KLK5抑制性肽

技术领域

本发明涉及肽、多核苷酸、载体、细胞、用于生产肽的方法、通过这样的方法得到的肽、含有肽的缀合物、含有肽或缀合物的组合物、药物组合物、用于治疗或预防多种疾病的药物组合物、肽或缀合物用于治疗或预防多种疾病的用途、包括施用肽或缀合物的步骤的用于治疗多种疾病的方法、含有肽或缀合物的用于诊断或检查多种疾病的组合物，等。

背景技术

激肽释放酶5 (KLK5)是一种胰蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶(Clan PA, 家族S1)，并且也被称为角质层胰蛋白酶(SCTE)。激肽释放酶7 (KLK7)是一种胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶(Clan PA, 家族S1)并且也被称为角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)。此外，激肽释放酶14(KLK14)是一种胰蛋白酶-样蛋白酶(Clan PA, 家族S1)。KLK5、KLK7和KLK14属于由15类高度保守的胰蛋白酶-或胰凝乳蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶组成的组织激肽释放酶家族。KLK5在细胞中表达，并在此后通过自体活化转化成活性KLK5，而KLK7和KLK14被表达为无活性的前酶原，并通过以KLK5为代表的蛋白酶对它们的前原序列的切割转化成活性形式(非专利文献1)。已经在皮肤中观察到KLK5的表达，并且据报道它会降解与细胞粘附有关的因子诸如桥粒芯糖蛋白和桥粒芯胶蛋白(非专利文献2)。KLK5、KLK7和KLK14对于皮肤脱屑而言是重要的，并且进一步参与蛋白水解酶活化的受体2 (PAR-2)的活化(非专利文献3)。PAR-2的活化会诱导细胞因子和趋化因子并增强免疫、炎症反应等。

内瑟顿综合征是由常染色体隐性遗传引起的具有严重皮肤炎症、脱屑、异常毛发和变应性症状（诸如哮喘和变应性皮炎）的鱼鳞病综合征之一，并且是一种罕见的疾病(OMIM256500) (非专利文献4)。由于剥脱性皮炎从出生时发生，脱水、感染等可能由对皮肤屏障功能的显著损伤造成并且可能伴有发育迟滞。尽管不可得到详细的流行病学数据，但据说表现出高出生后死亡率。内瑟顿综合征由于以下原因而发生：在皮肤上皮细胞中表达的编码LEKTI的基因(SPINK5)发生突变后，丝氨酸蛋白酶抑制剂(LEKTI)的功能丧失。LEKTI由15个Kazal-样抑制剂结构域组成。在具有内瑟顿综合征的患者中，已经在编码每个结构域的SPINK5整个序列中发现了多个突变位点，并且症状和严重程度与突变位点关联地变化(非专利文献4和5)。

SPINK5-缺陷型小鼠(Spink5

还已经提出KLK5与红斑痤疮有关，红斑痤疮是面部的一种慢性炎性疾病。在红斑痤疮患者中，已经报道了增加的KLK5和抗微生物肽Cathelicidin的表达。尽管不清楚它的病原学的细节，认为具有升高的表达的KLK5会降解Cathelicidin，由此产生造成红斑痤疮的肽(非专利文献9)。

多篇报道认为SPINK5多态性与特应性皮炎的严重程度有关(非专利文献10-14)。已经报道，在具有编码LEKTI（其中在两个等位基因中的氨基酸残基420是赖氨酸）的SPINK5基因的特应性皮炎患者的皮肤中，与在两个等位基因中编码谷氨酸的情况相比，桥粒芯糖蛋白1的表达在蛋白水平下降，且包括KLK5和KLK7在内的蛋白酶的活性增加(非专利文献15)。认为这些蛋白酶的活化会由于皮肤屏障功能的下降而促进变应原的侵入，并造成其中容易发生炎症反应的病症。

SPINK2(丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-型2)由具有三个二硫键的Kazal-样结构域构成，并且作为胰蛋白酶/顶体素抑制剂起作用(非专利文献16)，但是尚未阐明SPINK2和它的突变体与疾病诸如内瑟顿综合征、红斑痤疮和特应性皮炎的关联。

引文列表

非专利文献

非专利文献1: Ovaere P, 等人，公开于2009, Trends Biochem Sci., 第34卷,第9期: 第453-463页

非专利文献2: Descargues P, 等人，公开于2005, Nat Genet., 第37卷, 第1期: 第56-65页

非专利文献3: Rattenholl A, 等人，公开于2008, Drug News Perspect., 第21卷, 第7期: 第369-381页

非专利文献4: Hovnanian A.，公开于2013, Cell Tissue Res., 第351卷, 第2期: 第289-300页

非专利文献5: Sarri CA, 等人，公开于2017, Mol Diagn Ther., 第21卷, 第2期: 第137-152页

非专利文献6: Furio L, 等人，公开于2015, PLoS Genet., 第11卷, 第9期:e1005389

非专利文献7: Kasparek P, 等人，公开于2017, PLoS Genet., 第13卷, 第1期:e1006566

非专利文献8: Furio L, 等人，公开于2014, J Exp Med., 第211卷, 第3期: 第499-513页

非专利文献9: Yamasaki K, 等人，公开于2007, Nat Med., 第13卷, 第8期: 第975-980页

非专利文献10: Nishio Y, 等人，公开于2003, Genes Immun., 第4卷, 第7期:第515-517页

非专利文献11: Kusunoki T, 等人，公开于2005, J Allergy Clin Immunol.,第4卷, 第7期: 第515-517页

非专利文献12: Lan CC, 等人，公开于2011, Exp Dermatol., 第20卷, 第12期:第975-979页

非专利文献13: Kato A, 等人，公开于2003, Br J Dermatol., 第148卷, 第4期: 第665-669页

非专利文献14: Zhao LP, 等人，公开于2012, J Eur Acad DermatolVenereol., 第26卷, 第5期: 第572-577页

非专利文献15: Fortugno P, 等人，公开于2012, Hum Mol Genet., 第21卷, 第19期: 第4187-4200页

非专利文献16: Chen T, 等人，公开于2009, Proteins., 第77卷, 第1期: 第209-219页。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是，提供新颖的KLK5抑制性肽、含有所述肽的缀合物、含有所述肽或所述缀合物的药物组合物等。

问题的解决方案

本发明涉及：

(1) SPINK2突变体肽，其包含在SEQ ID NO: 61(图69)中所示的氨基酸序列且抑制活性人KLK5的蛋白酶活性；

(2)根据(1)的肽，其中所述肽抑制人KLK7或人KLK14的蛋白酶活性；

(3)根据(1)的肽，其中所述肽选择性地抑制人KLK5和任选的人KLK7或KLK14；

(4)根据(1)至(3)中的任一项的肽，其中Xaa16 (X

(5)根据(1)至(4)中的任一项的肽，其中Xaa17 (X

(6)根据(1)至(5)中的任一项的肽，其中Xaa18 (X

(7)根据(1)至(6)中的任一项的肽，其中Xaa19 (X

(8)根据(1)至(7)中的任一项的肽，其中Xaa20 (X

(9)根据(1)至(8)中的任一项的肽，其中Xaa21 (X

(10)根据(1)至(9)中的任一项的肽，其中Xaa22 (X

(11)根据(1)至(10)中的任一项的肽，其中Xaa24 (X

(12)根据(1)至(11)中的任一项的肽，其中Xaa25 (X

(13)根据(1)至(12)中的任一项的肽，其中Xaa26 (X

(14)根据(1)至(13)中的任一项的肽，其中Xaa27 (X

(15)根据(1)至(14)中的任一项的肽，其中Xaa28 (X

(16)根据(1)至(15)中的任一项的肽，其中所述肽包含在SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18和20 (图14、16、18、20、22、24、26和28)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸；

(17)根据(1)至(3)中的任一项的肽，其中Xaa16 (X

(18)根据(1)至(3)和(17)中的任一项的肽，其中Xaa17 (X

(19)根据(1)至(3)、(17)和(18)中的任一项的肽，其中Xaa18 (X

(20)根据(1)至(3)和(17)至(19)中的任一项的肽，其中Xaa19 (X

(21)根据(1)至(3)和(17)至(20)中的任一项的肽，其中Xaa20 (X

(22)根据(1)至(3)和(17)至(21)中的任一项的肽，其中Xaa21 (X

(23)根据(1)至(3)和(17)至(22)中的任一项的肽，其中Xaa22 (X

(24)根据(1)至(3)和(17)至(23)中的任一项的肽，其中Xaa24 (X

(25)根据(1)至(3)和(17)至(24)中的任一项的肽，其中Xaa25 (X

(26)根据(1)至(3)和(17)至(25)中的任一项的肽，其中Xaa26 (X

(27)根据(1)至(3)和(17)至(26)中的任一项的肽，其中Xaa27 (X

(28)根据(1)至(3)和(17)至(27)中的任一项的肽，其中Xaa28 (X

(29)根据(1)至(3)和(17)至(28)中的任一项的肽，其中所述肽包含在SEQ ID NO:22、24、26和28 (图30、32、34和36)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸；

(30)根据(1)至(3)中的任一项的肽，其中Xaa16 (X

(31)根据(1)至(3)和(30)中的任一项的肽，其中Xaa17 (X

(32)根据(1)至(3)、(30)和(31)中的任一项的肽，其中Xaa18 (X

(33)根据(1)至(3)和(30)至(32)中的任一项的肽，其中Xaa19 (X

(34)根据(1)至(3)和(30)至(33)中的任一项的肽，其中Xaa20 (X

(35)根据(1)至(3)和(30)至(34)中的任一项的肽，其中Xaa21 (X

(36)根据(1)至(3)和(30)至(35)中的任一项的肽，其中Xaa22 (X

(37)根据(1)至(3)和(30)至(36)中的任一项的肽，其中Xaa24 (X

(38)根据(1)至(3)和(30)至(37)中的任一项的肽，其中Xaa25 (X

(39)根据(1)至(3)和(30)至(38)中的任一项的肽，其中Xaa26 (X

(40)根据(1)至(3)和(30)至(39)中的任一项的肽，其中Xaa27 (X

(41)根据(1)至(3)和(30)至(40)中的任一项的肽，其中Xaa28 (X

(42)根据(1)至(3)和(30)至(41)中的任一项的肽，其中所述肽包含在SEQ ID NO:30和32 (图38和40)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸；

(43)根据(1)至(42)中的任一项的肽，其中所述肽具有三个二硫键且具有特征在于包括环结构、α-螺旋和β-折叠的三维结构；

(44)一种多核苷酸，其包含编码根据(1)至(43)中的任一项的肽的氨基酸序列的核苷酸序列；

(45)包含根据(44)的多核苷酸的载体；

(46)一种细胞，其包含根据(44)的多核苷酸或根据(45)的载体或产生根据(1)至(43)中的任一项的肽；

(47)一种用于生产SPINK2突变体肽的方法，所述方法包括以下步骤(i)和(ii)：(i)培养根据(46)的细胞；和(ii)从培养物收集SPINK2突变体肽；

(48)一种用于生产根据(1)至(43)中的任一项的肽的方法，其包括通过化学合成或体外翻译制备所述肽的步骤；

(49)通过根据(47)或(48)的方法得到的SPINK2突变体肽；

(50)一种缀合物，其包含根据(1)至(43)和(49)中的任一项的肽，其中所述肽被一个和任选地多个部分结合；

(51)根据(50)的缀合物，其中所述一个或多个任选的部分包含不是SPINK2突变体的第二种肽；

(52)根据(51)的缀合物，其中所述第二种肽位于SPINK2突变体的氨基端侧上；

(53)根据(51)的缀合物，其中所述第二种肽位于SPINK2突变体的羧基端侧上；

(54)根据(51)至(53)中的任一项的缀合物，其中所述第二种肽是抗体或其片段且包含一个或多个Fc区；

(55)根据(54)的缀合物，其中所述或每个Fc区是人免疫球蛋白的Fc区或其片段；

(56)根据(54)或(55)的缀合物，其中所述或每个Fc区是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和/或IgE的Fc区或其片段；

(57)根据(54)至(56)中的任一项的缀合物，其中所述或每个Fc区是人IgG1的Fc区或其片段；

(58)根据(57)的缀合物，其中人IgG1的所述或每个Fc区包含在SEQ ID NO: 87(图95)中所示的氨基酸序列；

(59)根据(54)至(57)中的任一项的缀合物，其中所述或每个Fc区是野生型或突变体Fc区；

(60)根据(51)至(59)中的任一项的缀合物，其中所述缀合物包含添加至其氨基端的一个至几个天冬氨酸和/或谷氨酸；

(61)根据(50)至(60)中的任一项的缀合物，其中所述缀合物包含在下面(i)或(ii)中描述的氨基酸序列: (i)在SEQ ID NO: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和96 (图42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68和106)中的任一个中所示的氨基酸序列；或(ii)与上面(i)中所述的氨基酸序列具有90%或更多同一性并抑制KLK5的蛋白酶活性的缀合物的氨基酸序列；

(62)根据(51)至(61)中的任一项的缀合物，其中所述SPINK2突变体和所述第二种肽通过接头彼此连接；

(63)根据(62)的缀合物，其中所述接头是第三种肽，其不是SPINK2突变体或所述第二种肽；

(64)一种用于生产根据(50)至(63)中的任一项的缀合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)和(ii)：(i)培养细胞，所述细胞包含含有编码所述缀合物的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸或在其中插入了所述多核苷酸的载体；和(ii)从所述培养物收集SPINK2突变体肽缀合物或在所述缀合物中所包含的肽部分；

(65)一种用于生产根据(50)至(63)中的任一项的SPINK2突变体肽缀合物的方法，所述方法包括通过化学合成或体外翻译来制备所述缀合物或在所述缀合物中所包含的肽部分的步骤；

(66)通过根据(64)或(65)的方法得到的SPINK2突变体肽缀合物；

(67)结合根据(1)至(43)和(49)中的任一项的肽的抗体或其结合片段；

(68)一种组合物，其包含根据(1)至(43)和(49)中的任一项的肽、根据(44)的多核苷酸、根据(45)的载体、根据(46)的细胞、根据(50)至(63)和(66)中的任一项的缀合物、和/或根据(67)的抗体或其结合片段；

(69)一种药物组合物，其包含根据(1)至(43)和(49)中的任一项的肽、根据(44)的多核苷酸、根据(45)的载体、根据(46)的细胞、和/或根据(50)至(63)和(66)中的任一项的缀合物；

(70)用于治疗或预防KLK5相关的疾病的根据(69)的药物组合物；

(71)根据(70)的药物组合物，其中所述KLK5相关的疾病是内瑟顿综合征、特应性皮炎、红斑痤疮、紫外线诱导的皮肤损伤、银屑病、哮喘、脊髓损伤、癌症或巴雷特食管；

(72)用于与另外药物产品联合使用的根据(69)至(71)中的任一项的药物组合物；

(73)一种试验或诊断组合物，其包含根据(1)至(43)和(49)中的任一项的肽、根据(44)的多核苷酸、根据(45)的载体、根据(46)的细胞、根据(50)至(63)和(66)中的任一项的缀合物和/或根据(67)的抗体或其结合片段；

(74)根据(47)、(48)、(64)和(65)中的任一项的方法，所述方法包括使用根据(67)的抗体或其结合片段执行亲和纯化的步骤；

(75)一种用于鉴定KLK5抑制性的SPINK2突变体肽的方法，所述方法包括以下步骤(i)至(iii)：(i)在有和没有试验SPINK2突变体肽存在下温育KLK5蛋白酶和底物；(ii)在有和没有试验SPINK2突变体肽存在下测量KLK5的蛋白酶活性；和(iii)当在有所述肽存在下KLK5的蛋白酶活性低于在没有所述肽存在下KLK5的蛋白酶活性时，确定所述肽是阳性的；

(76)一种用于鉴定KLK5抑制性化合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)至(iii)，使用包含在SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32 (图14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)中的任一个中所示的氨基酸序列的肽或包含所述肽的缀合物作为参照化合物：(i)在有和没有试验化合物存在下温育KLK5蛋白酶和底物；(ii)在有和没有所述试验化合物存在下测量KLK5的蛋白酶活性；和(iii)当在有所述试验化合物存在下KLK5的蛋白酶活性低于在没有所述试验化合物存在下KLK5的蛋白酶活性时，确定所述试验化合物是阳性的；

(77)一种用于鉴定KLK5抑制性化合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)至(iii)：(i)测量试验化合物对KLK5的蛋白酶抑制活性；(ii)测量参照化合物对KLK5的蛋白酶抑制活性，所述参照化合物是包含在SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32 (图14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)中的任一个中所示的氨基酸序列的肽或包含所述肽的缀合物；和(iii)当所述试验化合物对KLK5的蛋白酶抑制活性等于或高于所述参照化合物对KLK5的蛋白酶抑制活性时，确定所述试验化合物是阳性的；

(78)一种测量KLK5蛋白酶活性的方法，所述方法包括以下步骤(i)和(ii)，使用包含在SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32 (图14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)中的任一个中所示的氨基酸序列的肽或包含所述肽的缀合物作为参照化合物：(i)将KLK5蛋白酶与底物和任选的另一种组分温育；和(ii)在步骤(i)以后测量底物的量和/或产物的量；

(79)一种KLK5抑制性的SPINK2突变体肽或SPINK2突变体肽缀合物，其对KLK5具有1×10

(80)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 34 (图42)中所示的氨基酸序列；

(81)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 36 (图44)中所示的氨基酸序列；

(82)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 38 (图46)中所示的氨基酸序列；

(83)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 40 (图48)中所示的氨基酸序列；

(84)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 42 (图50)中所示的氨基酸序列；

(85)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 44 (图52)中所示的氨基酸序列；

(86)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 46 (图54)中所示的氨基酸序列；

(87)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 48 (图56)中所示的氨基酸序列；

(88)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 50 (图58)中所示的氨基酸序列；

(89)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 52 (图60)中所示的氨基酸序列；

(90)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 54 (图62)中所示的氨基酸序列；

(91)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 56 (图64)中所示的氨基酸序列；

(92)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 58 (图66)中所示的氨基酸序列；

(93)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 60 (图68)中所示的氨基酸序列；和

(94)一种缀合物，其包含在SEQ ID NO: 96 (图106)中所示的氨基酸序列。

发明的有利效果

本发明所提供的肽、含有所述肽的缀合物、以及含有所述肽或所述缀合物的药物组合物具有KLK5抑制活性并且可用于治疗或预防KLK5相关疾病(其将在下面描述)。

附图说明

[图1]图1包括用于对比人KLK5、KLK7和KLK14的氨基酸序列的相似性的视图。

[图2]图2包括的图显示了每种KLK5抑制性肽的KLK5抑制活性(50%抑制浓度:IC

[图3A]图3A包括了图以评价每种抑制性肽与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价牛胰蛋白酶抑制活性，使用了具有5 nM的终浓度的胰蛋白酶(Pierce, 20233)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems,Inc., ES011)。为了评价人胰蛋白酶抑制活性，使用了具有1 nM的终浓度的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Co. LLC, T6424)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC(R&D Systems, Inc., ES011)。为了评价牛α-胰凝乳蛋白酶抑制活性，使用了具有10 nM的终浓度的胰凝乳蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation, LS001434)和具有100μM的终浓度的底物肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v)。

[图3B]图3B包括了图以评价每种抑制性肽与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人胰凝乳蛋白酶抑制活性，使用了具有10 nM的终浓度的胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich Co. LLC, C8946)和具有10 μM的终浓度的底物肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v)。为了评价人类胰蛋白酶抑制活性，使用了具有1 nM的终浓度的类胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Co. LLC, T7063)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3107-v)。为了评价人类胰凝乳蛋白酶抑制活性，使用了具有100 nM的终浓度的类胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich Co. LLC, C8118)和具有100 μM的终浓度的底物肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v)。

[图3C]图3C包括了图以评价每种抑制性肽与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人纤溶酶抑制活性，使用了具有50 nM的终浓度的纤溶酶(Sigma-Aldrich Co. LLC, P1867)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Leu-Lys-MCA(PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3104-v)。为了评价人凝血酶抑制活性，使用了具有1 nM的终浓度的凝血酶(Sigma-Aldrich Co. LLC, T6884)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011)。为了评价人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制活性，使用了具有0.00001 U/ μL的终浓度的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(Enzo LifeSciences, BML-SE284)和具有100 μM的终浓度的底物肽Suc (OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA(PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3153-v)。

[图3D]图3D包括了图以评价每种抑制性肽与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人蛋白裂解酶（matriptase）抑制活性，使用了具有1 nM的终浓度的蛋白裂解酶（matriptase）(R&D Systems, Inc., 3946-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES014)。为了评价人蛋白C抑制活性，使用了具有100 nM的终浓度的蛋白C (Sigma-Aldrich Co. LLC, P2200)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3112-v)。为了评价人tPA抑制活性，使用了具有10 nM的终浓度的tPA (Sigma-Aldrich Co. LLC,T0831)和具有100 μM的终浓度的底物肽Pyr-Gly-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC.,3145-v)。

[图3E]图3E包括了图以评价每种抑制性肽与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人uPA抑制活性，使用了具有2 nM的终浓度的uPA (Sigma-Aldrich Co. LLC, U0633)和具有100 μM的终浓度的底物肽Pyr-Gly-Arg-MCA (PEPTIDEINSTITUTE, INC., 3145-v)。为了评价人血浆激肽释放酶抑制活性，使用了具有0.125 μg/mL的终浓度的血浆激肽释放酶(R&D Systems, Inc., 2497-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Z-Phe-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3095-v)。

[图3F]图3F包括了图以评价每种抑制性肽与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人KLK1抑制活性，使用了具有0.1 μg/mL的终浓度的hKLK1(R&D Systems, Inc., 2337-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Pro-Phe-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3096-v)。为了评价人KLK2抑制活性，使用了具有2 μg/mL的终浓度的hKLK2 (R&D Systems, Inc., 2337-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Pro-Phe-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3096-v)。为了评价人KLK4抑制活性，使用了具有1 μg/mL的终浓度的hKLK4 (R&D Systems, Inc., 1719-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011)。

[图3G]图3G包括了图以评价每种抑制性肽与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人KLK7抑制活性，使用了具有1 μg/mL的终浓度的hKLK7和具有20 μM的终浓度的底物肽Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH

[图3H]图3H包括了图以评价每种抑制性肽与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人KLK13抑制活性，使用了具有0.5 μg/mL的终浓度的hKLK13(R&D Systems, Inc., 2625-SE)、具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC(R&D Systems, Inc., ES011)和在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号。为了评价人KLK14抑制活性，使用了具有0.2 μg/mL的终浓度的hKLK14和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011)。

[图4]图4的视图显示了通过X-射线晶体结构分析得到的KLK5/KLK5抑制性肽复合物。抑制性肽K51034结合至含有KLK5活性位点的区域。

[图5]图5包括的图显示了每种KLK5抑制性肽Fc融合体的KLK5抑制活性(IC

[图6A]图6A包括了图以评价每种抑制性肽Fc融合体与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价牛胰蛋白酶、人胰蛋白酶和牛α-胰凝乳蛋白酶抑制活性，使用了与在图3A中相同的条件。

[图6B]图6B包括了图以评价每种抑制性肽Fc融合体与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人胰凝乳蛋白酶、人类胰蛋白酶和人类胰凝乳蛋白酶抑制活性，使用了与在图3B中相同的条件。

[图6C]图6C包括了图以评价每种抑制性肽Fc融合体与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人纤溶酶、人凝血酶和人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制活性，使用了与在图3C中相同的条件。

[图6D]图6D包括了图以评价每种抑制性肽Fc融合体与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人蛋白裂解酶（matriptase）、人蛋白C和人tPA抑制活性，使用了与在图3D中相同的条件。

[图6E]图6E包括了图以评价每种抑制性肽Fc融合体与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人uPA和人血浆激肽释放酶抑制活性，使用了与在图3E中相同的条件。

[图6F]图6F包括了图以评价每种抑制性肽Fc融合体与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人KLK1、人KLK2和人KLK4抑制活性，使用了与在图3F中相同的条件。

[图6G]图6G包括了图以评价每种抑制性肽Fc融合体与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人KLK7、人KLK8和人KLK12抑制活性，使用了与在图3G中相同的条件。

[图6H]图6H包括了图以评价每种抑制性肽Fc融合体与蛋白酶的交叉反应性，其中使用肽底物的降解作为指标。为了评价人KLK13和人KLK14抑制活性，使用了与在图3H中相同的条件。

[图7]图7的图显示了施用KLK5抑制性肽Fc融合体的组，其在Crusty2模型小鼠中抑制经皮失水(TEWL)。对于异型(±) SPINK5突变，皮肤炎症没有发生，但是对于同型(+/+)SPINK5突变，皮肤炎症强烈发生，其升高TEWL。肽Fc融合体向具有同型(+/+) SPINK5突变的Crusty2小鼠的施用改善了皮炎并减轻了TEWL。Crusty2 (±)小鼠的病例数为9，且Crusty2(+/+)小鼠的病例数为12（在各个PBS施用组和D1-K50055-Fc施用组。图中的误差棒显示了标准误差。

[图8]图8包括的视图对比了人SPINK2、人SPINK5的D8和D9、以及人SPINK9中的序列同一性。已知的是，人SPINK5的D8和D9以及人SPINK9具有人KLK5抑制活性，但是看出，与人SPINK2（没有报道其人KLK5抑制活性）的氨基酸序列同一性在所有情况下都是低的。

[图9]图9是人SPINK2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)。

[图10]图10是人KLK5 的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。

[图11]图11是人KLK7 的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)。

[图12]图12是人KLK14的氨基酸序列 (SEQ ID NO: 4)。

[图13]图13是KLK5抑制性肽K50032的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。

[图14]图14是KLK5抑制性肽K50032的氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)。

[图15]图15是KLK5抑制性肽K50055的核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)。

[图16]图16是KLK5抑制性肽K50055的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8)。

[图17]图17是KLK5抑制性肽K51072的核苷酸序列(SEQ ID NO: 9)。

[图18]图18是KLK5抑制性肽K51072的氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。

[图19]图19是KLK5抑制性肽K50016的核苷酸序列(SEQ ID NO: 11)。

[图20]图20是KLK5抑制性肽K50016的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。

[图21]图21是KLK5抑制性肽K51034的核苷酸序列(SEQ ID NO: 13)。

[图22]图22是KLK5抑制性肽K51034的氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。

[图23]图23是KLK5抑制性肽K50062的核苷酸序列(SEQ ID NO: 15)。

[图24]图24是KLK5抑制性肽K50062的氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。

[图25]图25是KLK5抑制性肽K51090的核苷酸序列(SEQ ID NO: 17)。

[图26]图26是KLK5抑制性肽K51090的氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)。

[图27]图27是KLK5抑制性肽K50098的核苷酸序列(SEQ ID NO: 19)。

[图28]图28是KLK5抑制性肽K50098的氨基酸序列(SEQ ID NO: 20)。

[图29]图29是KLK5/KLK7抑制性肽K51028的核苷酸序列(SEQ ID NO: 21)。

[图30]图30是KLK5/KLK7抑制性肽K51028的氨基酸序列(SEQ ID NO: 22)。

[图31]图31是KLK5/KLK7抑制性肽K51005的核苷酸序列(SEQ ID NO: 23)。

[图32]图32是KLK5/KLK7抑制性肽K51005的氨基酸序列(SEQ ID NO: 24)。

[图33]图33是KLK5/KLK7抑制性肽K50031的核苷酸序列(SEQ ID NO: 25)。

[图34]图34是KLK5/KLK7抑制性肽K50031的氨基酸序列(SEQ ID NO: 26)。

[图35]图35是KLK5/KLK7抑制性肽K51057的核苷酸序列(SEQ ID NO: 27)。

[图36]图36是KLK5/KLK7抑制性肽K51057的氨基酸序列(SEQ ID NO: 28)。

[图37]图37是KLK5/KLK14抑制性肽K51069的核苷酸序列(SEQ ID NO: 29)。

[图38]图38是KLK5/KLK14抑制性肽K51069的氨基酸序列(SEQ ID NO: 30)。

[图39]图39是KLK5/KLK14抑制性肽K50015的核苷酸序列(SEQ ID NO: 31)。

[图40]图40是KLK5/KLK14抑制性肽K50015的氨基酸序列(SEQ ID NO: 32)。

[图41]图41是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50032dN-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:33)。

[图42]图42是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50032dN-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)。

[图43]图43是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50055-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:35)。

[图44]图44是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50055-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:36)。

[图45]图45是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51072-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:37)。

[图46]图46是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51072-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:38)。

[图47]图47是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50016dN-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:39)。

[图48]图48是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50016dN-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)。

[图49]图49是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51034-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:41)。

[图50]图50是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51034-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)。

[图51]图51是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50062-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:43)。

[图52]图52是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50062-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)。

[图53]图53是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51090-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:45)。

[图54]图54是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51090-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:46)。

[图55]图55是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50098dN-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:47)。

[图56]图56是KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50098dN-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:48)。

[图57]图57是KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51028-Fc的核苷酸序列(SEQ IDNO: 49)。

[图58]图58是KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51028-Fc的氨基酸序列(SEQ IDNO: 50)。

[图59]图59是KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51005-Fc的核苷酸序列(SEQ IDNO: 51)。

[图60]图60是KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51005-Fc的氨基酸序列(SEQ IDNO: 52)。

[图61]图61是KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K50031-Fc的核苷酸序列(SEQ IDNO: 53)。

[图62]图62是KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K50031-Fc的氨基酸序列(SEQ IDNO: 54)。

[图63]图63是KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51057-Fc的核苷酸序列(SEQ IDNO: 55)。

[图64]图64是KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51057-Fc的氨基酸序列(SEQ IDNO: 56)。

[图65]图65是KLK5/KLK14抑制性肽Fc融合体D3-K51069dN-Fc的核苷酸序列(SEQID NO: 57)。

[图66]图66是KLK5/KLK14抑制性肽Fc融合体D3-K51069dN-Fc的氨基酸序列(SEQID NO: 58)。

[图67]图67是KLK5/KLK14抑制性肽Fc融合体D3-K50015-Fc的核苷酸序列(SEQ IDNO: 59)。

[图68]图68是KLK5/KLK14抑制性肽Fc融合体D3-K50015-Fc的氨基酸序列(SEQ IDNO: 60)。

[图69]图69是SPINK2突变体肽的式(SEQ ID NO: 61)。

[图70]图70是引物1的核苷酸序列(SEQ ID NO: 62)。

[图71]图71是引物2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 63)。

[图72]图72是引物3的核苷酸序列(SEQ ID NO: 64)。

[图73]图73是引物4的核苷酸序列(SEQ ID NO: 65)。

[图74]图74是引物5的核苷酸序列(SEQ ID NO: 66)。

[图75]图75是引物6的核苷酸序列(SEQ ID NO: 67)。

[图76]图76是引物7的核苷酸序列(SEQ ID NO: 68)。

[图77]图77是引物8的核苷酸序列(SEQ ID NO: 69)。

[图78]图78是引物9的核苷酸序列(SEQ ID NO: 70)。

[图79]图79是引物10的核苷酸序列(SEQ ID NO: 71)。

[图80]图80是引物11的核苷酸序列(SEQ ID NO: 72)。

[图81]图81是引物12的核苷酸序列(SEQ ID NO: 73)。

[图82]图82是引物13的核苷酸序列(SEQ ID NO: 74)。

[图83]图83是引物14的核苷酸序列(SEQ ID NO: 75)。

[图84]图84是引物15的核苷酸序列(SEQ ID NO: 76)。

[图85]图85是KLK7底物肽(氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 77中)。

[图86]图86是牛α-胰凝乳蛋白酶底物肽(氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 78中)。

[图87]图87是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶底物肽(氨基酸序列显示在SEQ ID NO:79中)。

[图88]图88是人蛋白C底物肽(氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 80中)。

[图89]图89是引物16的核苷酸序列(SEQ ID NO: 81)。

[图90]图90是引物17的核苷酸序列(SEQ ID NO: 82)。

[图91]图91是引物18的核苷酸序列(SEQ ID NO: 83)。

[图92]图92是引物19的核苷酸序列(SEQ ID NO: 84)。

[图93]图93是引物20的核苷酸序列(SEQ ID NO: 85)。

[图94]图94是引物21的核苷酸序列(SEQ ID NO: 86)。

[图95]图95是人IgG1的Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 87)。

[图96]图96是人SPINK5的D8的氨基酸序列(SEQ ID NO: 88)。

[图97]图97是人SPINK5的D9的氨基酸序列(SEQ ID NO: 89)。

[图98]图98是人SPINK9的氨基酸序列(SEQ ID NO: 90)。

[图99]图99是小鼠KLK5的氨基酸序列(SEQ ID NO: 91)。

[图100]图100是小鼠KLK7的氨基酸序列(SEQ ID NO: 92)。

[图101]图101是小鼠KLK14的氨基酸序列(SEQ ID NO: 93)。

[图102]图102包括了图以评价每种KLK5抑制性肽Fc融合体(n = 3, 平均值±SD)的KLK5抑制活性，其中使用肽底物的降解速率作为指标，以便计算抑制常数K

[图103A]图103A包括了简图以评价每种KLK5抑制性肽Fc融合体的KLK5抑制活性，其中使用人桥粒芯糖蛋白1的降解作为指标。为了评价KLK5抑制活性，使用了具有1 μM的终浓度的KLK5和具有1 μM的终浓度的重组人桥粒芯糖蛋白-1 Fc嵌合体蛋白(R&D Systems,Inc., 944-DM-100)。使用桥粒芯糖蛋白1抗体(aa471-499) (LSBio, LS-C167542)和抗-兔IgG、HRP-连接的F (ab') 2片段Donkey (GE healthcare, NA9340V)通过蛋白质印迹法进行分析。

[图103B]图103B包括了简图以评价每种KLK5抑制性肽Fc融合体的KLK5抑制活性，其中使用人桥粒芯胶蛋白1的降解作为指标。为了评价KLK5抑制活性，使用了具有0.2 μM的终浓度的KLK5和具有2 μM的终浓度的含C-端His标签的重组人桥粒芯胶蛋白-1蛋白(R&DSystems, Inc., 4955-DC-050)。使用Penta His HRP缀合物(QIAGEN, 34460)通过蛋白质印迹法进行分析。

[图104]图104是引物22的核苷酸序列(SEQ ID NO: 94)。

[图105]图105是KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO:95)。

[图106]图106是KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO:96)。

[图107A]图107A的图显示了KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc的KLK5抑制活性(IC

[图107B]图107B的图用于评价KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc与KLK7的交叉反应性，其中使用肽底物的降解速率作为指标。使用了与在图3G中相同的条件。

[图107C]图107C的图用于评价KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc与KLK14的交叉反应性，其中使用肽底物的降解速率作为指标。使用了与在图3H中相同的条件。

实施方案的描述

1. 定义

在本发明中，术语“基因”是指含有编码蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补链的核酸分子。“基因”的含义包括DNA链和RNA链的单链、双链或三链或更多链结合，以及在一条链上的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物，以及含有这样的链的双链或三链或更多链的核酸分子。

在本发明中，“基因”、“多核苷酸”和“核酸分子”具有相同的含义，并且根本不受限于核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸、核苷等（它们是其组分单元）的数目。例如，DNA、RNA、mRNA、cDNA、cRNA、探针、寡核苷酸、引物等也被包括在该范围内。“核酸分子”可以缩写为“核酸”。

在本发明中，“多肽”、“肽”和“蛋白”具有相同的含义。

在本发明中，识别靶分子X或结合靶分子X (在下文中，识别或结合作用将被统称为“X结合活性”)的肽可以被称作“X结合肽”。进一步，识别靶分子X或结合靶分子X并抑制或遏制靶分子X的一种或多种活性或功能(在下文中，抑制或遏制作用将被统称为“X抑制活性”)的肽可以被称作“X抑制性肽”。

在本发明中，“SPINK2”是指丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-型2，其为由具有三个二硫键的Kazal-样结构域组成的7kDa蛋白。SPINK2优选地衍生自人类。在本发明中，人SPINK2(SEQ ID NO: 1, 图9)将被简称作“SPINK2”, 除非另有说明。

在本发明中，“KLK5”是由N-端前肽和蛋白酶活性结构域组成且具有胰蛋白酶-样和胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶活性的蛋白，其具有添加在三个位点处的N-型糖链。KLK5优选地衍生自人类。在本发明中，人KLK5 (SEQ ID NO: 2, 图10)可以被简称作“KLK5”，除非另有说明。

在本发明中，“KLK7”是由N-端前肽和具有蛋白酶活性的胰蛋白酶-样结构域组成的蛋白，其具有添加的N-型糖链。KLK7适当地衍生自人类。在本发明中，人KLK7 (SEQ IDNO: 3, 图11)可以被简称作“KLK7”, 除非另有说明。

在本发明中，“KLK14”也被称为neuropsin，并且是由N-端前肽和具有蛋白酶活性的胰蛋白酶-样结构域组成的蛋白，其具有添加的N-型糖链。KLK14优选地衍生自人类。在本发明中，人KLK14 (SEQ ID NO: 4, 图12)可以被简称作“KLK14”, 除非另有说明。

在本发明中，“前体-型KLK5”是指由前肽和具有蛋白酶活性的结构域组成的前-KLK5。“活性KLK5”是指由具有蛋白酶活性的结构域组成的活性KLK5。活性KLK5优选地衍生自人类。

在本发明中，“前体-型KLK7”是指由前肽和具有蛋白酶活性的结构域组成的前-KLK7。“活性KLK7”是指由具有蛋白酶活性的结构域组成的活性KLK7。活性KLK7优选地衍生自人类。

在本发明中，“前体-型KLK14”是指由前肽和具有蛋白酶活性的结构域组成的前-KLK14。“活性KLK14”是指由具有蛋白酶活性的结构域组成的活性KLK14。活性KLK14优选地衍生自人类。

在本发明中，“KLK5抑制性肽”、“KLK5/KLK7抑制性肽”或“KLK5/KLK14抑制性肽”是指分别抑制或遏制KLK5、KLK5和KLK7或KLK5和KLK14的一种或多种活性或功能的肽。

术语“KLK5抑制性肽”、“KLK5/7抑制性肽”和“KLK5/KLK14抑制性肽”的范围包括这样的肽的片段、以及通过向所述肽或其片段添加或结合其它部分而形成的缀合物，所述缀合物分别维持KLK5抑制(结合)活性、KLK5/KLK7抑制(结合)活性或KLK5/KLK14抑制(结合)活性。也就是说，“KLK5抑制性肽”、“KLK5/KLK7抑制性肽”或“KLK5/KLK14抑制性肽”包括这样的肽的片段、加合物和修饰形式(诸如缀合物)，它们分别维持KLK5抑制(结合)活性、KLK5抑制(结合)活性和KLK7抑制(结合)活性、或KLK5抑制(结合)活性和KLK14抑制(结合)活性。

在本发明中，肽所结合的“位点”（也就是说，被肽识别的“位点”）是指在肽所结合或识别的靶分子上的连续的或间断的部分氨基酸序列或部分较高序结构。在本发明中，这样的位点可以被称作靶分子上的表位或结合位点。

在本发明中，“细胞”包括从动物个体、继代培养细胞、原代培养的细胞、细胞系、重组细胞、酵母和微生物衍生出的各种细胞。

在本发明中，“SPINK2突变体”是指含有如下形成的氨基酸序列的肽：在野生型SPINK2的氨基酸序列中，用不同于野生型的那些的氨基酸置换一个或多个氨基酸，删除一个或多个野生型氨基酸，或插入在野生型中未发现的一个或多个氨基酸(其在下文中将共同地称作“突变”)。具有KLK5抑制活性、KLK5抑制活性和KLK7抑制活性(KLK5/KLK7抑制活性)、或KLK5抑制活性和KLK14抑制活性(KLK5/KLK14抑制活性)的“SPINK2突变体”被包括在KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽中。在本发明中，“插入”可以被包括在“添加”的范围内。

在本发明中，在“一个至几个”中的“几个”是指3-10个。

在本发明中，短语“在严谨条件下杂交”是指在含有5×SSC的溶液中在65℃杂交，并然后在含有2×SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃洗涤20分钟，在含有0.5×SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃洗涤20分钟，和在含有0.2×SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃洗涤20分钟，或在与以上条件等同的条件下杂交。SSC是指150 mM NaCl-15 mM柠檬酸钠的水溶液，且n×SSC是指n倍浓度的SSC。

在本发明中，术语“特异性的”和“特异性”分别具有与“选择性的”和“选择性”相同的含义，并且是可互换的。例如，KLK5-特异性的抑制性肽具有与KLK5-选择性的抑制性肽相同的含义，且KLK5-和KLK7-特异性的抑制性肽具有分别与KLK5-和KLK7-选择性的抑制性肽相同的含义。

2. 肽

2-1. 氨基酸

术语“氨基酸”是指含有氨基和羧基的有机化合物，并且优选地是指作为组分单元被包含在蛋白中、更优选地在天然蛋白中的α-氨基酸。在本发明中，氨基酸的更合适的例子包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val，且术语“氨基酸”是指这共20种氨基酸，除非另外指出。这共20种氨基酸可以被称作“天然氨基酸”。本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽优选地含有天然氨基酸。

在本发明中，“氨基酸残基”可以缩写为“氨基酸”。

进一步，在本发明中，氨基酸是L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物(DL-氨基酸)，但是除非另外指出，否则是指L-氨基酸。

基于它们的共同侧链的性能，天然氨基酸可以归类进例如下述组：

(1)疏水氨基酸组：Met、Ala、Val、Leu和Ile；

(2)中性亲水氨基酸组：Cys、Ser、Thr、Asn和Gln；

(3)酸性氨基酸组：Asp和Glu；

(4)碱性氨基酸组：His、Lys和Arg；

(5)影响主链取向的氨基酸组：Gly和Pro；和

(6)芳族氨基酸组：Trp、Tyr和Phe。

但是，天然氨基酸的分类不限于这些组。

在本发明中，天然氨基酸可以经历保守氨基酸置换。

术语“保守氨基酸置换”是指用功能上等同或类似的氨基酸置换。肽中的保守氨基酸置换导致肽的氨基酸序列的静态变化。例如，具有相同极性的一个或多个氨基酸在功能上等同地起作用，从而导致肽的氨基酸序列的静态变化。一般而言，在一组内的置换可以视作在结构和功能上保守的。但是，本领域技术人员会明白，可以在含有氨基酸的分子的三维结构的背景下确定特定氨基酸残基所起的作用。例如，与还原(硫醇)形式相比，半胱氨酸残基可以采用更少极性的氧化(二硫化物)形式。精氨酸侧链的长脂族部分可以形成在结构上和在功能上重要的特征。进一步，含有芳族环(诸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的侧链可以促进离子-芳族相互作用或阳离子-pi相互作用。在这样的情况下，即使具有这些侧链的氨基酸被属于酸性或非极性组的氨基酸置换，它们也可以是在结构上和在功能上保守的。残基诸如脯氨酸、甘氨酸和半胱氨酸(二硫化物形式)可以对主链的三维结构具有直接影响，且经常不可在没有结构扭曲的情况下被置换。

保守氨基酸置换包括如下所示的基于侧链相似性的特异性置换(L. Lehninger,Biochemistry, 第2版, 第73-75页, Worth Publisher, New York (1975))和典型置换：

(1)非极性氨基酸组：丙氨酸(其在下文中将被称作“Ala”或简称“A”)、缬氨酸(其在下文中将被称作“Val”或简称“V”)、亮氨酸(其在下文中将被称作“Leu”或简称“L”)、异亮氨酸(其在下文中将被称作“Ile”或简称“I”)、脯氨酸(其在下文中将被称作“Pro”或简称“P”)、苯丙氨酸(“Phe”或简称“F”)、色氨酸(其在下文中将被称作“Trp”或简称“W”)和甲硫氨酸(其在下文中将被称作“Met”或简称“M”)；

(2)不带电荷的极性氨基酸组：甘氨酸(其在下文中将被称作“Gly”或简称“G”)、丝氨酸(其在下文中将被称作“Ser”或简称“S”)、苏氨酸(其在下文中将被称作“Thr”或简称“T”)、半胱氨酸(其在下文中将被称作“Cys”或简称“C”)、酪氨酸(其在下文中将被称作“Tyr”或简称“Y”)、天冬酰胺(其在下文中将被称作“Asn”或简称“N”)和谷氨酰胺(其在下文中将被称作“Gln”或简称“Q”)；

(3)酸性氨基酸组：天冬氨酸(其在下文中将被称作“Asp”或简称“D”)和谷氨酸(其在下文中将被称作“Glu”或简称“E”)；和

(4)碱性氨基酸组：赖氨酸(其在下文中将被称作“Lys”或简称“K”)、精氨酸(其在下文中将被称作“Arg”或简称“R”)和组氨酸(其在下文中将被称作“His”或简称“H”)。

在本发明中，所述氨基酸可以是天然氨基酸以外的氨基酸。其例子可以包括在天然的肽或蛋白中发现的氨基酸，诸如硒代半胱氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、吡咯烷、焦谷氨酸、胱氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸、甲状腺素、O-磷酸丝氨酸、锁链素、β-丙氨酸、肌氨酸、鸟氨酸、肌酸、γ氨基丁酸、冠瘿碱（opine）、茶氨酸、tricolominic acid、红藻氨酸、软骨藻酸和acromelic acid，和在自然界中未发现的其它氨基酸，诸如N-端保护的氨基酸（包括正亮氨酸、Ac-氨基酸、Boc-氨基酸、Fmoc-氨基酸、Trt-氨基酸和Z-氨基酸）、C-端保护的氨基酸（包括氨基酸叔丁基酯、苄基酯、环己基酯和芴基酯）、二胺、ω氨基酸、β氨基酸、γ氨基酸、氨基酸的Tic衍生物和氨基膦酸。但是，对这些没有限制，并且除了前述20种“天然氨基酸”以外的氨基酸为了描述的方便将在本发明中被统称为“非天然氨基酸”。

2-2. KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽和KLK5/KLK14抑制性肽

本发明的肽具有KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽和KLK5/KLK14抑制性肽所靶向的KLK5、KLK7和KLK14优选地衍生自脊椎动物，更优选地衍生自哺乳动物，此外优选地衍生自灵长类动物，最佳地衍生自人类。KLK5、KLK7和KLK14可以从组织或细胞纯化，或通过本领域技术人员已知的方法（如用于制备蛋白的方法诸如基因重组、体外翻译和肽合成）制备。信号序列、免疫球蛋白的Fc区、标签、标记等可以连接至KLK5、KLK7和KLK14。使用KLK5、KLK5和KLK7、以及KLK5和KLK14的蛋白酶活性作为指标，可以评价KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性和KLK5/KLK14抑制活性。例如，当允许KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14、或其功能片段与底物和本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽或其候选物共存时，与在有对照存在下或在没有抑制剂或其候选物存在下的蛋白酶活性相比，如果KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的蛋白酶活性是70%或更小、50%或更小、30%或更小、20%或更小、10%或更小、5%或更小、1%或更小或0%，那么发生KLK5抑制、KLK5/KLK7抑制或KLK5/KLK14抑制。抑制活性分别是30%或更多、50%或更多、70%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、99%或更多或100%。KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性和KLK5/KLK14抑制活性可以随反应条件、底物的类型、浓度等变化。反应条件可以由在实施例中描述的那些举例说明，但是对这些例子没有限制。可以如下评价酶活性：将底物肽或底物蛋白以特定浓度加入KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14并允许其反应某个时间，并在此后通过SDS-PAGE、蛋白质印迹法、液相色谱法等检测底物肽或底物蛋白的荧光。作为缓冲液，可以使用磷酸盐缓冲盐水(其在下文中将被称作“PBS”)、tris缓冲液(50 mM tris、pH 7-8.5，例如，pH 7.5)等，且可以向其中加入盐诸如NaCl (0-200 mM，例如，200 mM)、CaCl

KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性和KLK5/KLK14抑制活性各自可以用抑制常数K

KLK5、KLK7和KLK5、或KLK5和KLK14的蛋白酶底物没有特别限制，且可以是内源性底物、外源底物、合成底物等。KLK5的人内源性底物的例子可以包括低分子量激肽原或kallistatin、胶原、桥粒芯糖蛋白、桥粒芯胶蛋白和Cathelicidin。KLK7的人内源性底物的例子可以包括前-KLK3、纤连蛋白和胶原。KLK14的人内源性底物的例子可以包括tPA、纤连蛋白和胶原。通过热变性胶原得到的明胶也可以用作底物。合成底物没有特别限制，但是其例子可以包括PFR-AMC和Boc-VPR-AMC。在本发明中，KLK5抑制性肽的KLK5抑制活性(IC

进一步，本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽优选地分别不会抑制或遏制除了KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14以外的蛋白酶活性，或对其它蛋白酶活性的抑制或遏制程度优选地相对较弱。换而言之，本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的蛋白酶抑制活性优选地具有高KLK5特异性、KLK5/KLK7特异性或KLK5/KLK14特异性。本发明的肽优选地不会抑制或遏制蛋白酶诸如KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK6、KLK8、KLK9-KLK13、KLK15、胰凝乳蛋白酶、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、弹性蛋白酶、蛋白裂解酶（matriptase）、蛋白C、组织(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和血浆激肽释放酶的活性，或对它们的抑制或遏制程度相对较弱。本发明的这样的优选的肽不会表现出通过抑制或遏制其它蛋白酶的活性所造成的副作用，且适合用作KLK5相关疾病(其将在下面描述)的治疗或预防剂。进一步，本发明的KLK5-特异性的抑制性肽优选地不会抑制或遏制KLK7和KLK14的蛋白酶活性，或对其抑制或遏制程度相对较弱；本发明的KLK5/KLK7-特异性的抑制性肽优选地不会抑制或遏制KLK14的蛋白酶活性，或对其抑制或遏制程度相对较弱；和本发明的KLK5/KLK14抑制性肽优选地不会抑制或遏制KLK7的蛋白酶活性，或对其抑制或遏制程度相对较弱。

对KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14具有低特异性并抑制除了KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14以外的其它KLK的蛋白酶活性的抑制剂（也就是说，非选择性抑制剂）当施用给人类时可以造成副作用(Coussens, LM, 等人, Science, 第295卷, 第5564期, 第2387-2392页(2002): Bissett, D, 等人, J.Clin.Oncol., 第23卷, 第4期, 第842-849页(2005))。同时，对KLK5、KLK5/KLK7或KLK5/KLK14具有高特异性的抑制剂（也就是说，KLK5-特异性的抑制性肽、KLK5/KLK7-特异性的抑制性肽或KLK5/KLK14-特异性的抑制性肽）可以避免诸如上述的副作用，且因此适合用于治疗和预防KLK5相关疾病(其将在下面描述)。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK5 抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽可以竞争性地抑制蛋白酶底物与KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14的结合。

如上所述，被本发明的肽靶向的KLK5、KLK7和KLK14源自脊椎动物，优选地源自哺乳动物，更优选地源自灵长类动物，此外优选地源自人类，但是可以源自非人动物，例如，啮齿类动物诸如大鼠和小鼠，和灵长类动物诸如食蟹猴、普通绒猴和恒河猴。对非人动物-衍生的KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14具有抑制活性的肽可以用于，例如，诊断、试验、治疗或预防非人动物中与KLK5有关的疾病。进一步，当这样的肽也抑制人KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14时，使用这样的非人动物作为动物病理学模型的药理学试验和药代动力学试验、使用它们作为健康动物的安全性试验和毒性试验等可以在作为KLK5相关疾病(其将在下面描述)的治疗或预防剂的肽的非临床研究和开发中执行。

进一步，与其它生物聚合物诸如在本领域中用作药物和诊断剂的抗体相比，本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽和KLK5/KLK14抑制性肽具有优点诸如低分子量、相对容易生产(其将在下面描述)、优秀的物理性能诸如贮存稳定性和热稳定性、和当用作药物组合物(其将在下面描述)时关于施用途径、施用方法、制剂等的宽选择范围。进一步，当用作药物组合物时在血液中的半衰期通过应用已知方法可以调节得更长，诸如添加生物聚合物和聚合物以增加本发明的肽的分子量。本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽和KLK5/KLK14抑制性肽具有小于10,000、优选地小于8,000、更优选地约7,000-7,200的分子量。进一步，由SEQ ID NO: 61 (图69)中的Cys15至Cys31组成的可变环部分、或具有KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性的由Cys15至Cys63组成的部分(在下文中，被称作“含有6个Cys残基的部分”)也分别被包括在本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽中。所述可变环部分具有小于2,500、优选地约1,800-2,000的分子量，且含有6个Cys的部分具有小于6,000、优选地约5,300-5,500的分子量。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽是SPINK2突变体(其可以在下文中缩写为“SPINK2突变体”)，其中SPINK2的主链至少部分地维持，且优选地识别KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的部分肽、部分较高序结构等或与其结合(在下文中，识别或结合作用将被统称为“靶标结合活性”)。

使用本领域技术人员已知的方法诸如ELISA、表面等离子体共振(在下文中，被称作“SPR”)分析、生物层干扰量度法(在下文中，被称作“BLI”)、等温滴定量热法(在下文中，被称作“ITC”)、流式细胞计量术和免疫沉淀，可以测量或确定在本发明中SPINK2突变体与KLK5、KLK7或KLK14的结合。

ELISA的例子包括检测KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的方法，所述抑制性肽识别并结合固定化在平板上的KLK5、KLK5/KLK7、或KLK5/KLK14。识别KLK5、KLK5/KLK7、或KLK5/KLK14的用于固相的抗体、或与KLK5、KLK5/KLK7、或KLK5/KLK14融合的标签可以用于固定化除了生物素-抗生蛋白链菌素以外的KLK5、KLK5/KLK7、或KLK5/KLK14。识别KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的用于检测的经标记的抗体、或与KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽融合的标签可以用于检测除了经标记的抗生蛋白链菌素以外的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽。可以为生化分析诸如HRP、碱性磷酸酶和FITC执行的方法可以用于生物素以外的标记。关于使用酶标记的检测，可以使用生色底物诸如TMB (3,3',5,5'-四甲基联苯胺)、BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)、p-NPP (对硝基苯基磷酸酯)、OPD (邻苯二胺)、ABTS (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和SuperSignal ELISA Pico化学发光底物(ThermoFisher Scientific)、荧光底物诸如QuantaBlu (R)发荧光的过氧化物酶底物(ThermoFisher Scientific)和化学发光底物。吸收平板读数器、荧光平板读数器、发光平板读数器、RI液体闪烁计数器等可以用于测量检测信号。

通过SPR分析进行的测量方法可以是以下任一种：将SPINK2突变体肽固定化到Sensor Chip上并添加靶分子诸如KLK5以测量二者之间的结合的方法；和将靶分子诸如KLK5固定化到Sensor Chip上并添加SPINK2突变体肽以测量二者之间的结合的方法。前者是优选的。关于固定化在本发明的肽或其缀合物中所含的SPINK2突变体，可以使用直接法或捕获法。后者是优选的。在直接法中，SPINK2突变体的疏水性、SPINK2的氨基和羧基等可以用于直接固定化。在捕获法中，识别缀合物或与缀合物融合的标签的抗体、蛋白A、蛋白G等可以用于固定化，除了生物素-抗生蛋白链菌素以外。将使用测定缓冲液稀释的靶分子诸如KLK5添加至在其上面固定化了SPINK2突变体的Sensor Chip，并随时间观察SPR信号以得到结合传感图。随后，加入不含靶分子诸如KLK5的测定缓冲液，并随时间观察SPR信号以得到解离传感图。使用得到的传感图分析结合亲和力，以计算解离常数K

免疫沉淀的例子包括检测被固定化在珠子上的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽所识别和结合的KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的方法。关于珠子，可以使用磁珠、琼脂糖珠子等。关于固定化KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽，可以使用识别这样的肽或与所述肽融合的标签的抗体、蛋白A、蛋白G等，除了生物素-抗生蛋白链菌素以外。通过磁体、离心等分离珠子，并通过SDS-PAGE或蛋白质印迹法检测与珠子一起沉淀的KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14。关于检测KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14，可以使用用于检测的经标记的抗体，其识别与KLK5、KLK7或KLK14融合的标签、或KLK5、KLK7或KLK14等，除了经标记的抗生蛋白链菌素以外。可以为生化分析诸如HRP、碱性磷酸酶和FITC执行的方法可以用于标记，除了生物素以外。关于使用酶标记的检测，可以使用与在ELISA中所用相同的底物。为了测量检测信号，可以使用ChemiDoc (R)(BioRad)、LuminoGraph (ATTO)等。

在本发明中，“特异性识别”（也就是说，“特异性结合”）是指不是非特异性吸附的结合。确定结合是否是特异性的标准的例子可以包括在ELISA中的结合活性EC

作为本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的SPINK2突变体可以具有如上所述的蛋白酶抑制活性、靶标结合活性、其它性能、功能和特征，尽管它的全长氨基酸序列与人野生型SPINK2的氨基酸序列具有高序列同一性。本发明的SPINK2突变体与人SPINK2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1, 图7)具有60%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、98%或更多或99%或更多的序列同一性。

术语“同一性”是指表示两个序列之间的相似或关联程度的性质。如下计算氨基酸序列的同一性(%)：将相同的氨基酸或氨基酸残基的数目除以氨基酸或氨基酸残基的总数，并将得到的数值乘以100。

术语“缺口”是指由至少一个序列中的缺失和/或添加引起的在2个或多个序列之间的比对中的缺口。

具有完全相同的氨基酸序列的两个氨基酸序列之间的同一性是100%，但是当将氨基酸序列之一与另一个对比且一个或多个氨基酸或氨基酸残基被置换、删除或添加时，二者之间的同一性小于100%。用于在考虑缺口的情况下确定两个序列之间的同一性的算法或程序的例子可以包括本领域技术人员已知的使用标准参数的技术，诸如BLAST (Altschul,等人. Nucleic Acids Res., 第25卷, 第3389-3402页, 1997), BLAST2 (Altschul, 等人, J. Mol. Biol., 第215卷, 第403-410页, 1990),和Smith-Waterman (Smith, 等人,J. Mol. Biol., 第147卷, 第195-197页, 1981)。

在本发明中，术语“突变的”是指，与天然存在的核酸分子或肽相比，核苷酸序列或氨基酸序列中的一个或多个核苷酸、核苷酸残基、氨基酸或氨基酸残基已经被置换、删除或插入。与人SPINK2的氨基酸序列相比，本发明的SPINK2突变体的氨基酸序列具有一个或多个突变的氨基酸或氨基酸残基。

在本发明的一个方面，SPINK2突变体的氨基酸序列可以具有：在人SPINK2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1, 图9)中，被其它氨基酸或氨基酸残基置换的Ser16至Gly22中的1、2、3、4、5、6或7个氨基酸；被其它氨基酸或氨基酸残基置换的Pro24至Asn28中的1、2、3、4或5个氨基酸；和为了删除天然二硫键或产生非天然二硫键而被其它氨基酸置换的Cys15、Cys23、Cys31、Cys42、Cys45和Cys63中的1、2、3、4、5或6个，尽管为了维持天然二硫键它们优选地是与野生型中相同的Cys。在本发明的SPINK2突变体的某些优选的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽中，Cys维持在与天然类型中相同的6个位点处以保留二硫键。在这样的肽的某些更优选的方面，Cys15至Cys45、Cys23至Cys42、和Cys31至Cys63各自形成二硫键。

当这样的SPINK2突变体的氨基酸序列被包含在KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽中时，优选地维持由以下结构构成的三维结构：由野生型SPINK2的氨基酸序列所含的Ser16至Val30组成的环结构，由Cys31和Gly32组成的β链(1)和由Ile57至Arg59组成的β链(2)所组成的β-折叠，和由Glu41至Gly51组成的α-螺旋，或与以上(其位置)类似或至少部分地对应的环结构、β-折叠和α-螺旋，达到可以发挥KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性的程度。

下面将描述根据本发明的SPINK2突变体的某些方面的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的氨基酸序列。如上所述，“氨基酸残基”在本发明中可以简单地表示为“氨基酸”。

在SEQ ID NO: 61 (图69)所示的氨基酸序列(式)中，X

在KLK5抑制性肽所含的SEQ ID NO: 61(图69)中所示的氨基酸序列中，合适的是：Xaa16 (X

在KLK5/KLK7抑制性肽所含的SEQ ID NO: 61(图69)中所示的氨基酸序列中，合适的是：Xaa16 (X

在KLK5/KLK14抑制性肽所含的SEQ ID NO: 61(图69)中所示的氨基酸序列中，合适的是：Xaa16 (X

野生型的Xaa16-22和Xaa24-28 (X

在本发明中，一个至几个或更多个、优选地1-5个氨基酸可以进一步添加至第一个氨基酸的N-端侧。这样的氨基酸添加的例子可以优选地包括1-5个Asp和/或Glu的添加(Asp和Glu都可以被包括)，更优选地1-5个Asp的添加或1-5个Glu的添加。

在本发明中，通过在SPINK2突变体肽(其在下文中将被称作“母体肽”)的N-端和/或C-端加成化合物的添加部分中或从其置换、添加和/或删除一个或多个氨基酸而形成并且部分地或完全地维持SPINK2突变体肽的活性的肽可以被称作“母体肽的衍生物”或“母体肽衍生物”。这样的“衍生物”也被包括在本发明的“肽”的范围内。

在本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的范围内包括的SPINK2突变体的氨基酸序列可以在除了X

在充当本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的SPINK2突变体的氨基酸序列中，X

进一步，充当本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的SPINK2突变体的氨基酸序列的例子可以包括在下面的氨基酸序列(a1)至(a4)、(b1)至(b4)、或(c1)至(c4)中的任一个：

(a1)由在SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18和20 (图14、16、18、20、22、24、26和28)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸组成的氨基酸序列；

(a2)由特定核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述特定核苷酸序列在严谨条件下与编码在(a1)中描述的氨基酸序列的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(a3)通过在(a1)中描述且在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个氨基酸而形成的氨基酸序列；和

(a4)与在(a1)中描述且在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列,

(b1)由在SEQ ID NO: 22、24、26和28 (图30、32、34和36)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸组成的氨基酸序列；

(b2)由特定核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述特定核苷酸序列在严谨条件下与编码在(b1)中描述的氨基酸序列的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(b3)通过在(b1)中描述且在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个氨基酸而形成的氨基酸序列；和

(b4)与在(b1)中描述且在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列，或者

(c1)由在SEQ ID NO: 30和32 (图38和40)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸组成的氨基酸序列；

(c2)由特定核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述特定核苷酸序列在严谨条件下与编码在(c1)中描述的氨基酸序列的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(c3)通过在(c1)中描述且在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个氨基酸而形成的氨基酸序列；和

(c4)与在(c1)中描述且在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列。

在SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32 (图14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)中的位置64和65处的氨基酸不是与野生型人SPINK2(SEQ ID NO: 1，图9：由63个氨基酸组成)中的那些对应的氨基酸，而是在本发明的一个方面为了表达本发明的肽而添加。

为了改善折叠稳定性、热稳定性、贮存稳定性、在血液中的半衰期、水溶性、生物活性、药理学活性、副作用等的目的，可以将突变引入本发明的肽中。例如，通过突变可以引入新反应基团诸如Cys用于与其它物质诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白缀合。

在本发明中，KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽可以连接或添加至其它部分，且这样的缀合物分别被称作“KLK5抑制性肽缀合物”、“KLK5/KLK7抑制性肽缀合物”或“KLK5/KLK14抑制性肽缀合物”。在本发明中，“缀合物”是指通过其它部分与本发明的肽或其片段的结合而形成的分子。“缀合物”或“缀合”包括经由化学物质诸如交联剂或经由活性物质等（其适合用于通过合成化学方法、或通过基因工程方法等将所述部分连接至氨基酸侧链）连接或结合至本发明的肽的N-端和/或C-端的部分。改善在血液中的半衰期的这样的“部分”的例子可以包括聚亚烷基二醇分子诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、脂肪酸分子诸如棕榈酸、免疫球蛋白的Fc区(例如，人免疫球蛋白G1的Fc区：其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 87、图95中)、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白或其片段、白蛋白结合肽、白蛋白结合蛋白诸如链球菌蛋白G和转铁蛋白。关于其它“部分”，本发明的肽可以经由接头诸如肽接头连接至这样的“部分”。

在本发明的一个方面，这样的缀合物是本发明的SPINK2突变体肽与抗体或其片段的Fc区的融合体。抗体起源的例子可以包括人类和非人动物，包括啮齿类动物诸如小鼠、大鼠和兔，其它哺乳动物诸如牛、猪、狗、食蟹猴、绒猴和恒河猴，和禽类诸如鸡，但是优选地来自人类。抗体的例子可以包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，优选地IgG1。更优选地，所述缀合物是本发明的肽与人IgG1或其片段的Fc区的融合体。尽管本发明的肽与所述抗体或其片段的Fc区的融合体可以被称作“Fc融合体”或“缀合物”，但是都具有相同的含义。

人IgG1的Fc区的例子可以包括含有在SEQ ID NO: 87 (图95)中所示的氨基酸序列或由其组成的区域，但是对此没有限制。抗体的Fc区可以是野生型或突变型。

进一步，为了发挥或增强药理学活性，本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽可以与另一种药物缀合。通过用本发明的肽替换抗体，在抗体领域中作为抗体-药物缀合物(ADC)被本领域技术人员已知的技术和方面可以构成本发明的一些方面。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽可以进一步含有分别对除了KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14以外的靶分子发挥结合亲和力、抑制活性、拮抗剂活性和激动剂活性的一个或多个部分，或可以与这样的部分缀合。这样的“部分”的例子可以包括抗体或其片段，和具有除了所述抗体（诸如SPINK2突变体或其片段）以外的主链的蛋白。通过用本发明的肽替换其中所含的两种或更多种“抗体”中的至少一种，在抗体领域中作为多特异性抗体和双特异性抗体被本领域技术人员已知的技术和方面落入本发明的缀合物的某些方面。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽或其前体可以含有信号序列。存在于多肽或其前体的N-端处或向其添加的信号序列可用于将多肽递送至细胞的特定隔室，诸如在大肠杆菌（Escherichia coli）的情况下的周质和在真核细胞的情况下的内质网。许多信号序列是本领域技术人员已知的，且可以根据宿主细胞选择。用于将期望的肽分泌进大肠杆菌的周质中的信号序列的例子可以包括OmpA。含有这样的信号序列的一个实施方案也可以被包括在本发明的缀合物中作为一个方面。

进一步，通过预先向本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽添加标签，可以通过亲和色谱法纯化肽。

例如，本发明的肽在其C-端处可以含有生物素、Strep标签(R)、Strep标签II (R)、寡组氨酸诸如His6、聚组氨酸、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、钙调蛋白结合肽(CBP)、半抗原诸如地高辛配基和二硝基苯酚、表位标签诸如FLAG(R)、myc标签、H标签等(在下文中，被统称为“亲和标签”)。标签加合物也可以被包含在本发明的缀合物中作为一些方面。本发明的缀合物可以整体是肽(多肽)。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽可以含有标记部分，且可以用标记部分诸如酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、产色标记、发光标记、半抗原、地高辛配基、生物素、金属络合物、金属和胶体金特异性地缀合。含有标记部分的方面也可以被包含在本发明的缀合物中作为一些方面。

本发明的KLK5抑制性肽缀合物、KLK5/KLK7抑制性肽缀合物或KLK5/KLK14抑制性肽缀合物的氨基酸序列的例子可以包括以下氨基酸序列(a1)至(a4)、(b1)至(b4)、或(c1)至(c4)中的任一个：

(a1)在SEQ ID NO: 34、36、38、40、42、44、46、48和96 (图42、44、46、48、50、52、54、56和106)中的任一个中所示的氨基酸序列；

(a2)由特定核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述特定核苷酸序列在严谨条件下与编码在(a1)中描述的氨基酸序列的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(a3)通过在(a1)中描述且在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个氨基酸而形成的氨基酸序列；和

(a4)与在(a1)中描述且在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列,

(b1)在SEQ ID NO: 50、52、54和56 (图58、60、62和64)中的任一个中所示的氨基酸序列；

(b2)由特定核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述特定核苷酸序列在严谨条件下与编码在(b1)中描述的氨基酸序列的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(b3)通过在(b1)中描述且在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个氨基酸而形成的氨基酸序列；和

(b4)与在(b1)中描述且在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列，或者

(c1)在SEQ ID NO: 58和60 (图66和68)中的任一个中所示的氨基酸序列；

(c2)由特定核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述特定核苷酸序列在严谨条件下与编码在(c1)中描述的氨基酸序列的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(c3)通过在(c1)中描述且在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个氨基酸而形成的氨基酸序列；和

(c4)与在(c1)中描述且在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽(其氨基酸序列)可以含有天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸可以包括L-氨基酸和D-氨基酸。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽可以作为单体、二聚体、三聚体或较高的寡聚体或多聚体存在。二聚体、三聚体或较高的寡聚体和多聚体可以是由单一类型的单体组成的同聚体或由两种或更多种不同类型的单体组成的异聚体。单体可以快速扩散以在例如穿透进组织方面是优良的。二聚体、寡聚体和多聚体可以具有优良方面诸如对靶分子的局部高亲和力或结合活性、低解离速率、或高KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性。除了自发的二聚化、寡聚化和多聚化以外，通过向本发明的肽中引入jun-fos结构域、亮氨酸拉链等也可以实现预期的二聚化、寡聚化和多聚化。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽可以以单体、二聚体、三聚体或较高的寡聚体或多聚体的形式结合一种或多种靶分子或抑制靶分子的活性。

本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的形式的例子可以包括分离的形式(诸如冷冻干燥的制品和溶液)、前述缀合物和与其它分子结合的形式(诸如固定化形式、与外来分子结合和与靶分子结合的形式)，但是对这些例子没有限制，且可以任选地选择适合于表达、纯化、应用、贮存等的形式。

3. KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽和KLK5/KLK14抑制性肽的鉴定

使用SPINK2的氨基酸序列或本发明的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽和KLK5/KLK14抑制性肽的氨基酸序列(例如，根据上面(a1)、(b1)或(c1)的氨基酸序列)、编码这样的氨基酸序列的核苷酸序列、含有这样的核苷酸序列的核酸分子等作为起始原料，通过本领域技术人员已知的方法可以鉴定KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽和KLK5/KLK14抑制性肽。作为合适的例子，分别使用KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性作为指标，且与KLK5、KLK5/KLK7、或KLK5/KLK14的结合活性可以分别组合使用作为指标，从人SPINK2突变体文库可以做出这样的鉴定。

例如，可以对充当起始原料的核酸分子进行诱变以使用重组DNA技术引入适当的细菌或真核宿主中。SPINK2突变体文库被称作用于鉴定靶分子的结合剂或抑制剂的技术。例如，在国际公开号WO 2014/024914中的公开内容通过对其整体的提及也被包括在本发明的公开中。在适当的宿主中表达发生诱变的核苷酸序列以后，可以从文库中浓缩和/或选择通过将具有期望的性能、活性、功能等的SPINK2突变体与其遗传性状连接而形成的克隆以鉴别。关于浓缩和/或选择克隆，可以使用本领域技术人员已知的方法诸如细菌展示方法(Francisco, J. A., 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 第90卷, 第10444-10448页)、酵母展示方法(Boder, E. T., 等人(1997) Nat. Biotechnol., 第15卷, 第553-557页)、哺乳动物细胞展示方法(Ho M, 等人(2009) Methods Mol Biol., 第525卷,第337-352页)、噬菌体展示方法(Smith, G. P. (1985) Science., 第228卷, 第1315-1317页)、核糖体展示方法(Mattheakis LC, 等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA,第91卷, 第19期, 第9022-9029页)、核酸展示方法(Nemoto N, 等人(1997) FEBS Lett.,第414卷, 第2期, 第405-408页)诸如mRNA展示和集落筛选方法(Pini, A. 等人(2002)Comb. Chem. High Throughput Screen., 第5卷, 第503-510页)。确定在选择和鉴定的克隆中所含的SPINK2突变体的核苷酸序列。由此，由核苷酸序列编码的氨基酸序列可以确定为SPINK2突变体的氨基酸序列，也就是说，在克隆中所含的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽。

可以得到本发明的SPINK2突变体，例如，通过在天然的SPINK2中的诱变。“诱变”是指实现用其它氨基酸置换存在于氨基酸序列中的一些位置处的一个或多个氨基酸或删除，或插入在氨基酸序列中不存在的氨基酸。这样的删除或插入可以改变序列长度。在本发明的SPINK2突变体中，诱变可以优选地发生在SEQ ID NO: 61(图69)中所示的氨基酸序列内的X

但是，突变体的范围也包括具有与在天然氨基酸序列的特定位置处存在的相同氨基酸的那些，也就是说，在这样的合适诱变以后在X

术语“随机诱变”是指，以某种概率通过诱变在序列中的特定位置处引入一个或多个不同的氨基酸，但是并非引入氨基酸的概率都是相同的。进一步，在本发明中，不可阻止在至少两个不同氨基酸中包含天然存在的氨基酸(作为氨基酸之一)，且“随机诱变”的范围也包括这样的情况。

关于在特定位置处的随机诱变的方法，可以使用本领域技术人员已知的标准方法。例如，使用含有简并核苷酸组合物的合成寡核苷酸的混合物，通过PCR (聚合酶链式反应)可以在序列内的特定位置处诱导突变。例如，密码子NNK或NNS (N = 腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶; K = 鸟嘌呤或胸腺嘧啶; S = 腺嘌呤或胞嘧啶)的应用会诱导突变以引入除了所有20种天然氨基酸以外的终止密码子，而密码子VVS (V = 腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶)的应用会消除引入Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr和Val的可能性并诱导突变以引入其它12种天然氨基酸。进一步，密码子NMS (M = 腺嘌呤或胞嘧啶)的应用会消除引入Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp和Val的可能性并诱导突变以引入例如其它11种天然氨基酸。特殊密码子、人工密码子等可以用于诱导突变以引入非天然氨基酸。

对于从其衍生出肽的靶标或野生型肽，使用含有靶标和/或肽的较高阶结构的结构信息也可以执行位点特异性的诱变。在本发明中，关于KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14，使用含有靶标KLK5、KLK7或KLK14和/或SPINK2突变体、野生型SPINK2或两种的复合物的较高阶信息的结构信息，可以引入位点特异性的突变。可能存在这样的情况，其中可以在KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性和结构信息之间发现关联，所述结构信息例如如下得到：鉴定具有KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性的SPINK2突变体，然后得到KLK5、KLK7或KLK14和SPINK2突变体复合物的晶体以执行X-射线晶体结构分析，并基于分析结果指定SPINK2突变体所结合的KLK5、KLK7或KLK14分子上的表位以及与所述表位对应的SPINK2突变体上的互补位。基于结构-活性关联，设计在特定位置处的特定氨基酸置换、或在特定位置处的氨基酸的插入或删除等，使得可以实际证实KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性。

进一步，可以诱导突变，例如，使用修饰碱基对特异性的核苷酸组分单元诸如肌苷。

进一步，可以在随机位置诱导突变，例如，通过使用没有校准功能的具有高错误率的DNA聚合酶（诸如耐热性DNA聚合酶）的易出错PCR方法、化学诱变等。

使用细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、噬菌体展示、核糖体展示、核酸展示、集落筛选等，从本领域技术人员已知的各种筛选方法的合适文库诸如噬菌体文库和集落文库可以浓缩和/或选择KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽。使用本领域技术人员已知的适合于各种文库的载体和方法，诸如用于噬菌体文库的噬粒和用于这些文库中的集落筛选的粘粒，可以实现文库的构建。载体可以是感染原核或真核细胞的病毒或病毒载体。通过本领域技术人员已知的方法诸如基因工程，可以制备这样的重组载体。

细菌展示是，例如，将期望的蛋白与大肠杆菌的外膜脂蛋白(Lpp)的一部分和外膜蛋白OmpA融合以将期望的蛋白呈递在大肠杆菌的表面上的技术。将DNA组（其通过在编码蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的随机诱变得到）引入适合用于细菌展示的载体以用所述载体转化细菌细胞。因而，可以在转化的细菌细胞的表面上得到呈递随机诱变处理的蛋白组的文库(Francisco, J. A., 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 第90卷, 第10444-10448页)。

酵母展示是使期望的蛋白与酵母细胞表面的外壳上的蛋白（诸如α-凝集素）融合以将其呈递在酵母表面上的技术。α-凝集素含有C-端疏水区域（据信其是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着信号）、信号序列、活性结构域、细胞壁结构域等，并且期望的蛋白可以通过操作它们而展示在酵母细胞的表面上。将DNA组（其通过在编码蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列中随机诱变得到）引入适合用于酵母展示的载体以用所述载体转化酵母细胞。因而，可以在转化的酵母细胞的表面上得到呈递随机诱变处理的蛋白组的文库(Ueda, M. 和Tanaka,A., Biotechnol. Adv., 第18卷, 从第121页，公开于2000; Ueda, M. 和Tanaka, A., J.Biosci. Bioeng., 第90卷, 从第125页，公开于2000)。

动物细胞展示是，例如，使期望的蛋白与以血小板-衍生的生长因子受体(PDGFR)为代表的膜蛋白的跨膜区域融合以将期望的蛋白呈递在哺乳动物细胞（诸如HEK293和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞）的表面上的技术。将DNA组（其通过在编码蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的随机诱变得到）引入适合用于动物细胞展示的载体以用所述载体转染动物细胞。因而，可以在转染的动物细胞的表面上得到呈递随机诱变处理的蛋白组的文库(Ho M, 等人(2009) Methods Mol Biol., 第525卷, 第337-352页)。

可以将在细胞诸如酵母、细菌和动物细胞上呈递的期望文库在有靶分子存在下温育或与靶分子发生接触。例如，在将含有文库和用生物素等修饰的KLK5、KLK7或KLK14的细胞温育某个时间以后，向其加入载体诸如磁珠，将细胞与载体分离，然后洗涤载体以除去非特异性的吸附物和结合物。因而，可以收集呈递与载体结合的肽(或结合载体的KLK5、KLK7或KLK14)、肽的组件或浓缩的肽组件的细胞组。同样地，通过在添加磁珠以后执行磁性细胞分离(MACS)或在使用抗-KLK5抗体、抗-KLK7抗体或抗-KLK14抗体进行细胞染色以后执行FACS，可以收集呈递与载体结合的肽(或结合载体的KLK5、KLK7或KLK14)或KLK5、KLK7或KLK14、肽的组件或浓缩的肽组件的细胞组。例如，可以对非特异性的吸附位点和/或结合位点进行封闭处理，且可以并入封闭步骤，只要它是适当的方法。将表达如此得到的肽、肽组件或浓缩的肽组件的载体收集，并确定插入载体中的多核苷酸的核苷酸序列，使得可以确定由核苷酸序列编码的氨基酸序列。进一步，可以如下更高地浓缩与靶分子结合的肽组件：将所述载体再次引入宿主细胞中，并将前述操作作为一个循环重复一次至几次。

在噬菌体展示的情况下，噬粒是例如含有除了质粒复制起点以外的从单链细菌噬菌体衍生出的第二复制起点的细菌质粒。含有噬粒的细胞可以在与M13或类似的辅助细菌噬菌体的重叠感染中通过单链复制模式复制噬粒。也就是说，单链噬粒DNA被包装在用细菌噬菌体外壳蛋白包被的传染性颗粒中。因而，噬粒DNA可以作为克隆的双链DNA质粒形成在被感染的细菌中，且噬粒可以从超感染的细胞的培养物上清液作为细菌噬菌体-样颗粒形成。颗粒本身可以如下重新形成为质粒：将细菌噬菌体-样颗粒注射进具有性菌毛的细菌中以便用这样的DNA感染细菌。

将含有具有编码试验肽的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸和细菌噬菌体外壳蛋白基因的融合基因插入噬粒中以感染细菌，并培养这样的细胞。因而，所述肽可以在细菌或噬菌体-样颗粒上表达或呈递(与展示相同的含义)，或可以在噬菌体颗粒或细菌的培养物上清液中生产为具有外壳蛋白的融合蛋白。

例如，通过将含有多核苷酸和细菌噬菌体外壳蛋白基因gpIII的融合基因插入噬粒中用于与M13或类似的辅助噬菌体一起重叠感染大肠杆菌，所述肽可以在大肠杆菌的培养物上清液中生产为含有所述肽和外壳蛋白的融合蛋白。

在使用各种环状或非环状载体诸如病毒载体替代噬粒的情况下，可以将具有由插入这样的载体中的多核苷酸的核苷酸序列编码的氨基酸序列的肽在其中引入了所述载体的细胞或病毒样颗粒上表达或呈递，或可以根据本领域技术人员已知的方法在所述细胞的培养物上清液中生产。

表达如此得到的肽的文库可以在有靶分子存在下温育或与靶分子发生接触。例如，将向其固定化了KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14的载体与含有文库的流动相一起温育某个时间，此后将流动相与载体分离，然后洗涤载体以除去非特异性的吸附物和结合物。因而，通过洗脱可以收集与载体结合的肽(或结合载体的KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14)、肽组件或浓缩的肽组件。所述洗脱可以在相对高的离子强度、低pH和中等变性条件下在有离液盐等存在下非选择性地进行，或可以如下选择性地进行：加入可溶性的靶分子诸如KLK5、KLK7和KLK14、结合靶分子的抗体、天然配体、底物等，以允许混合物与固定化的靶分子竞争。可以对非特异性的吸附位点和/或结合位点进行例如封闭处理，且可以并入封闭步骤，只要它是适当的方法。

将表达如此得到的肽、肽组件或浓缩的肽组件的载体收集，并确定插入载体中的多核苷酸的核苷酸序列，使得可以确定由核苷酸序列编码的氨基酸序列。进一步，可以如下更高地浓缩与靶分子结合的肽组件：将所述载体再次引入宿主细胞中，并将前述操作作为一个循环重复一次至几次。

核糖体展示是在试管内合成期望的蛋白和与其对应的mRNA以及核糖体-连接的分子的技术，例如，使用不含终止密码子的编码期望蛋白的mRNA和无细胞蛋白合成系统。使用mRNA组（其通过编码蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列中的随机诱变得到）和无细胞蛋白合成系统，可以得到在核糖体上呈递随机诱变处理的蛋白组的文库(Mattheakis LC, 等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 第91卷, 第19期, 第9022-9029页)。

核酸展示也被称为mRNA展示，并且是合成期望的蛋白、编码蛋白的mRNA和核糖体-连接的分子的技术，例如，使用接头诸如与酪氨酰tRNA的3'末端具有类似结构的嘌呤霉素。由于这样的技术使用无细胞蛋白合成系统替代活细胞，在试管内的合成是可能的。使用mRNA组（其通过编码蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的随机诱变得到）、接头诸如嘌呤霉素和无细胞蛋白合成系统，可以得到在核糖体上呈递随机诱变处理的蛋白组的文库(NemotoN, 等人(1997) FEBS Lett., 第414卷, 第2期, 第405-408页)。

通过无细胞合成系统（诸如核糖体展示或核酸展示）得到并表达所述肽的文库可以在有靶分子存在下温育或与靶分子发生接触。例如，将向其固定化了KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14的载体与含有文库的流动相一起温育某个时间，此后将流动相与载体分离，然后洗涤载体以除去非特异性的吸附物和结合物。因而，通过洗脱可以收集与载体结合的肽(或结合载体的KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14)、肽组件或浓缩的肽组件。所述洗脱可以在相对高的离子强度、低pH和中等变性条件下在有离液盐等存在下非选择性地进行，或可以如下选择性地进行：加入可溶性的靶分子诸如KLK5、KLK7和KLK14、结合靶分子的抗体、天然配体、底物等，以允许混合物与固定化的靶分子竞争。可以对非特异性的吸附位点和/或结合位点进行例如封闭处理，且可以并入封闭步骤，只要它是适当的方法。

将表达如此得到的肽、肽组件或浓缩的肽组件的核酸收集，并在mRNA的情况下反转录成cDNA以后确定核苷酸序列，使得可以确定由核苷酸序列编码的氨基酸序列。进一步，可以如下更高地浓缩与靶分子结合的肽组件：从由此收集的核酸转录mRNA，并将前述操作作为一个循环重复一次至几次。

通过将亲和标签缀合至肽、肽组件或预先浓缩的肽组件，可以有效地纯化所述肽或其组件。例如，通过预先将蛋白酶的底物作为标签缀合至肽组件并然后通过蛋白酶活性切割它，可以洗脱所述肽。

基于得到的序列信息和所述肽的功能等，在克隆或得到的文库中诱导其它突变，使得从具有引入的突变的文库可以得到具有改善的功能(例如，KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性)、物理性能(诸如热稳定性和贮存稳定性)、药代动力学(诸如在血液中的分布和半衰期)等的肽。

通过确定得到的肽是否分别具有KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性，可以鉴定KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽。

进一步，KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽可以优选地维持由以下结构构成的三维结构：由野生型SPINK2的氨基酸序列所含的Ser16至Val30组成的环结构，由Cys31和Gly32组成的β链(1)和由Ile57至Arg59组成的β链(2)所组成的β-折叠，和由Glu41至Gly51组成的α-螺旋，或与以上(其位置)类似或至少部分地对应的环结构、β-折叠和α-螺旋，达到可以发挥KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性的程度。使用这样的三维结构(整个结构或部分结构)作为指标的部分也可能鉴定更合适的KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽。

进一步，本发明涉及使用SPINK2突变体文库鉴定KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的方法，且其例子可以包括在上面(75)中描述的方法。进一步，本发明涉及使用各种化合物文库鉴定KLK5抑制性化合物、KLK5/KLK7抑制性化合物或KLK5/KLK14抑制性化合物的方法。在这样的方法中，本发明的肽或其缀合物可以用作参照化合物、对照等，且这样的方法可以由上面的(76)举例说明。在这样的方法中，当化合物的酶抑制活性等于或强于参照化合物或对照的酶抑制活性时，可以确定试验化合物是阳性的，而当酶抑制活性更弱时，可以确定所述化合物是阴性的。包括这样的对比的方法可以由上面的(77)举例说明。同时，本发明的肽或其缀合物可以在包括测量KLK5和任选的KLK7或KLK14的蛋白酶活性的步骤的任何试验中用作参照化合物、对照等，且这样的试验方法也被包括在本发明中。这样的试验没有特别限制，且可以由上面的(78)举例说明。其合适例子可以包括诊断方法、试验方法、检测方法和用于鉴定向其施用本发明的药物组合物的个体的方法(都将在下面描述)。

4. 编码本发明的肽或其缀合物的核酸分子、含有它们的载体、含有它们的细胞、以及生产重组肽或缀合物的方法.

本发明也提供了含有编码在KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽中所含的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(其在下文中将被称作“编码KLK5抑制性肽的核酸分子”、“编码KLK5/KLK7抑制性肽的核酸分子”或“编码KLK5/KLK14抑制性肽的核酸分子”)，插入了这样的基因的重组载体，引入了所述基因或所述载体的细胞(其在下文中将被称作“含有编码KLK5抑制性肽的核酸分子的细胞”、“含有编码KLK5/KLK7抑制性肽的核酸分子的细胞”或“含有编码KLK5/KLK14抑制性肽的核酸分子的细胞”)，生产KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的细胞(其在下文中将被称作“生产KLK5抑制性肽的细胞”、“生产KLK5/KLK7抑制性肽的细胞”或“生产KLK5/KLK14抑制性肽的细胞”)。

本发明的编码KLK5抑制性肽的核酸分子、编码KLK5/KLK7抑制性肽的核酸分子、或编码KLK5/KLK14抑制性肽的核酸分子的合适例子可以包括含有在下面(a1)至(a4)、(b1)至(b4)、或(c1)至(c4)中的任一个中所述的核苷酸序列的那些(其在下文中将分别被称作“KLK5抑制性肽的核苷酸序列”、“KLK5/KLK7抑制性肽的核苷酸序列”或“KLK5/KLK14抑制性肽的核苷酸序列”)，由含有KLK5抑制性肽的核苷酸序列、KLK5/KLK7抑制性肽的核苷酸序列、或KLK5/KLK14抑制性肽的核苷酸序列的核苷酸序列组成的那些，或由KLK5抑制性肽的核苷酸序列、KLK5/KLK7抑制性肽的核苷酸序列或KLK5/KLK14抑制性肽的核苷酸序列组成的那些：

(a1)由特定核苷酸序列中的核苷酸1-189组成的核苷酸序列，所述特定核苷酸序列编码由在SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18和20 (图14、16、18、20、22、24、26和28)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸组成的氨基酸序列，或在SEQ ID NO: 5、7、9、11、13、15、17和19 (图13、15、17、19、21、23、25和27)中的任一个中描述的核苷酸序列；

(a2)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与在(a1)中描述的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(a3)一种核苷酸序列，其通过在(a1)中描述的核苷酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个核苷酸或核苷酸残基而形成并且编码在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；和

(a4)一种核苷酸序列，其与在(a1)中描述的核苷酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性并且编码在具有KLK5抑制活性的肽中所含的氨基酸序列：

(b1)一种核苷酸序列，其编码由在SEQ ID NO: 22、24、26和28 (图30、32、34和36)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸组成的氨基酸序列，或由在SEQ IDNO: 21、23、25和27 (图29、31、33和35)中的任一个中描述的核苷酸序列内的核苷酸1-189组成的核苷酸序列；

(b2)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与在(b1)中描述的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(b3)一种核苷酸序列，其通过在(b1)中描述的核苷酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个核苷酸或核苷酸残基而形成并且编码在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；和

(b4)一种核苷酸序列，其与在(b1)中描述的核苷酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性并且编码在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽中所含的氨基酸序列：

(c1)一种核苷酸序列，其编码由在SEQ ID NO: 30和32 (图38和40)中的任一个所示的氨基酸序列的位置1-63处的氨基酸组成的氨基酸序列，或由在SEQ ID NO: 29或31(图37或39)中描述的核苷酸序列的核苷酸1-189组成的核苷酸序列；

(c2)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与在(c1)中描述的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；

(c3)一种核苷酸序列，其通过在(c1)中描述的核苷酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个核苷酸或核苷酸残基而形成并且编码在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列；和

(c4)一种核苷酸序列，其与在(c1)中描述的核苷酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性并且编码在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽中所含的氨基酸序列。

SPINK2突变体肽优选地特异性地抑制其蛋白酶活性，所述SPINK2突变体肽由在上面(a1)至(a4)、(b1)至(b4)、或(c1)至(c4)中的任一个中描述的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成，或含有抑制KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的蛋白酶活性的氨基酸序列。

在SEQ ID NO: 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31 (图13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39)中的核苷酸190-195不是与编码野生型人SPINK2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1，图9：由63个氨基酸组成)中的那些对应的核苷酸，但是在本发明的一个方面为了表达本发明的肽而添加。

但是，编码KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的核酸分子不限于在(a1)至(a4)、(b1)至(b4)、或(c1)至(c4)中描述的那些，且含有特定核苷酸序列的核酸分子都被包括在编码KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的核酸分子的范围内，所述特定核苷酸序列编码在具有KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性的SPINK2突变体内所含的氨基酸序列，优选地具有在SEQ ID NO: 61(图69)中所示的氨基酸序列。

进一步，本发明也提供了含有编码在KLK5抑制性肽缀合物、KLK5/KLK7抑制性肽缀合物或KLK5/KLK14抑制性肽缀合物中所含的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(其在下文中将分别被称作“编码KLK5抑制性缀合物的核酸分子”、“编码KLK5/KLK7抑制性缀合物的核酸分子”或“编码KLK5/KLK14抑制性缀合物的核酸分子”)，插入了这样的基因的重组载体，引入了所述基因或所述载体的细胞(其在下文中将被称作“含有编码KLK5抑制性缀合物的核酸分子的细胞”、“含有编码KLK5/KLK7抑制性缀合物的核酸分子的细胞”或“含有编码KLK5/KLK14抑制性缀合物的核酸分子的细胞”)，和生产KLK5抑制性肽缀合物、KLK5/KLK7抑制性肽缀合物或KLK5/KLK14抑制性肽缀合物的细胞(其在下文中将分别被称作“生产KLK5抑制性缀合物的细胞”、“生产KLK5/KLK7抑制性缀合物的细胞”或“生产KLK5/KLK14抑制性缀合物的细胞”)。

本发明的编码KLK5抑制性缀合物的核酸分子、编码KLK5/KLK7抑制性缀合物的核酸分子、或编码KLK5/KLK14抑制性缀合物的核酸分子的合适例子可以各自包括含有在下面(a1)至(a4)、(b1)至(b4)、或(c1)至(c4)中的任一个中描述的核苷酸序列的那些(其在下文中将分别被称作“KLK5抑制性缀合物的核苷酸序列”、“KLK5/KLK7抑制性缀合物的核苷酸序列”或“KLK5/KLK14抑制性缀合物的核苷酸序列”)，由含有KLK5抑制性缀合物的核苷酸序列、KLK5/KLK7抑制性缀合物的核苷酸序列、或KLK5/KLK14抑制性缀合物的核苷酸序列的核苷酸序列组成的那些，或由KLK5抑制性缀合物的核苷酸序列、KLK5/KLK7抑制性缀合物的核苷酸序列、或KLK5/KLK14抑制性肽的核苷酸序列组成的那些：

(a1)编码在SEQ ID NO: 34、36、38、40、42、44、46、48和96 (图42、44、46、48、50、52、54、56和106)中的任一个中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或在SEQ ID NO: 33、35、37、39、41、43、45、47和95 (图41、43、45、47、49、51、53、55和105)中的任一个中描述的核苷酸序列；

(a2)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与在(a1)中描述的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列；

(a3)一种核苷酸序列，其通过在(a1)中描述的核苷酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个核苷酸或核苷酸残基而形成并且编码在具有KLK5抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列；和

(a4)一种核苷酸序列，其与在(a1)中描述的核苷酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性并且编码在具有KLK5抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列：

(b1)编码在SEQ ID NO: 50、52、54和56 (图58、60、62和64)中的任一个中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或在SEQ ID NO: 49、51、53和55 (图57、59、61和63)中的任一个中描述的核苷酸序列；

(b2)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与在(b1)中描述的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列；

(b3)一种核苷酸序列，其通过在(b1)中描述的核苷酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个核苷酸或核苷酸残基而形成并且编码在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列；和

(b4)一种核苷酸序列，其与在(b1)中描述的核苷酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性并且编码在具有KLK5/KLK7抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列：

(c1)编码在SEQ ID NO: 58和60 (图66和68)中的任一个中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或在SEQ ID NO: 57或59 (图65或67)中描述的核苷酸序列；

(c2)一种核苷酸序列，其在严谨条件下与在(c1)中描述的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交并且编码在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列；

(c3)一种核苷酸序列，其通过在(c1)中描述的核苷酸序列中置换、删除、添加和/或插入1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、1或2或1个核苷酸或核苷酸残基而形成并且编码在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列；和

(c4)一种核苷酸序列，其与在(c1)中描述的核苷酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更多同一性并且编码在具有KLK5/KLK14抑制活性的肽或缀合物中所含的氨基酸序列。

SPINK2突变体肽由在上面(a1)至(a4)、(b1)至(b4)、或(c1)至(c4)中的任一个中描述的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成，或含有抑制KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的蛋白酶活性的氨基酸序列，所述SPINK2突变体肽优选地特异性地抑制其蛋白酶活性。

但是，编码KLK5抑制性肽、KLK5/KLK7抑制性肽或KLK5/KLK14抑制性肽的核酸分子不限于在(a1)至(a4)、(b1)至(b4)、或(c1)至(c4)中描述的那些，且含有特定核苷酸序列的核酸分子都被包括在编码KLK5抑制性缀合物的核酸分子、编码KLK5/KLK7抑制性缀合物的核酸分子或编码KLK5/KLK14抑制性缀合物的核酸分子的范围内，所述特定核苷酸序列编码在缀合物中所含的氨基酸序列，所述缀合物含有在具有KLK5抑制活性、KLK5/KLK7抑制活性或KLK5/KLK14抑制活性的SPINK2突变体中所含的氨基酸序列，优选地具有编码在SEQ IDNO: 61(图69)中所示的氨基酸序列。

为了设计编码氨基酸序列的核苷酸序列，可以使用与各个氨基酸对应的一种或多种密码子。因此，编码肽的单个氨基酸序列的碱基序列可以具有多种变异。当选择这样的密码子时，可以适当地选择与用于表达的宿主细胞（在其中引入了含有核苷酸序列的多核苷酸或含有它们的载体）的密码子选择对应的密码子，或可以适当地调节多个密码子的使用的频率或比例。例如，在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，使用在大肠杆菌中常用的密码子可以设计核苷酸序列。

编码本发明的肽或其缀合物的核酸分子可以在功能上连接至一种或多种调节序列。“在功能上连接”是指使连接的核酸分子能够表达或使在分子中所含的核苷酸序列能够表达。这样的调节序列含有序列元件，包括关于转录调节和/或翻译调节的信息。调节序列随物种而变化，但是通常含有参与转录和翻译起始的启动子和5'非编码序列，诸如原核-35/-10框、Shine-Dalgarno序列、真核TATA框、CAAT序列和5' 加帽序列。这样的序列可以包括增强子元件和/或阻遏物元件、以及用于将天然的或成熟的肽递送至宿主细胞内或外的特定隔室的可翻译的信号序列、前导序列等。进一步，这样的调节序列可以包括3' 非编码序列，且所述序列可以包括参与转录终止、多腺苷酸化等的元件。但是，当与转录终止有关的序列在特定宿主细胞中不充分起作用时，所述序列可以用适合该细胞的序列置换。

启动子序列的例子可以包括tet启动子、lacUV5启动子和T7启动子（对于原核细胞）以及SV40启动子和CMV启动子（对于真核细胞）。

编码本发明的肽或其缀合物的核酸分子可以是分离的或被包含在载体或其它克隆媒介物(其将在下文中简称为“载体”诸如质粒、噬粒、噬菌体、杆状病毒和粘粒)或染色体中，但是对这样的形式没有限制。除了调节序列以外，所述载体可以含有适合要用于表达的宿主细胞的复制序列和控制序列，以及给予表型的选择标记，所述表型能够选择通过转化等在其中已经引入了核酸分子的细胞。

通过本领域技术人员已知的方法，诸如转化进能够表达肽、缀合物或核苷酸序列的宿主细胞中，可以引入编码本发明的肽或其缀合物的核酸分子、以及含有本发明的肽或其缀合物的核苷酸序列的载体。可以在适合表达肽或核苷酸序列的条件下培养在其中引入了核酸分子或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核的或真核的。原核细胞的例子可以包括大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），且真核细胞的例子可以包括酵母诸如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris），昆虫细胞诸如SF9和High5，和动物细胞诸如HeLa细胞、CHO细胞、COS细胞和NS0。使用真核细胞等作为宿主细胞，可以对表达的本发明的肽进行期望的翻译后修饰。翻译后修饰的例子可以包括官能团诸如糖链的添加，肽或蛋白的添加，氨基酸的化学性能的转变，等。进一步，可以将期望的修饰人工地应用于本发明的肽或其缀合物。这样的修饰的肽或缀合物也被包括在本发明的“肽”或“缀合物”的范围内。

本发明也提供了一种生产肽或缀合物的方法。所述方法包括培养含有编码KLK5抑制性肽(或KLK5抑制性缀合物)的核酸分子的细胞或生产KLK5抑制性肽(或KLK5抑制性缀合物)的细胞、含有编码KLK5/KLK7抑制性肽(或KLK5/KLK7抑制性缀合物)的核酸分子的细胞或生产KLK5/KLK7抑制性肽(或KLK5/KLK7抑制性缀合物)的细胞、或含有编码KLK5/KLK14抑制性肽(或KLK5/KLK14抑制性缀合物)的核酸分子的细胞或生产KLK5/KLK14抑制性肽(或KLK5/KLK14抑制性缀合物)的细胞的步骤1，和/或从在步骤1中得到的培养物收集SPINK2突变体的步骤2。本领域技术人员已知的操作诸如分级分离、色谱法和纯化可以应用于步骤2。例如，可以向其应用使用本发明的抗体或其结合片段的亲和色谱法纯化，其将在下面描述。

在本发明的某些方面，所述肽或在所述缀合物中包含的肽具有分子内二硫键。可能优选的是，使用信号序列等将具有分子内二硫键的肽递送至具有氧化性氧化还原环境的细胞区室。氧化性环境可以由革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌的周质、革兰氏阳性细菌的细胞外环境、真核细胞的内质网腔等提供，且可以在这样的环境下促进结构二硫键的形成。进一步，也可能在宿主细胞诸如大肠杆菌的细胞质中生产具有分子内二硫键的肽。在这样的情况下，所述肽可以以可溶的和折叠的状态直接获得，或可以以包涵体形式收集并然后在体外重构。进一步，也可能选择具有氧化性细胞内环境的宿主细胞以在其细胞质中生产具有分子内二硫键的肽。同时，当所述肽不具有分子内二硫键时，可以在具有还原性氧化还原环境的细胞优选地（诸如革兰氏阴性细菌的细胞质）中生产所述肽。

通过本领域技术人员已知的其它方法，诸如Merrifield等人的固相肽合成方法，和由使用叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等的有机合成化学肽合成方法所举例说明的化学合成，和体外翻译，可以生产本发明的肽或其缀合物(其中所含的肽部分)。

在某些方面，本发明提供了结合本发明的肽或在缀合物中所含的肽的抗体，及其结合片段。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，且单克隆抗体没有特别限制，只要它是免疫球蛋白或其衍生物。抗体的结合片段没有限制，只要它具有抗原结合活性，也就是说，对所述肽的结合活性。重链和轻链中的二者或一个或其片段，缺乏恒定区或Fc区的那些，以及与其它蛋白或标记物质的缀合物，也被包括在其中。这样的抗体及其结合片段可以通过本领域技术人员已知的方法制备，且可用于通过亲和色谱法纯化所述肽，在与含有所述肽的药物组合物或其应用有关的临床试验、诊断等中检测所述肽，免疫学测定等。本发明的抗体或其结合片段可以通过亲和色谱法纯化，其中使用所述抗体或所述片段所结合的本发明的肽。

5. 药物组合物

本发明也提供了含有本发明的肽或其缀合物的药物组合物。

含有本发明的肽或其缀合物的药物组合物可用于治疗和/或预防多种被KLK5诱导或加重的疾病(其在下文中将被称作“与KLK5有关的疾病”或“KLK5相关疾病”)，且在所述疾病中，通过抑制或遏制KLK5的表达或功能可能遏制这样的诱导或加重、恢复、维持或缓解症状、避免继发疾病等。与KLK5有关的疾病的例子可以包括内瑟顿综合征(Furio, L., 等人(2015) PLoS. Genet., 第11卷, 第e1005389页)、特应性皮炎(Fortugno, P., 等人(2012) Hum. Mol. Genet., 第21卷, 第4187-4200页)、红斑痤疮(Yamasaki, K., 等人(2007) Nat. Med., 第13卷, 第975-980页)、紫外线诱导的皮肤损伤(Nin, M., 等人(2009) J. Dermatol. Sci., 第54卷, 第17-24页)、银屑病(Komatsu, N., 等人(2007)Br. J. Dermatol., 第156卷, 第875-883页)、哮喘(Grunberg, M., 等人(2018) Eur. J.Immunol., 第48卷, 第1592-1594页)、脊髓损伤(Radulovic, M., 等人(2013) J.Neuropathol. Exp. Neurol., 第72卷, 第1072-1089页)、癌症(诸如子宫癌、膀胱泌尿道上皮癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈癌、黑素瘤、前列腺癌和神经胶质瘤)(Emami, N., 等人(2007) Mol. Oncol., 第1卷, 第269-287页)和巴雷特食管(GeneExpression Omnibus, 基于登录号GSE13083)，但是对这些例子没有限制。

KLK5被认为是内瑟顿综合征-样皮肤症状的发展中的主要因素。KLK5是一种自体活化的蛋白酶，并且也参与KLK7和KLK14的活化。同时，在内瑟顿综合征患者的角质层和内瑟顿综合征模型小鼠中，观察到高蛋白酶活性如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，并且提出除了KLK5以外，位于下游的激肽释放酶家族诸如KLK7和KLK14与角质层中的蛋白酶活性有关。预见到，可能存在这样的情况：其中通过除了KLK5以外还抑制KLK7或KLK14可以更强烈地遏制内瑟顿综合征-样皮肤症状。与内瑟顿综合征有关的SPINK5中的突变的70个或更多个例子列出在人基因突变数据库(Human Gene Mutation Database，HGMD)中且据报道与内瑟顿综合征的严重程度有关。在SPINK5的外显子1-9中的突变与内瑟顿综合征的更严重病理学有关。通过研究SPINK5中的突变，可以确定含有本发明的肽或其缀合物的药物组合物是否用于治疗或预防内瑟顿综合征。

本发明的药物组合物可以含有治疗或预防有效量的肽或缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或助剂。

术语“治疗或预防有效量”是指对特定疾病、施用形式或施用途径发挥治疗或预防作用的量，且具有与“药理学上有效的量”相同的含义。

本发明的药物组合物可以含有这样的物质：其用于改变、维持或保持所述组合物或所述组合物内所含的肽、缀合物等的pH、渗透压、粘度、透明性、颜色、等渗性、无菌性或稳定性、溶解度、持续释放、吸收性、渗透性、剂型、强度、性能、形状等(其在下文中将被称作“药用物质”)。药用物质没有特别限制，只要它们是药理学上可接受的物质。例如，没有毒性或低毒性是药用物质优选地具有的性质。

药用物质的例子可以包括、但不限于以下：氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸，抗细菌剂，抗氧化剂诸如抗坏血酸、硫酸钠或亚硫酸氢钠，缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐或硼酸盐缓冲液，碳酸氢钠，或tris-盐酸(Tris-HCl)溶液，填充剂诸如甘露醇和甘氨酸，螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)，络合剂诸如咖啡因、聚乙烯基吡咯烷、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精，填充剂诸如葡萄糖、甘露糖或糊精，单糖类，二糖类，其它碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖或糊精，着色剂，矫味剂，稀释剂，乳化剂，亲水聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷，防腐剂诸如低分子量多肽、形成盐的抗衡离子、苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢，溶剂诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇(PEG)，糖醇诸如甘露醇或山梨醇，助悬剂，聚山梨酯诸如脱水山梨糖醇酯、聚山梨酯20或聚山梨酯80，表面活性剂诸如triton、氨丁三醇、卵磷脂或胆固醇，稳定性增强剂诸如蔗糖或山梨醇，弹性增强剂诸如氯化钠、氯化钾、甘露醇或山梨醇，运输剂，稀释剂，赋形剂，和/或药用助剂。

要添加的这些药用物质的量是本发明的肽或在缀合物中所含的肽的重量的0.001-1000倍，优选地0.01-100倍，更优选地0.1-10倍。

含有本发明的肽或缀合物的脂质体以及含有通过所述肽与脂质体的结合而形成的改进形式的药物组合物也被包括在本发明的药物组合物中。

赋形剂或载体没有特别限制，只要它们是通常用于经口或肠胃外施用，诸如在可注射水、盐水、人工脑脊液和其它制品中的液体或固体材料即可。盐水的例子可以包括中性盐水和含有血清白蛋白的盐水。

缓冲液的例子可以包括Tris缓冲液，其被调节成使所述药物组合物的最终pH达到7.0-8.5；乙酸盐缓冲液，其被调节成使所述药物组合物的最终pH达到4.0-5.5；柠檬酸盐缓冲液，其被调节成使所述药物组合物的最终pH达到5.0-8.0；和组氨酸缓冲液，其被调节成使所述药物组合物的最终pH达到5.0-8.0。

本发明的药物组合物是固体、液体、混悬液等。本发明的药物组合物的另一个例子可以包括冷冻干燥的制品。可以使用赋形剂诸如蔗糖形成冷冻干燥的制品。

本发明的药物组合物的施用途径可以是滴眼剂、肠内施用、局部施用和胃肠外施用中的任一种。其例子可以包括在结膜上的滴眼剂、玻璃体内施用、静脉内施用、动脉内施用、肌肉内施用、真皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、透皮施用、骨内施用和关节内施用。

根据施用方法、本发明的肽或在缀合物中所含的肽对KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的抑制活性、结合亲和力等，可以确定药物组合物的组成。对本发明的抑制性肽的靶标的抑制活性越强(IC

本发明的肽或其缀合物的剂量没有限制，只要它是药理学上有效的量，并且可以适当地确定，取决于个体的物种、疾病的类型、症状、性别、年龄、慢性疾病、对肽的靶标的抑制活性、结合亲和力和其它因素，但是本发明的肽或其缀合物通常以0.01-1000 mg/kg，优选地0.1-100 mg/kg，每天1次、2次或更多次，持续1-180天施用。

所述药物组合物的形式的例子可以包括注射剂(包括冷冻干燥的制品和滴剂)、栓剂、经鼻吸收制品、透皮吸收制品、舌下制剂、胶囊剂、片剂、软膏剂、颗粒、气雾剂、丸剂、粉剂、混悬液、乳剂、滴眼剂和生物植入物制剂。

含有本发明的肽或其缀合物作为活性成分的药物组合物可以与其它药物同时地或分开地施用。例如，可以在施用其它药物后施用含有本发明的肽或其缀合物作为活性成分的药物组合物，可以在施用药物组合物后施用其它药物，或可以与其它药物同时施用药物组合物。在同时施用的情况下，本发明的肽或其缀合物和其它药物可以被包含在单一制品或分开的制品(多个制品)中。

可以施用或接受1、2、3种或更多种这样的其它药物。这些被统称为本发明的药物组合物与“其它药物的联合使用”或“与其它药物的组合”。除了本发明的肽或其缀合物以外还含有其它药物或者与其它疗法联合使用的本发明的药物组合物也被包括在本发明中作为“其它药物的联合使用”或“与其它药物的组合”的一个方面。

针对内瑟顿综合征的其例子可以包括保湿剂、类固醇药物和抗细菌剂。针对特应性皮炎的其例子可以包括类固醇药物、神经钙蛋白抑制剂、PDE4抑制剂、免疫抑制性药物、IL-4/IL-13抑制剂和光疗。针对红斑痤疮的其例子可以包括多西环素、米诺环素、壬二酸和溴莫尼定。针对银屑病的其例子可以包括TNFα抑制剂、IL-12/23抑制剂、IL-17抑制剂、PDE4、抗代谢药、神经钙蛋白抑制剂、富马酸酯、类视色素制品、类固醇药物、维生素D3类似物和光疗。针对哮喘的其例子可以包括类固醇药物和β2激动剂。针对癌症诸如子宫癌、膀胱泌尿道上皮癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈癌、黑素瘤、前列腺癌和神经胶质瘤的其例子可以包括各种抗癌剂。

本发明也提供了一种用于治疗或预防与KLK5有关的疾病的方法，所述方法包括施用本发明的肽或其缀合物的步骤，本发明的肽或其缀合物用于制备治疗或预防疾病的药物组合物的用途，以及所述肽或所述缀合物用于治疗和预防疾病的用途。含有所述肽或所述缀合物的治疗或预防试剂盒也被包括在本发明中。

进一步，还提供了含有多核苷酸（其含有编码本发明的肽或其缀合物的氨基酸序列的核苷酸序列）的药物组合物，含有所述多核苷酸的载体，含有所述多核苷酸或所述载体的细胞，或表达本发明的肽或其缀合物的细胞。例如，分别使用已知方法，所述多核苷酸和所述载体可以应用于与KLK5有关的疾病的基因治疗，且所述细胞可以应用于与KLK5有关的疾病的细胞疗法。进一步，可以制备用于细胞疗法的细胞，例如，通过将所述多核苷酸或所述载体引入自体细胞或同种异体细胞(相同种类的细胞)中。所述多核苷酸和所述载体也被包括在本发明中作为用于制备细胞治疗剂的组合物。但是，含有本发明的多核苷酸、载体、细胞等的药物组合物的方面不限于以上。

动物模型可以用作用于评价作为活性成分被包含在本发明的药物组合物中的所述肽或其缀合物对与KLK5有关的疾病的治疗效果的工具。具有SPINK5基因（其为内瑟顿综合征的原因基因）中的突变的内瑟顿综合征模型的例子可以包括SPINK5基因-缺陷型小鼠(Descargues, P., 等人(2004) Nat. Genet., 第37卷, 第56-65页)、SPINK5基因条件性敲除小鼠(Petrova, E., 等人(2019) oral presentation in the 8th InternationalSymposium on Kallikreins and Kallikrein-Related Peptidases: Abstract Book, 第28页)和Crusty2小鼠(Mutagenetix数据库)，但是对这些例子没有限制。

6. 诊断组合物

提供了含有本发明的肽或其缀合物的用于试验或诊断的组合物(其在下文中将共同地称作“诊断组合物”)。

本发明的诊断组合物可用于试验或诊断与KLK5、KLK5表达、KLK7表达、KLK14表达等有关的疾病。在本发明中，试验或诊断的例子包括发病风险的确定或测量，发病率的确定，进展或加重的程度的测量，用含有本发明的肽或其缀合物的药物组合物的药物治疗的效果的测量或确定，除了药物治疗以外的治疗的效果的测量或确定，复发风险的测量，和复发的确定。但是，对这些例子没有限制，只要它们是试验或诊断。

本发明的诊断组合物可用于鉴定向其施用了本发明的肽或其缀合物、含有它们的组合物或含有它们的药物组合物的个体。

这样的诊断组合物可以含有pH缓冲剂、渗透压调节剂（osmoregulators）、盐、稳定剂、防腐剂、显影剂（developers）、敏化剂、聚集抑制剂等。

本发明也提供了用于试验或诊断与KLK5有关的疾病的方法，本发明的肽用于制备疾病的诊断组合物的用途，和本发明的肽用于试验或诊断疾病的用途。含有本发明的肽的用于试验或诊断的试剂盒也被包括在本发明中。

关于使用本发明的肽的用于试验或诊断的方法，夹心ELISA是合乎需要的，但是可以使用检测方法诸如常规ELISA或RIA、ELISPOT (酶联免疫斑点)、斑点印迹法、Ouchterlony方法、CIE (对流免疫电泳)、CLIA (化学发光免疫测定)和FCM (流式细胞计量术)。关于检测，使用抗体或其结合片段，或用本发明的肽或其缀合物标记的那些。关于标记，可以使用可用于生化分析的标记方法，诸如除了生物素以外用荧光团诸如HRP、碱性磷酸酶和FITC、放射性同位素等标记。关于使用酶标记的检测，可以使用化学发光底物以及生色底物诸如TMB (3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺)、BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)、p-NPP (对硝基苯基磷酸酯)、OPD (邻苯二胺)、ABTS (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和SuperSignal ELISA Pico化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)和荧光底物诸如QuantaBlu (R)发荧光的过氧化物酶底物(Thermo Fisher Scientific)。可以对从人类或非人动物衍生出的样品以及人工处理过的样品（诸如重组蛋白）进行该测定。从个别生物体衍生出的试验样品的例子可以包括、但不限于：血液、滑液、腹水、淋巴液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、唾液、痰、组织匀浆物上清液和组织切片。

含有本发明的肽的用于试验或诊断的夹心ELISA试剂盒可以含有着色剂、用于稀释的缓冲液、用于固相的蛋白、用于检测的蛋白、洗涤溶液等以及包含本发明的肽或其缀合物的蛋白标准溶液。作为用于测量与抗原结合的蛋白的量的方法，适当地应用吸收方法、荧光方法、发光方法、RI (放射性同位素)方法等，且为了测量，优选地使用吸收平板读数器、荧光平板读数器、发光平板读数器、RI液体闪烁计数器等。

进一步，通过使用免疫沉淀的方法可以执行试验或诊断。

进一步，本发明也提供了用于检测或测量试验样品中的KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的方法。本发明的诊断组合物可以用于这样的检测或测量方法。可以如下检测试验样品中的KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14：使本发明的肽或其缀合物与试验样品接触(步骤1)，并然后测量与所述肽或所述缀合物结合的KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的量(步骤2)。步骤1的例子可以包括：经由蛋白G将与本发明的肽缀合的免疫球蛋白的Fc区固定化到磁珠上，和向其添加试验样品，且步骤2的例子可以包括：分离磁珠和通过SDS-PAGE或蛋白质印迹法分析与珠子一起沉淀的可溶性蛋白以检测KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14。除了人-或非人动物-衍生的样品以外，可以对人工处理过的样品诸如重组蛋白进行该测量。从个别生物体衍生出的试验样品的例子可以包括、但不限于：血液、滑液、腹水、淋巴液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、唾液、痰、组织匀浆物上清液和组织切片。

KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的检测不仅可以在体外进行，而且可以在体内进行。在诊断成像的情况下，可以使用用药学上可接受的放射性核素或发光材料标记的本发明的肽或其缀合物。步骤1的例子可以包括将标记的肽或其缀合物施用给试验受试者，且步骤2的例子可以包括使用诊断成像技术诸如PET/CT捕获图像并确定或试验KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14的存在。

在本发明的诊断组合物中所含的肽或其缀合物结合KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14，且优选地具有KLK5-、KLK5和KLK7-、或KLK5和KLK14-特异性的结合活性。

在本发明中还包括用于鉴定向其施用了本发明的药物组合物的个体的方法。在这样的鉴定方法中，测量从所述个体衍生出的样品中的KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14，并且当在样品中检测到KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14时，或检测到的KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14的量大于在从健康个体衍生出的另一个样品中检测到的KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14的量时，可以确定个体是阳性的。关于该方法，可以使用本发明的诊断组合物。

进一步，在鉴定方法的合适方面，所述个体具有KLK5相关疾病或处于KLK5相关疾病的风险中。

进一步，在一个方面，可以将本发明的药物组合物施用给在鉴定方法中确定为阳性的个体。

7. 用于分离KLK5、KLK5和KLK7、或KLK5和KLK14的方法

本发明的肽或其缀合物优选地具有对KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14特异性的结合活性。因此，使用本发明的肽或其缀合物，可以将KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14从样品中特异性地分离，在所述样品中，KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14与其它KLK混合。KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14从所述肽或所述缀合物的释放可以非选择性地执行，例如，在相对高的离子强度、低pH、中等变性条件下，在有离液盐等存在下，但是优选地在其中没有减弱KLK5、KLK5和/或KLK7、或KLK5和/或KLK14的蛋白酶活性的范围内执行。

实施例

在下述实施例中，将更具体地描述本发明的一些方面。但是，本发明不限于它们。

在下述实施例中，除非另外指出，否则根据在“Molecular Cloning”(Sambrook,J., Fritsch, E. F., 和Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press，出版于1982年或出版于1989年)中描述的方法和在本领域技术人员使用的实验书籍中描述的其它方法，或在使用商购可得的试剂或试剂盒的情况下根据商购可得的产品的说明书，执行与基因工程有关的操作。

实施例1. KLK5抑制性肽的制备

(1-1) KLK5抑制性肽表达载体的构建

使用每种抑制性肽的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31)和SPINK2的核苷酸序列作为模板，使用下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)通过PCR ((在94℃保持15秒，在60℃保持30秒，且在68℃保持20秒)×30个循环)扩增抑制性肽片段。

引物1: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3' (SEQ IDNO: 62, 图70)

引物2: 5'-AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAA-3' (SEQ ID NO: 63,图71)

对扩增的片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后将期望的DNA片段切出，以使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)制备DNA。将制备的DNA片段和pET 32a (Novagen)使用限制性酶BamHI (NEB)和XhoI (NEB)在37℃处理1小时或更久，并在琼脂糖凝胶电泳以后，将期望的DNA片段切出，随后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化。使用LigaFast快速DNA连接系统(Promega)，使每个纯化的片段在室温反应10分钟以进行连接反应。将连接溶液加给大肠杆菌JM109 (TOYOBO)，在冰上静置30分钟，然后在42℃热处理45秒，进一步在冰上静置5分钟，接种在含有0.1 mg/mL氨苄西林的2YT平板上，并在此后在37℃静置培养过夜以转化大肠杆菌。次日，将转化的大肠杆菌接种在含有0.1 mg/mL氨苄西林的Terrific Broth培养基(Invitrogen)上并在37℃培养过夜。此后，使用QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(Qiagen)收集质粒DNA (其在下文中将被称作“微制备处理”)，并进行序列分析，以构建pET32a_Kex2_KLK5抑制性肽载体。

(1-2) KLK5抑制性肽的制备

将大肠杆菌Origami B (DE3) (Novagen)用在(1-1)中构建的载体转化，并使用含有0.1 mg/mL氨苄西林的2YT培养基在37℃培养。此后，向其中加入IPTG (具有1 mM的终浓度)，随后在16℃培养过夜。次日，通过离心(3,000 g、20分钟和4℃)收集细胞以后，使用BugBuster Master Mix (Novagen)制备裂解物，并使用TALON金属亲和树脂(Clontech)纯化His标签融合靶蛋白。此后，使用Kex2 (酿酒酵母: Accession CAA96143)将硫氧还蛋白标签从期望的蛋白切割并使用TALON纯化。进一步，应用凝胶过滤色谱法(Superdex75 10/300 GL)或反相色谱法(YMC-Pack ODS-AM)，以制备14种KLK5抑制性肽。衍生物的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32和34 (图14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)中。

实施例2. KLK5、KLK7和KLK14的制备

(2-1)人KLK5、人KLK7和人KLK14表达载体的构建

用于克隆人前-KLK5、人前-KLK7和人前-KLK14的引物和PCR条件如下。

使用下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)通过通过PCR ((在94℃保持15秒，在60℃保持30秒，且在68℃保持10秒)×30个循环)扩增片段A。

引物3: 5'-GGCGATTATAAAGATGACGATGATAAACACCATCACCACCATC-3' (SEQ ID NO:64, 图72)

引物4: 5'-GTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGTTTATCATCGTCAT-3' (SEQ ID NO:65, 图73)

接着，使用分别编码人前-KLK5 (Uniprot: Q9Y337)、人前-KLK7 (Uniprot:P49862)和人前-KLK14 (Uniprot: Q9P0G3)的核苷酸序列作为模板，使用下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)通过PCR ((在94℃保持15秒，在60℃保持30秒，且在68℃保持60秒)×30个循环)扩增片段。

人前-KLK5扩增引物

引物5: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGCCACAGCTAGACCCCCT-3' (SEQ ID NO: 66,图74)

引物6: 5'-CGTCATCTTTATAATCGCCGCTGTTGGCCTGGATGGTTTCCTG-3' (SEQ ID NO:67, 图75)

人前-KLK7扩增引物

引物7: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGCCAGATCTCTGCTGCTGCCC-3' (SEQ ID NO:68, 图76)

引物8: 5'-CGTCATCTTTATAATCGCCCCGGTGTTTCTTCATGGTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:69, 图77)

人前-KLK14扩增引物

引物9: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGTTCCTCCTCCTCACCGCCCTC-3' (SEQ ID NO:70, 图78)

引物10: 5'-CGTCATCTTTATAATCGCCCTTGTCGCGCATGGTCTCCTCGAT-3' (SEQ ID NO:71, 图79)

使用上面扩增的片段和片段A、下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)，通过重叠PCR扩增期望的DNA片段。

引物5 (SEQ ID NO: 66, 图74)或引物7 (SEQ ID NO: 68, 图76)或引物9 (SEQID NO: 70, 图78)

引物11: 5'-AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGT-3' (SEQ ID NO: 72, 图80)

接着，使用分别编码小鼠前-KLK7 (Uniprot: Q91VE3)、小鼠前-KLK14 (Uniprot:Q8CGR5)的核苷酸序列作为模板，使用下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)通过PCR ((在94℃保持15秒，在60℃保持30秒，且在68℃保持60秒)×30个循环)扩增片段。

小鼠前-KLK7扩增引物

引物12: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGGAGTGTGGCTGCTGAGCCTG-3' (SEQ ID NO:73, 图81)

引物13: 5'-AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGCCGGTGGGTCTTCATGGTTTCCATG-3' (SEQ ID NO: 74, 图82)

小鼠前-KLK14扩增引物

引物14: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGTTTCTGCTGCTGATCATCCTG-3' (SEQ ID NO:75, 图83)

引物15: 5'-AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGGTTGCTCTGCATGGTCCGCTGAA-3' (SEQ ID NO: 76, 图84)

使用扩增的期望的DNA片段和限制性酶XbaI (NEB)和PmeI (NEB)，克隆构建哺乳动物细胞表达载体pCMA_pro-hKLK5、pCMA_pro-hKLK7、pCMA_pro-hKLK14、pCMA_pro-mKLK7和pCMA_pro-mKLK14，在每个基因编码的C-端处添加了His标签。根据在(1-1)中描述的方法进行操作。

(2-2)人KLK5、人前-KLK7、人前-KLK14、小鼠前-KLK7和小鼠前-KLK14的表达和纯化

使用PEI MAX 40000 (Polysciences)将在(2-1)中构建的表达载体转染进Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific)中，并在培养细胞后3天收集培养物上清液。使用HisTrap excel (GE healthcare)从培养物上清液收集期望的His标签融合蛋白，并使用Amicon Ultra NMWL 10,000 (Merck KGaA Millipore)用PBS替换缓冲液，以分别纯化KLK5、人前-KLK7、人前-KLK14、小鼠前-KLK7和小鼠前-KLK14。

(2-3)人KLK5、人KLK7、人KLK14、小鼠KLK5、小鼠KLK7和小鼠KLK14的制备

向使用KLK活化缓冲液(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl

进一步，将使用活化缓冲液(50 mM Tris-HCl, 0.005%(w/w) Brij-35, pH 8.0)制备的200 μg/mL小鼠KLK5 (R&D Systems, Inc., 7236-SE)和2 μg/mL人KLK5等量混合，随后在37℃反应24小时，以制备活化的小鼠KLK5。

实施例3. KLK5抑制性肽的评价

(3-1) KLK5抑制性肽的人/小鼠KLK5、人/小鼠KLK7和人/小鼠KLK14抑制活性的评价

将底物肽溶解在DMSO中至10 mM并用测定缓冲液(50 mM Tris-HCl, 150 mMNaCl, pH 8.0)稀释备用。将25 μL的每种人/小鼠KLK5、人/小鼠KLK7或人/小鼠KLK14和用测定缓冲液稀释的抑制性肽混合，随后在37℃反应20分钟。此后，向其中加入50 μL用测定缓冲液稀释的底物，并使用Enspire (PerkinElmer)测量荧光信号。使用的酶和底物的组合如下。每种抑制性肽具有0.098-1,000 nM的终浓度，且将PROTEOSAVE (R) SS96F黑色平板(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)用于反应和测量。

人KLK5抑制活性的评价：具有10 nM的终浓度的hKLK5 ,具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc.)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人KLK7抑制活性的评价：具有1 μg/mL的终浓度的hKLK7，具有20 μM的终浓度的底物肽Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH

人KLK14抑制活性的评价：具有0.2 μg/mL的终浓度的hKLK14，具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc.)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

小鼠KLK5抑制活性的评价：具有0.25 μg/mL的终浓度的小鼠KLK5，具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc.),和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

小鼠KLK7抑制活性的评价：具有0.5 μg/mL的终浓度的小鼠KLK7，具有7 μM的终浓度的底物肽Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH

小鼠KLK14抑制活性的评价：具有0.1 μg/mL的终浓度的小鼠KLK14，具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc.)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

作为通过每种浓度的每种抑制性肽计算底物肽的降解速率和使用GraphPadPrism (5.0版; GraphPad Software Inc.)计算50%抑制浓度(IC

(3-2) KLK5抑制性肽的交叉反应性的评价

使用底物肽的降解作为指标，评价了对其它蛋白酶的特异性。如在(3-1)所描述的方法中，将25 μL的每种蛋白酶和用测定缓冲液稀释的样品混合(至1 μM的样品的终浓度)，随后在37℃反应20分钟。此后，向其中加入50 μL的用测定缓冲液稀释的底物，并使用Enspire (PerkinElmer)测量荧光信号。将测定缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH8.0)用于评价蛋白酶活性，并将PROTEOSAVE (R) SS96F黑色平板(Sumitomo BakeliteCo., Ltd.)用于反应和测量。用于评价特异性的蛋白酶和底物的组合如下。

牛胰蛋白酶抑制活性的评价：具有5 nM的终浓度的胰蛋白酶(Pierce; 20233)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人胰蛋白酶抑制活性的评价：具有1 nM的终浓度的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Co.LLC, T6424)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems,Inc., ES011)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

牛α-胰凝乳蛋白酶抑制活性的评价：具有10 nM的终浓度的胰凝乳蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation; LS001434)和具有100 μM的终浓度的底物肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v, 图86，和在SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人胰凝乳蛋白酶抑制活性的评价：具有10 nM的终浓度的胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich Co. LLC, C8946),具有10 μM的终浓度的底物肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v, 图87，和在SEQ ID NO: 79中所示的氨基酸序列)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人类胰蛋白酶抑制活性的评价：具有1 nM的终浓度的类胰蛋白酶(Sigma-AldrichCo. LLC, T7063)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (PEPTIDEINSTITUTE, INC., 3107-v)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人类胰凝乳蛋白酶抑制活性的评价：具有100 nM的终浓度的类胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich Co. LLC, C8118)和具有100 μM的终浓度的底物肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v, 图87，和在SEQ ID NO: 79中所示的氨基酸序列)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人纤溶酶抑制活性的评价：具有50 nM的终浓度的纤溶酶(Sigma-Aldrich Co.LLC, P1867)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Leu-Lys-MCA (PEPTIDEINSTITUTE, INC., 3104-v)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人凝血酶抑制活性的评价：具有1 nM的终浓度的凝血酶(Sigma-Aldrich Co.LLC, T6884)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems,Inc., ES011)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制活性：具有0.00001 U/ μL的终浓度的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(Enzo Life Sciences)和具有100 μM的终浓度的底物肽Suc (OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3153-v, 图88，和在SEQ ID NO: 80中所示的氨基酸序列)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人蛋白裂解酶（matriptase）抑制活性的评价：具有1 nM的终浓度的蛋白裂解酶（matriptase）(R&D Systems, Inc., 3946-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES014)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人蛋白C抑制活性的评价：具有100 nM的终浓度的蛋白C (Sigma-Aldrich Co.LLC, P2200)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (PEPTIDEINSTITUTE, INC., 3112-v, 图89，和在SEQ ID NO: 81中所示的氨基酸序列)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人tPA抑制活性的评价：具有10 nM的终浓度的tPA (Sigma-Aldrich Co. LLC,T0831)和具有100 μM的终浓度的底物肽Pyr-Gly-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC.,3145-v)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人uPA抑制活性的评价：具有2 nM的终浓度的uPA (Sigma-Aldrich Co. LLC,U0633)和具有100 μM的终浓度的底物肽Pyr-Gly-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC.,3145-v)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人血浆激肽释放酶抑制活性的评价：具有0.125 μg/mL的终浓度的血浆激肽释放酶(R&D Systems, Inc., 2497-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Z-Phe-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3095-v)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人KLK1抑制活性的评价：具有0.1 μg/mL的终浓度的KLK1 (R&D Systems, Inc.,2337-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Pro-Phe-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC.,3096-v)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人KLK2抑制活性的评价：具有2 μg/mL的终浓度的KLK2 (R&D Systems, Inc.,2337-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Pro-Phe-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC.,3096-v)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人KLK4抑制活性的评价：具有1 μg/mL的终浓度的KLK4 (R&D Systems, Inc.,1719-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc.,ES011)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人KLK7抑制活性的评价：具有1 μg/mL的终浓度的KLK7, 具有20 μM的终浓度的底物肽Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH2 (R&D Systems,Inc., 图85，和在SEQ ID NO: 77中所示的氨基酸序列)，和具有在320 nm激发/在405 nm发射的荧光信号

人KLK8抑制活性的评价：具有5 nM的终浓度的KLK8 (UniProt: O60259，由发明人制备)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc.,ES011)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人KLK12抑制活性的评价：具有0.1 μg/mL的终浓度的KLK12 (R&D Systems,Inc., 3095-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems,Inc., ES011)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人KLK13抑制活性的评价：具有0.5 μg/mL的终浓度的KLK13 (R&D Systems,Inc., 2625-SE)和具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems,Inc., ES011)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

人KLK14抑制活性的评价：具有0.2 μg/mL的终浓度的hKLK14,具有100 μM的终浓度的底物肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc.)，和具有在380 nm激发/在460 nm发射的荧光信号

以与在(3-1)中相同的方式，使用肽底物的降解作为指标评价了每种KLK5抑制性肽与除了KLK5以外的蛋白酶的交叉反应性。对于1 μM的抑制性肽的终浓度，一些抑制性肽表现出与胰凝乳蛋白酶的弱交叉反应性(其中IC

(3-3) KLK5抑制性肽的KLK5结合活性的评价

为了测量KLK5抑制性肽的结合亲和力，使用BIAcore T 200 (GE healthcare)进行了表面等离子体共振分析。将抗生蛋白链菌素缀合物的互补链DNA通过杂交捕获在固定化了单链DNA的Sensor Chip CAP (GE healthcare)上。接着，将使用EZ-Link NHS-PEG4-生物素(Thermo Fisher Scientific)生物素化的KLK5以10 μL/min的流速捕获以固定化约10RU。此后，以30 μL/min的流速向其中加入用HBS-EP (0.625-10 nM)连续2倍稀释的KLK5抑制性肽作为分析物。在BIAcore T 200 Evaluation软件(2.0版)中，通过以简单的一对一Langmuir结合模型使用单周期动力学进行分析来计算kon和koff。将解离常数K

测量的所有14种KLK5抑制性肽表现出低于1 nM的K

(3-4) KLK5抑制性肽Fc融合体的KLK5结合活性的评价

为了测量在(5-2)中制备的KLK5抑制性肽Fc融合体（其将在下面描述）的结合亲和力，使用BIAcore T 200 (GE healthcare)进行了表面等离子体共振分析。

将KLK5抑制性肽Fc融合体以20 μL/min的流速用Sensor Chip CM5 (GEhealthcare)捕获，在后者上固定化了抗-人IgG (Fc)抗体以固定化约30-50 RU。此后，以30μL/min的流速向其中加入用HBS-EP (0.625-10 nM)连续2倍稀释的KLK5作为分析物。在BIAcore T 200 Evaluation软件(2.0版)中，通过以简单的一对一Langmuir结合模型使用单周期动力学进行分析来计算kon和koff。将解离常数K

测量的所有14种KLK5抑制性肽Fc融合体表现出低于1 nM的K

实施例4. 使用X-射线晶体结构分析KLK5抑制性肽

(4-1) KLK5/KLK5抑制性肽复合物的制备

根据在(1-2)和(2-2)中描述的方法，制备了具有由SEQ ID编号所示的氨基酸序列的KLK5抑制性肽K51034和KLK5。在50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和pH 8.0的条件下混合二者以后，通过凝胶过滤色谱法(Superdex 200 10/300 GL)分离和纯化复合物。

(4-2) X-射线晶体结构的分析

将在(4-1)中制备的复合物溶液浓缩至12 mg/mL，此后以1:1的比例与蓄池溶液(0.2 M氯化镁六水合物, 20%PEG3350)混合，并通过蒸汽扩散方法结晶。将得到的立方体单晶浸在含有20%甘油的蓄池溶液中并此后在液氮中冷冻。将冷冻的晶体在冷冻流中用X-射线照射以得到衍射图像(Hypixel 6000HE/MicroMax007)。通过使用CrysAlisPro分析，得到具有1.7Å的最大分辨率的放大数据。使用单独的KLK5 (PDB ID: 2PSX)和单独的SPINK2(PDB ID: 2JXD)作为模板，通过分子替换方法确定相。在结构细化以后，以1.8Å的分辨率确定KLK5/肽K51034的复合物晶体。在晶胞中含有KLK5和SPINK2各自的一个分子。关于SPINK2分子，基于序列信息和观察到的电子密度构建含有与KLK5的相互作用位点的部分分子模型。证实了KLK5抑制性肽K51034结合至含有KLK5酶活性位点的区域(图4)。

实施例5. KLK5抑制性肽Fc融合体的制备

(5-1) KLK5抑制性肽Fc融合体表达载体的构建

使用每种抑制性肽的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31)作为模板，使用下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)通过PCR ((在94℃保持15秒，在60℃保持30秒，且在68℃保持20秒)×30个循环)扩增了抑制性肽片段。

引物16: 5'-AGATGGGTGTTGTCTGATGACGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3' (SEQ IDNO: 81, 图89)

引物17: 5'-GCAGGGGCCATTCCGGAT-3' (SEQ ID NO: 82, 图90)

使用下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)通过PCR ((在94℃保持15秒，在60℃保持30秒，且在68℃保持10秒)×30个循环)扩增了片段B。

引物18: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCT-3' (SEQID NO: 83, 图91)

引物19: 5'-AGACAACACCCATCTAGGAGCGGCCACCAGCAGCAGAAAGAACC-3' (SEQ IDNO: 84, 图92)

使用人IgG1的Fc区(SEQ ID NO: 87)作为模板，使用下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)通过PCR ((在94℃保持15秒，在60℃保持30秒，在68℃保持30秒)×30个循环)扩增了含有人IgG1的Fc区的片段C。

引物20: 5'-ATCCGGAATGGCCCCTGCGAACCCAAGAGCTGCGAC-3' (SEQ ID NO: 85, 图93)

引物21: 5'-AAAAGTTTAAACTCATTTGCCGGGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 86, 图94)

使用上面扩增的抑制性肽片段、片段B、片段C、引物18、引物21和KOD-plus-(TOYOBO)，通过重叠PCR扩增了期望的DNA片段。

进一步，通过使用限制性酶XbaI (NEB)和PmeI (NEB)克隆，构建了哺乳动物细胞表达载体pCMA_KLK5抑制性肽Fc融合体。根据在(1-1)中描述的方法进行操作。

(5-2) KLK5抑制性肽Fc融合体的制备

使用PEI MAX 40000 (Polysciences)将在(5-1)中构建的表达载体转染进Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific)中，并在培养6天细胞后收集培养物上清液。使用MabSelect SuRe (GE healthcare)从培养物上清液收集期望的Fc融合体，并使用AmiconUltra NMWL 10,000 (Merck KGaA Millipore)用PBS替换缓冲液，以制备KLK5抑制性肽Fc融合体。从具有在KLK5抑制性肽中的糖基化序列的每个克隆，通过一个残基的置换除去糖基化序列，并向其添加“dN”作为显示去糖基化形式的ID。糖基化序列的修饰根本不会影响活性诸如KLK5抑制活性或交叉反应性。

(5-3) KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc表达载体的构建

使用KLK5抑制性肽K50055的核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)作为模板，使用下述引物和KOD-plus-(TOYOBO)通过PCR ((在94℃保持15秒，在60℃保持30秒，且在68℃保持20秒)×30个循环)扩增了抑制性肽片段。

引物22: 5'-AGATGGGTGTTGTCTGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3' (SEQ ID NO: 94,图104)

引物17: 5'-GCAGGGGCCATTCCGGAT-3' (SEQ ID NO: 82, 图90)

使用上面扩增的抑制性肽片段和片段B、片段C、引物18和引物21（它们在(5-1)中扩增）和KOD-plus-(TOYOBO)，通过重叠PCR扩增了期望的DNA片段。

进一步，通过使用限制性酶XbaI (NEB)和PmeI (NEB)克隆，构建体了哺乳动物细胞表达载体pCMA_KLK5抑制性肽Fc融合体。根据在(1-1)中描述的方法进行操作。

(5-4) KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc的制备

使用PEI MAX 40000 (Polysciences)将在(5-3)中构建的表达载体转染进Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific)中，并在培养细胞6天后收集培养物上清液。使用MabSelect SuRe (GE healthcare)从培养物上清液收集期望的Fc融合体，并使用AmiconUltra NMWL 10,000 (Merck KGaA Millipore)用PBS替换缓冲液，以制备KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc。

实施例6. KLK5抑制性肽Fc融合体的评价

(6-1) KLK5抑制性肽Fc融合体的人/小鼠KLK5、人/小鼠KLK7和人/小鼠KLK14抑制活性的评价

根据在实施例3-1中描述的方法，评价了每种KLK5抑制性肽Fc融合体对人/小鼠KLK5、人/小鼠KLK7和人/小鼠KLK14的抑制活性。作为通过每种浓度的每种抑制性肽Fc融合体计算底物肽的降解速率和使用GraphPad Prism (5.0版; GraphPad Software Inc.)计算50%抑制浓度(IC

(6-2) KLK5抑制性肽Fc融合体的交叉反应性的评价

象在(3-2)中的结果一样，对于1 μM的抑制性肽的终浓度，一些抑制性肽Fc融合体表现出与牛胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和纤溶酶的弱交叉反应性(其中IC

(6-3)使用肽底物评价KLK5抑制性肽Fc融合体的KLK5抑制活性(抑制常数K

评价了KLK5抑制性肽Fc融合体对人KLK5的抑制活性，并计算了抑制常数K

计算每种抑制性肽Fc融合体在每种浓度的底物肽降解速率，并评价每种抑制性肽Fc融合体的人KLK5抑制活性，在0 nM浓度的抑制性肽Fc融合体的降解速率作为100%(图102)。在10 nM的酶浓度使用GraphPad Prism (5.0版; GraphPad Software Inc.)根据Michaelis-Menten方程式计算最大反应速率V

(6-4)使用蛋白底物评价KLK5抑制性肽Fc融合体的KLK5抑制活性

使用人桥粒芯糖蛋白1和人桥粒芯胶蛋白1作为蛋白底物，评价了每种KLK5抑制性肽Fc融合体的KLK5抑制活性。将用测定缓冲液稀释的人KLK5和每种KLK5抑制性肽Fc融合体(D3-K50032dN-Fc、D3-K50055-Fc、D3-K51072-Fc或D3-K50016dN-Fc)混合，随后在37℃反应1小时。接着，向其中加入用测定缓冲液稀释的每种蛋白底物，随后在37℃反应4小时。此后，向其中加入含有还原剂的SDS样品缓冲液，并通过在99℃处理5分钟停止酶反应。此后，使用SDS-PAGE (还原条件)和蛋白质印迹分析评价蛋白底物的降解。底物和酶的组合、抑制性肽Fc融合体和用于蛋白质印迹分析的抗体如下。

使用人桥粒芯糖蛋白1的评价：具有1 μM的终浓度的hKLK5，具有0.001-10 μM的终浓度的抑制性肽Fc融合体，具有1 μM的终浓度的重组人桥粒芯糖蛋白-1 Fc嵌合体蛋白(R&D Systems, Inc.)，桥粒芯糖蛋白1抗体(aa471-499) (LSBio)，和抗-兔IgG，HRP-连接的F(ab') 2片段Donkey (GE healthcare)

使用人桥粒芯胶蛋白1的评价：具有0.2 μM的终浓度的hKLK5，具有0.0002-2 μM的终浓度的抑制性肽Fc融合体，具有2 μM的终浓度的带有C-端His标签的重组人桥粒芯胶蛋白-1蛋白(R&D Systems, Inc.)，和Penta His HRP缀合物(QIAGEN)

人桥粒芯糖蛋白1和人桥粒芯胶蛋白1在没有人KLK5存在下不会降解，但是在有人KLK5存在下完全降解。作为预温育的人KLK5和每种KLK5抑制性肽Fc融合体的评价的结果，揭示了每种抑制性肽Fc融合体抑制人KLK5酶的人桥粒芯糖蛋白1和人桥粒芯胶蛋白1降解活性。在人KLK5浓度和抑制性肽Fc融合体浓度的相同条件下，完全抑制了人桥粒芯糖蛋白1和人桥粒芯胶蛋白1的降解(图103)。

实施例7. KLK5抑制性肽Fc融合体对内瑟顿综合征模型小鼠中经皮失水(TEWL)增加的遏制的作用

(7-1)内瑟顿综合征模型小鼠

具有SPINK5（其为内瑟顿综合征的致病基因）中的突变的Crusty2小鼠被称作内瑟顿综合征模型小鼠，且Crusty2 同型小鼠(+/+)表现出皮肤症状(Mutagenetix数据库)。

(7-2) KLK5抑制性肽Fc融合体对内瑟顿综合征模型小鼠中TEWL增加的遏制的作用

通过人工授精使Crusty2 (±)小鼠和Crusty2 (+/+)小鼠杂交，并使用得到的后代(Crusty2 (±)小鼠或Crusty2 (+/+)小鼠)评价在(5-4)中生产的KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc。从出生后0或1天，每隔一天皮下地施用PBS或100 mg/kg D1-K50055-Fc，持续4周。仅在第一次施用时，施用3倍量的D1-K50055-Fc作为负荷剂量。使用VAPO SCAN(AS-VT100RS, Asahi Techno Lab. Ltd.)，在施用后2和4周测量在小鼠的背部或臀部的皮肤上的TEWL(图7)。在每个PBS施用组和D1-K50055-Fc施用组中，Crusty2 (±)小鼠的数目为9，且Crusty2 (+/+)小鼠的数目为12。

与Crusty2 (±)小鼠相比在Crusty2 (+/+)小鼠中观察到TEWL的统计上显著的增加，并且与2周龄小鼠相比在4周龄小鼠中更显著。从施用算起4周后，与PBS施用组相比，在D1-K50055-Fc施用组中在背部和更严重的臀部观察到TEWL的统计上显著的减少。从以上内容，揭示了在小鼠中观察到由SPINK5中的突变造成的TEWL的增加，且D1-K50055-Fc表现出抑制作用。进一步，证实了本发明的肽和其缀合物（包含D1-K50055-Fc）可用于减少内瑟顿综合征的皮肤症状。

工业适用性

本发明提供的肽和缀合物以及含有它们的药物组合物可用于治疗多种疾病。

序列表自由正文

SEQ ID NO: 1：人SPINK2的氨基酸序列(图9)

SEQ ID NO: 2：人KLK5的氨基酸序列(图10)

SEQ ID NO: 3：人KLK7的氨基酸序列(图11)

SEQ ID NO: 4：人KLK14的氨基酸序列(图12)

SEQ ID NO: 5：KLK5抑制性肽K50032的核苷酸序列(图13)

SEQ ID NO: 6：KLK5抑制性肽K50032的氨基酸序列(图14)

SEQ ID NO: 7：KLK5抑制性肽K50055的核苷酸序列(图15)

SEQ ID NO: 8：KLK5抑制性肽K50055的氨基酸序列(图16)

SEQ ID NO: 9：KLK5抑制性肽K51072的核苷酸序列(图17)

SEQ ID NO: 10：KLK5抑制性肽K51072的氨基酸序列(图18)

SEQ ID NO: 11：KLK5抑制性肽K50016的核苷酸序列(图19)

SEQ ID NO: 12：KLK5抑制性肽K50016的氨基酸序列(图20)

SEQ ID NO: 13：KLK5抑制性肽K51034的核苷酸序列(图21)

SEQ ID NO: 14：KLK5抑制性肽K51034的氨基酸序列(图22)

SEQ ID NO: 15：KLK5抑制性肽K50062的核苷酸序列(图23)

SEQ ID NO: 16：KLK5抑制性肽K50062的氨基酸序列(图24)

SEQ ID NO: 17：KLK5抑制性肽K51090的核苷酸序列(图25)

SEQ ID NO: 18：KLK5抑制性肽K51090的氨基酸序列(图26)

SEQ ID NO: 19：KLK5抑制性肽K50098的核苷酸序列(图27)

SEQ ID NO: 20：KLK5抑制性肽K50098的氨基酸序列(图28)

SEQ ID NO: 21：KLK5/KLK7抑制性肽K51028的核苷酸序列(图29)

SEQ ID NO: 22：KLK5/KLK7抑制性肽K51028的氨基酸序列(图30)

SEQ ID NO: 23：KLK5/KLK7抑制性肽K51005的核苷酸序列(图31)

SEQ ID NO: 24：KLK5/KLK7抑制性肽K51005的氨基酸序列(图32)

SEQ ID NO: 25：KLK5/KLK7抑制性肽K50031的核苷酸序列(图33)

SEQ ID NO: 26：KLK5/KLK7抑制性肽K50031的氨基酸序列(图34)

SEQ ID NO: 27：KLK5/KLK7抑制性肽K51057的核苷酸序列(图35)

SEQ ID NO: 28：KLK5/KLK7抑制性肽K51057的氨基酸序列(图36)

SEQ ID NO: 29：KLK5/KLK14抑制性肽K51069的核苷酸序列(图37)

SEQ ID NO: 30：KLK5/KLK14抑制性肽K51069的氨基酸序列(图38)

SEQ ID NO: 31：KLK5/KLK14抑制性肽K50015的核苷酸序列(图39)

SEQ ID NO: 32：KLK5/KLK14抑制性肽K50015的氨基酸序列(图40)

SEQ ID NO: 33：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50032dN-Fc的核苷酸序列(图41)

SEQ ID NO: 34：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50032dN-Fc的氨基酸序列(图42)

SEQ ID NO: 35：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50055-Fc的核苷酸序列(图43)

SEQ ID NO: 36：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50055-Fc的氨基酸序列(图44)

SEQ ID NO: 37：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51072-Fc的核苷酸序列(图45)

SEQ ID NO: 38：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51072-Fc的氨基酸序列(图46)

SEQ ID NO: 39：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50016dN-Fc的核苷酸序列(图47)

SEQ ID NO: 40：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50016dN-Fc的氨基酸序列(图48)

SEQ ID NO: 41：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51034-Fc的核苷酸序列(图49)

SEQ ID NO: 42：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51034-Fc的氨基酸序列(图50)

SEQ ID NO: 43：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50062-Fc的核苷酸序列(图51)

SEQ ID NO: 44：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50062-Fc的氨基酸序列(图52)

SEQ ID NO: 45：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51090-Fc的核苷酸序列(图53)

SEQ ID NO: 46：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K51090-Fc的氨基酸序列(图54)

SEQ ID NO: 47：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50098dN-Fc的核苷酸序列(图55)

SEQ ID NO: 48：KLK5抑制性肽Fc融合体D3-K50098dN-Fc的氨基酸序列(图56)

SEQ ID NO: 49：KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51028-Fc的核苷酸序列(图57)

SEQ ID NO: 50：KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51028-Fc的氨基酸序列(图58)

SEQ ID NO: 51：KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51005-Fc的核苷酸序列(图59)

SEQ ID NO: 52：KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51005-Fc的氨基酸序列(图60)

SEQ ID NO: 53：KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K50031-Fc的核苷酸序列(图61)

SEQ ID NO: 54：KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K50031-Fc的氨基酸序列(图62)

SEQ ID NO: 55：KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51057-Fc的核苷酸序列(图63)

SEQ ID NO: 56：KLK5/KLK7抑制性肽Fc融合体D3-K51057-Fc的氨基酸序列(图64)

SEQ ID NO: 57：KLK5/KLK14抑制性肽Fc融合体D3-K51069dN-Fc的核苷酸序列(图65)

SEQ ID NO: 58：KLK5/KLK14抑制性肽Fc融合体D3-K51069dN-Fc的氨基酸序列(图66)

SEQ ID NO: 59：KLK5/KLK14抑制性肽Fc融合体D3-K50015-Fc的核苷酸序列(图67)

SEQ ID NO: 60：KLK5/KLK14抑制性肽Fc融合体D3-K50015-Fc的氨基酸序列(图68)

SEQ ID NO: 61: SPINK2突变体肽的式(图69)

SEQ ID NO: 62：引物1的核苷酸序列(图70)

SEQ ID NO: 63：引物2的核苷酸序列(图71)

SEQ ID NO: 64：引物3的核苷酸序列(图72)

SEQ ID NO: 65：引物4的核苷酸序列(图73)

SEQ ID NO: 66：引物5的核苷酸序列(图74)

SEQ ID NO: 67：引物6的核苷酸序列(图75)

SEQ ID NO: 68：引物7的核苷酸序列(图76)

SEQ ID NO: 69：引物8的核苷酸序列(图77)

SEQ ID NO: 70：引物9的核苷酸序列(图78)

SEQ ID NO: 71：引物10的核苷酸序列(图79)

SEQ ID NO: 72：引物11的核苷酸序列(图80)

SEQ ID NO: 73：引物12的核苷酸序列(图81)

SEQ ID NO: 74：引物13的核苷酸序列(图82)

SEQ ID NO: 75：引物14的核苷酸序列(图83)

SEQ ID NO: 76：引物15的核苷酸序列(图84)

SEQ ID NO: 77：在KLK7底物肽中的氨基酸序列(图85)

SEQ ID NO: 78：在牛α-胰凝乳蛋白酶底物肽中的氨基酸序列(图86)

SEQ ID NO: 79：在嗜中性粒细胞弹性蛋白酶底物肽中的氨基酸序列(图87)

SEQ ID NO: 80：在人蛋白C底物肽中的氨基酸序列(图88)

SEQ ID NO: 81：引物16的核苷酸序列(图89)

SEQ ID NO: 82：引物17的核苷酸序列(图90)

SEQ ID NO: 83：引物18的核苷酸序列(图91)

SEQ ID NO: 84：引物19的核苷酸序列(图92)

SEQ ID NO: 85：引物20的核苷酸序列(图93)

SEQ ID NO: 86：引物21的核苷酸序列(图94)

SEQ ID NO: 87：人IgG1的Fc的氨基酸序列(图95)

SEQ ID NO: 88：人SPINK5的D8的氨基酸序列(图96)

SEQ ID NO: 89：人SPINK5的D9的氨基酸序列(图97)

SEQ ID NO: 90：人SPINK9的氨基酸序列(图98)

SEQ ID NO: 91：小鼠KLK5的氨基酸序列(图99)

SEQ ID NO: 92：小鼠KLK7的氨基酸序列(图100)

SEQ ID NO: 93：小鼠KLK14的氨基酸序列(图101)

SEQ ID NO: 94：引物22的核苷酸序列(图104)

SEQ ID NO: 95：KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc的核苷酸序列(图105)

SEQ ID NO: 96：KLK5抑制性肽Fc融合体D1-K50055-Fc的氨基酸序列(图106)。