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检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组、试剂盒及应用

文献发布时间：2023-06-19 11:59:12

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种大豆种传检疫性病毒南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组、快速检测试剂盒及应用。

技术背景

南芥菜花叶病毒是我国进境植物检疫性有害生物，是正义RNA病毒科(Secoviridae)，豇豆花叶病毒亚科(Commovirinae)线虫传多面体病毒属 (Nepovirus)的成员。南芥菜花叶病毒为单链正义RNA病毒，病毒粒体为球状正二十面体，直径为25～30nm，致死温度为55～61℃，室温下体外可存活1～2 周。该病毒寄主范围广泛，可侵染涉及174属215种植物，主要危害的为葡萄、黄瓜、西葫芦、草莓。大豆、番茄、菜豆等经济作物。ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸形和耳突等，在葡萄上表现软皮和茎凹症状，在黄瓜上表现斑驳症状，严重影响农作物产量和质量。该病毒目前主要分布在荷兰、比利时等欧洲国家和美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、南非、日本等，我国尚未有报道。

目前，南芥菜花叶病毒的检测方法主要包括ELISA、RT-PCR和实时荧光 TaqMan-MGB探针RT-PCR等检测方法。但这些方法都存在局限性，ELISA方法检出限低，难以实现无症状植物中少量病毒的检测，且ELISA方法常常无法鉴别病毒种类，特异性差，而基于PCR技术的检测方法存在反应时间长、需要昂贵的热循环仪器和专业的操作人员等缺陷，难以满足口岸检疫的快速检测的需求。

交叉引物等温扩增(cross-priming isothermal amplification，CPA)是杭州优思达生物技术有限公司研发的核酸扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。根据反应体系中交叉引物等温数量的不同，CPA可分为单交叉引物等温扩增(singlecrossing cpa)和双交叉引物等温扩增(double crossing cpa) 两种类型。这两种类型反应都需要一条交叉引物(CPF)、两条扩增引物(DR、MBR)、两条解开链的外围引物(BF、BR)以及具有链置换活性的DNA聚合酶 Bst。其中，双交叉CPA具有两条交叉引物，比单交叉CPA多一条交叉引物。单交叉CPA是在对双交叉CPA机制优化后诞生的，其能够在不到一小时的时间内扩增出4个基因组DNA拷贝，具有高度的特异性，也是目前被广泛引用的交叉引物等温扩增技术。CPA自诞生起，其主要应用于肺结核分枝杆菌的检测，进行肺结核病的诊断。目前优思达公司开发了结核分枝杆菌核酸检测试剂盒 (TB-CPA)，具有较高的灵敏度和特异度，可以在2h内完成检测并出具报告，适用于基层医院和卫生所。此外，CPA在食品安全领域也开展了研究如转基因作物检测、食源性致病菌李斯特菌的检测；在动物检疫领域建立了结合试纸条的非洲猪瘟检测方法，在植物检疫性领域建立了李属坏死环斑病毒(Prunusnecrotic ringspot virus，PNRSV)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottlemosaic virus，GGMMV)的检测方法。

发明内容

本发明针对检测南芥菜花叶病毒存在的问题，提供了一种南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增快速检测试剂盒及引物，该试剂盒具有高特异性、高灵敏度、操作简单、检测快、检测结果直观的特点。

本发明首先公开了一种检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组，所述交叉引物等温扩增引物组由外围置换引物ArBF2、外围置换引物ArBR2、扩增引物ArDR2、扩增引物ArMBR2、交叉引物ArCPF2组成；

所述外围置换引物ArBF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述外围置换引物ArBR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述扩增引物ArDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述扩增引物ArMBR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述交叉引物ArCPF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

作为本发明的优选方案，所述扩增引物ArDR2的5’端有6-羧基荧光素(FAM) 标记，扩增引物ArMBR2的5’端有生物素荧光基团(Biotin)标记。

更加优选的，所述外围置换引物ArBF2、外围置换引物ArBR2、扩增引物 ArDR2、扩增引物ArMBR2和交叉引物ArCPF2的摩尔比为：1：1：3：3：5。

本发明还提供了一种检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增试剂，其包括所述的交叉引物等温扩增引物组；

所述外围置换引物ArBF2和所述外围置换引物ArBR2在所述扩增试剂中的终浓度均为0.2μmol/L；

所述扩增引物ArDR2和扩增引物ArMBR2在所述扩增试剂中的终浓度均为 0.6μmol/L；

所述交叉引物ArCPF2在所述扩增试剂中的终浓度均为1μmol/L。

本发明还提供了一种检测菜豆荚斑斑驳病毒的交叉引物等温扩增试剂盒，其包括所述的引物组或所述的扩增试剂。

本发明还提供了所述的引物组或所述的扩增试剂或所述的试剂盒在检测待检测样品是否感染南芥菜花叶病毒中的应用。

本发明还进一步提供了一种检测待测样品是否感染南芥菜花叶病毒的方法，其包括如下步骤：

采用所述的引物组或所述的扩增试剂或所述的试剂盒对待测样品进行交叉引物等温扩增，

利用荧光染料和实时荧光仪器进行实时监测，观察荧光曲线；

若未出现扩增曲线，则待测样品没有南芥菜花叶病毒侵染；

若出现扩增曲线，则待测样品为南芥菜花叶病毒感染。

本发明还进一步提供了一种检测待测样品是否感染南芥菜花叶病毒的方法，其包括如下步骤：

采用所述的引物组或所述的扩增试剂或所述的试剂盒对待测样品进行交叉引物等温扩增，

利用核酸试纸条检测扩增产物，2-5min后观察试纸条；

若在质控线出现一条蓝色条带，在检测线无条带出现，则待测样品没有南芥菜花叶病毒侵染；

若在质控线出现一条蓝色或红色条带，在检测线出现红色一条条带，则待测样品为南芥菜花叶病毒感染。

优选的，所述交叉引物等温扩增反应条件为60℃，反应时间为90min。

优选的，所述交叉引物等温扩增的模板为RNA。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

(1)由于交叉引物等温扩增检测方法成本低廉，利用AMV逆转录酶和Bst DNA聚合酶在60℃实现等温扩增(无需单独反转录步骤，可直接实现RNA模板的扩增)，因此本发明提供的试剂盒使用方便且使用成本低。

(2)本发明提供的试剂盒得到的反应结果直观准确，无需进行复杂操作。实时荧光检测方法只需要在试剂盒反应体系中加入SYTO

(3)本发明提供的试剂盒特异性好，对南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒等都呈阴性反应；灵敏度高，实时荧光检测方法最低可以检测到浓度为5×10

(4)本发明所述的南芥菜花叶病毒交叉引物等温扩增试剂盒可快速、灵敏的检测南芥菜花叶病毒。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异型好，非常适用于医疗卫生、食品安全以及进出口检疫的现场检测，易于大范围推广应用。

附图说明

图1是本发明利用实时荧光交叉引物等温扩增筛选检测南芥菜花叶病毒引物组结果图；实时荧光每60s监测一次，一个循环为1min。S1～S5依次对应ArMV 引物组S1-引物组S5的实时荧光交叉引物等温扩增的扩增曲线，NC (Negativecontrol，NC)为以水为模板的扩增曲线；

图2是本发明利用实时荧光交叉引物等温扩增方法评估S3引物组检测 ArMV特异性结果图；以S3为实时荧光交叉引物等温扩增引物组检测SBMV、 ToRSV、ArMV、TRSV和BPMV的总RNA模板和以水为模板(NC)的扩增曲线；

图3是本发明提供的实时荧光交叉引物等温扩增方法检测ArMV灵敏度试验结果图；以ArMV总RNA模板浓度为50ng/μL连续10倍梯度稀释，设立7 个浓度梯度，10

图4是本发明提供的交叉引物等温扩增试剂盒结合核酸试纸条方法检测 ArMV特异性试验结果图；其中，编号1-5依次对应南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒总RNA模板的检测结果，NC为以水为模板的检测结果；

图5是本发明提供的交叉引物等温扩增试剂盒结合核酸试纸条方法检测 ArMV灵敏度试验结果图；10

图6是实时荧光PCR检测ArMV灵敏度试验结果图；10

具体实施方式

以下将配合实施例再详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段解决技术问题并达成技术功效的实验过程能充分理解并拘以实施。

实施案例中所涉及的材料：

a.引物由上海派森诺生物有限公司合成；Bst DNA聚合酶购自New England 公司；AMV逆转录酶购自Promega公司；Pfu DNA聚合酶购自全式金公司；甜菜碱购自上海生工生物工程股份有限公司；SYTO

b.南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)(实验样本为带毒的白肋烟叶片，在特异性评估中用于对照的样本南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus，SBMV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus，ToRSV)、烟草环斑病毒 (Tobaccoringspot virus，TRSV)和菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus，BPMV) 同样为带毒的白肋烟叶片，这些实验样本均由中国检验检疫科学研究院提供。

实施例1：交叉引物等温扩增引物的设计与合成

一：序列获得

1.RNA的提取

取侵染SBMV、ToRSV、ArMV、TRSV和BPMV病毒的烟草叶片各50mg，参照植物总RNA提取试剂盒操作说明，提取ArMV病毒样品及阴性对照的总 RNA。

2.cDNA合成

取上述提取的5种病毒总RNA各3μL，按两步法试剂盒(primescript

3.CP基因引物设计合成

从GenBank中下载南芥菜花叶病毒基因组序列(GenBank登录号为：AF05 5887、AF055888、DQ875594)，利用软件Geneious 11.1.5，基于GC含量40％～50％，TM值50％～60％，避免重复序列的引物设计原则设计南芥菜花叶病毒C P基因引物，上游扩增引物ArF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，下游扩增引物ArR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示(ArF1-CTCCTGAAGGAAGT CTTGTGACT、ArR2-ACACTGTCGCCACTAAATGCATG)，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

4.CP扩增

利用筛选的引物和高保真酶Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA polymerase，2xTransStart FastPfu PCR Super Mix，全式金)进行PCR扩增ArMV-CP基因， 50μL反应体系如下：2×Super Mix25μL，模板cDNA1μL，ArF1和ArR2各1μL，引物终浓度为0.5μmol/L，补ddH

5.序列获得(连接转化克隆)

将PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证后，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (SanPrepColumn DNA Gel Extraction Kit，生工)割胶回收，将纯化后的DNA 连A尾，配置10μL反应体系，包括Ex taq酶0.1μL，10×PCR缓冲液1μL， dNTP 0.8μL，纯化的DNA 8.1μL，再连接到PMD19T载体(TakaRa)，配置 10μL反应体系，包括5μL Solution I，0.5μL PMD19T载体，4.5μL cDNA，在冰上配置，置于16℃下连接12h，再将连接产物转化到感受态细胞(T-FastCompetentE.Coli，天根)，取转化好的菌液200μL，并加入40μL X-gal(20mg/ml) 和16μLIPTG(50mg/ml)混匀后涂布于氨苄抗性(ampicillin，Amp)的固体培养基，置于37℃培养箱中培养10-12h，挑白色单菌落扩摇。

扩摇后的菌液送测序，测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，得到 ArMV-CP基因序列，经过NCBI序列比对后确定为ArMV-CP基因序列。

二：引物的设计与合成

1.特异引物设计

利用软件Geneious Primers11.1.5，基于CPA引物设计原则(交叉引物由5’端的扩增引物ArMBR和与3’端的与靶基因互补的20-22bp左右的序列组成)，交叉引物全长在40bp左右，其余4条引物(外围置换引物ArBF/ArBR和扩增引物ArDR/ArMBR)都在18-20bp左右，各引物的CG含量需控制在40％～60％之间，以保证引物间的Tm值不会差距太大，且在引物设计时要尽量避免引物之间的二聚体对扩增结果的影响，同时尽量避免大量重复序列和突变位点)，设计了 5组ArMV-CP基因序列的CPA引物(表1)，每组引物包含5条引物，包括交叉引物ArCPF(39-42bp)、外围剥离单链的引物ArBF/ArBR(19bp)以及扩增引物ArDR/ArMBR(18-19bp)。S2组外围置换引物ArBF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外围置换引物ArBR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，扩增引物 ArDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，扩增引物ArMBR2的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示，交叉引物ArCPF2的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，S1 组对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10所示；S3组对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.15所示；S4组对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.20所示；S5组对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.25所示。

引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。

实施例2：交叉引物等温扩增引物在检测南芥菜花叶病毒中的应用

一、引物筛选

以南芥菜花叶病毒总RNA为模板，利用实时荧光交叉引物等温扩增筛选检测南芥菜花叶病毒5组引物组。结果如图(1)所示：经过实时荧光交叉引物等温扩增检测，确定用于检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增的引物组S2(表1)，引物组S2包括外围置换引物(ArBF2和ArBR2)、两条扩增引物(ArDR2 和ArMBR2)和1条交叉引物等温(ArCPF2)。

表1南芥菜花叶病毒交叉引物等温扩增反应引物信息表

二、实时荧光交叉引物等温检测方法的建立

(1)实时荧光RT-CPA使用实时荧光仪器：CFX Connect Real-Time System (Bio-Rad，America)。

(2)表2南芥菜花叶病毒交叉引物等温扩增反应体系

实时荧光反应体系需要在表2中的反应体系中加入0.5μL的SYTOTM 16绿色核酸染料(100μmol/L，ThermoFisher)，其余与表2种的反应体系一致。

(3)结果判定：

是否出现扩增曲线，

阴性-未出现扩增曲线，未收集到荧光信号；

阳性-出现扩增曲线，收集到荧光信号；

无效-扩增曲线杂乱，且断裂的情况。

(4)实时荧光方法反应程序：

实时荧光交叉引物等温扩增在60℃恒温下反应90min，荧光每60s监测一次，1min为一个周期，并选择第一通道中的FAM通道(激发波长和发射波长在450-490nm)作为荧光的吸收通道。

三、试纸条检测方法的建立

交叉引物等温扩增结合核酸试纸条的检测方法反应需要使用PCR仪器 (Bio-RadT100

交叉引物等温扩增结合核酸试纸条的检测方法在60℃恒温下反应90min，反应结束后将核酸试纸条插入到PCR管中，2-5min后即可观察结果。

核酸试纸条的结果鉴定方法如下：

阴性(-)：仅在质控线(Controlband)出现一条蓝色条带，在检测线(Testband) 无条带出现。证明所检测的样本没有南芥菜花叶病毒侵染。

阳性(+)：出现两条条带，质控线出现一条红色或蓝色条带，检测线出现一条红色条带。证明所检测的样本为南芥菜花叶病毒侵染。

四：交叉引物等温扩增检测体系特异性、灵敏度分析

1.实时荧光检测方法

(1)特异性分析

利用5种大豆种传检疫性病毒(南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒)的总RNA为模板检测体系的特异性，同时以水为模板设置阴性对照。利用交叉引物等温实时荧光检测体系，进行引物组S2检测南芥菜花叶病毒的特异性评估，利用实时荧光PCR仪对扩增反应过程进行实时监测。引物组S2的特异性评估结果如图(2)所示：以南芥菜花叶病毒总RNA为模板的交叉引物等温扩增反应产物出现扩增曲线；以南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒总RNA为模板的交叉引物等温扩增反应没有出现荧光扩增曲线，且以水为模板的阴性对照也没有出现扩增曲线。结果显示引物组S2检测体系特异性良好，可特异的检测到南芥菜花叶病毒，最终确定引物组S2为交叉引物等温扩增检测南芥菜花叶病毒试剂盒中引物组。

(2)灵敏度分析

用RNase-Free ddH

2.核酸试纸条检测方法

(1)特异性分析

同样利用五种大豆种传检疫性病毒(南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒)的总RNA为模板检测体系的特异性，同时以水为模板设置阴性对照。反应体系如表2所示，使用一次性核酸试纸条对产物进行检测。结果如图(4)所示：以南芥菜花叶病毒总RNA为模板的交叉引物等温扩增反应产物出现两条条带，质控线和检测线都出现红色条带；以南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒总RNA 为模板的交叉引物等温扩增反应产物，仅在质控线出现一条蓝色条带，检测线无条带出现。结果显示核酸试纸条交叉引物等温扩增检测体系特异性良好，可特异的检测到南芥菜花叶病毒。

(2)灵敏度分析

用RNase-Free ddH

3.Taq-Man实时荧光RT-PCR

为了比较本研究建立的交叉引物等温扩增检测方法与TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR检测灵敏度，参考国家标准设计的ArMV引物和探针(表3,SEQ ID NO.28～SEQ IDNO.30)，将连续10倍梯度稀释的ArMV总RNA进行RT-qPCR 反应，分析比较交叉引物等温扩增技术和RT-qPCR检测ArMV的灵敏度差异。 RT-qPCR 50μL反应体系如(表4)所示。RT-qPCR反应程序为：50℃反转录30 min；95℃预变性3min；95℃预变形15s，60℃延伸30s，40个循环(在循环步骤收集荧光)。Taq-Man实时荧光RT-PCR的检测结果如图(6)所示，10

表3用于RT-qPCR检测ArMV引物和探针

表4 RT-qPCR反应体系

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组、试剂盒及应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA