部原产。作为芍药提取物中使用的品种，可以举出芍药(Paeonia lactiflora Pallas(Paeonia albiflora Pallasvar.trichocarpa Bunge))或其它亲缘植物(Paeoniaceae)。是由芍药的植物体用上述提取溶剂提取而得的提取物。作为一例，由芍药的根用水、丙二醇、1,3-丁二醇或它们的混合液提取而获得。

山茶(学名：Camellia japonica)是山茶科山茶属的常绿树，是日本原产的植物。自然生长于本州、四国、九州、西南诸岛，另外也自然生长于朝鲜半岛南部和中国台湾地区。山茶籽提取物是将山茶的种子用上述提取溶剂提取而得的提取物。作为一例，由山茶籽的粉末或干燥粉末用水、丙二醇、1,3-丁二醇或它们的混合液提取而获得。

蔷薇是蔷薇科蔷薇属的总称，是在北半球的温带区域广泛自然生长的植物。蔷薇存在多样的种类，由任意品种的蔷薇的花通过水蒸气蒸馏提取玫瑰水。特别是大马士革玫瑰(Rosa damascena)这个品种由于其香味优秀而适合作为玫瑰水的原材料。有时将由保加利亚产的大马士革玫瑰获得的玫瑰水特别称作保加利亚玫瑰水，作为化妆品材料市售。

FLORASUN 90是向日葵油的一种，作为化妆品材料市售。向日葵(学名：Helianthusannuus)是菊科的一年生草本植物，为北美原产。向日葵的种子富含油脂，能够通过榨油获得向日葵油。向日葵油根据品种所含的不饱和脂肪酸的种类不同，特别优选油酸含量特别高的向日葵油。

莽吉柿(学名：Garcinia mangostana)是藤黄科藤黄属的植物，为东南亚原产。莽吉柿提取物是将莽吉柿的果穗、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或整株用上述提取溶剂提取而得的提取物。作为一例，由莽吉柿的果皮用水、丙二醇、1,3-丁二醇或它们的混合液提取而获得。

辣木是属于辣木属的植物，在非洲至南亚的热带至亚热带自然生长。特别是辣木(学名：Moringa oleifera Lam)被大量栽培。辣木提取物是从叶、花、树皮、果实、种子、根用上述提取溶剂提取而得的提取物。作为一例，由辣木的叶和/或根用水、丙二醇、1,3-丁二醇或它们的混合液提取而获得。

虎耳草(Saxifraga stolonifera)是虎耳草属的植物，是自然生长于日本、中国等的多年生草本植物。虎耳草提取物是从整株、叶、茎、根、花、种子用上述提取溶剂提取而得的提取物。作为一例，由虎耳草的叶用水、丙二醇、1,3-丁二醇或它们的混合液提取而获得。

本发明的另一方式也涉及对皮肤炎症的抵抗力的评价方法，以替代性自噬活性为指标。根据该方法，通过在被检验者的皮肤样品中测定替代性自噬活性，能够评价对皮肤炎症的抵抗力。可以根据对被评价的皮肤炎症的抵抗力来选择化妆品。例如对于评价为替代性自噬活性低的被检验者，可以发展不易产生皮肤炎症的低刺激性的化妆品。另外，在着眼于对作为皮肤炎症的紫外线引发性炎症的抵抗力的情况下，对评价为替代性自噬活性低的被检验者，可以劝用更强力的防晒、和/或晒后护理乳液等化妆品，另外还可以劝用包含替代性自噬诱导剂的功能性食品、化妆品、以及药品。

替代性自噬活性可以以贡献于替代性自噬的因子的表达或活性为指标来确定。作为贡献于替代性自噬的因子，可以举出Beclin1、Ulk1、Rab9等，例如可以检测这些Beclin1、Ulk1、Rab9等因子的基因和/或蛋白质表达的变化，或用免疫染色等方法进行可视化。从特异性地测定替代性自噬的观点考虑，优选使用认为不参与通用型自噬的Rab9。进而在另一方式中，也可以检测参与替代性自噬的细胞器或物质，例如溶酶体和/或自噬小体、或来自溶酶体或自噬小体的蛋白质，从而检测替代性自噬活性。例如可以用免疫染色等方法将敲减或敲除了Atg5和/或Atg7的细胞中的来自溶酶体的蛋白质LAMP1和/或LAMP2的聚集可视化。

实施例

将正常人表皮角质细胞(NHEK)(クラボウ社制)接种于6孔板，用表皮角质细胞扩增用培养基(EpiLife-KG2；GIBCO社制)培养直到亚汇合。其后，分别交换成包含已知作为自噬抑制剂的3-甲基腺嘌呤(3-MA)(R&D社制；最终浓度1mM)的培养基、和包含已知作为自噬诱导剂的雷帕霉素(Enzo life science社制；最终浓度0.5μM)的培养基，培养3小时。培养后，舍弃培养基，添加PBS，以20mJ/cm

由于因紫外线照射而导致IL-1β的浓度增加，因此显示出诱导了炎症。然后在添加了作为自噬抑制剂的3-甲基腺嘌呤的情况下，紫外线照射后的IL-1β的浓度增加到约3倍。另一方面，在添加了已知作为自噬的诱导剂的雷帕霉素的情况下，紫外线照射后的IL-1β有显著性差异地降低。由这些结果显示，能够通过诱导自噬来减轻紫外线诱导性的炎症。

从Invitrogen社购买针对Atg5、Atg7和Beclin1的小干涉RNA(siRNA)。各自的序列如表1。

表1

对NHEK细胞(8.0×10

表2

将siRNA处理后的NHEK细胞接种于6孔板，培养24小时。其后，舍弃培养基，置换成PBS，以15mJ/cm

显示能够通过使用针对Atg5、Atg7和Beclin1的siRNA来抑制这些基因表达(图2A、B和C)。考虑Atg5、Atg7是Atg5/Atg7依赖性自噬所需的蛋白质，考虑Beclin1是包含Atg5/Atg7依赖性自噬和替代性自噬两个途径的自噬所需的蛋白质。因此，认为在分别抑制了Atg5、Atg7的基因表达的细胞中，仅Atg5/Atg7依赖性自噬不起作用，另一方面，在抑制了Beclin1的基因表达的细胞中，包含Atg5/Atg7依赖性自噬和替代性自噬的自噬途径本身不起作用。

在抑制了Atg5和Atg7表达的角质细胞中，照射紫外线后的IL-1β浓度没有变化(图3A和3B)。另一方面，在抑制了Beclin1表达的角质细胞中，在紫外线照射后IL-1β浓度有显著性差异地增加(图3C)。由此显示，对于减轻由紫外线产生的炎症，Atg5/Atg7依赖性自噬完全不参与，另一方面，替代性自噬有助于减轻由紫外线产生的炎症。

将正常293T细胞和Atg5缺失293T细胞以1×10

接着，对于选择的20种被检验物质，测定正常人表皮角质细胞(Hacat)细胞中的自噬活性。处理上述Atg5敲减用的siRNA，取得Atg5敲减Hacat细胞。分别将正常Hacat细胞和Atg5敲减Hacat细胞分别以1×10

对于所选择的10种被检验物质，测定现有型自噬活性和替代性自噬(非Atg5/Atg7依赖性自噬)活性的诱导能力。具体而言，在添加有上述被检验物质的培养基中培养正常Hacat细胞，使用抗LC3-Ⅱ抗体(Cosmo bio)进行免疫染色。用荧光显微镜观察，与不添加被检验物质的对照组进行比较，记录全视野中的荧光亮度的变化。由于LC3-Ⅱ是现有型自噬的指标，因此，在荧光亮度比不添加被检验物质的对照组增加的情况下，确定现有型自噬活性的诱导能力。接着，在添加有上述被检验物质的培养基中培养Atg5敲减Hacat细胞，使用抗Lamp1抗体(Abcam)进行免疫染色。用荧光显微镜观察，与不添加被检验物质的对照组进行比较，记录全视野中的荧光亮度的变化。由于Lamp1为自噬的指标，因此在荧光亮度比不添加被检验物质的对照组增加的情况下，确定非Atg依赖性自噬活性的诱导能力。将结果示于下述表中。

表3

29：毛叶香茶菜提取物、45：野芝麻提取物、62：野燕麦提取液、95：芍药提取物BG、129：山茶籽提取物BG、156：保加利亚玫瑰水、157：FLORASUN 90、174：莽吉柿提取物BG、179：辣木提取物G、183：虎耳草提取物BG

在被检验物质号29、34、129和156中，观察到强的替代性自噬诱导活性。另外，被检验物质29不诱导现有型自噬，另一方面能够仅诱导替代性自噬活性。