一种可注射镁合金复合多网络水凝胶的制备方法及应用

技术领域

本发明属于细胞生物学和生物医用材料制备技术领域，具体地涉及一种用于骨缺损修复的镁合金复合多网络水凝胶制备方法及应用。

背景技术

临床上，超过3cm直径的骨缺损难以自然愈合。通常，骨移植是其中一种治疗手法，骨移植分为自体骨移植和异体骨移植，但这二种方法均存在一定的缺陷。自体移植物的缺点是可用于移植的材料有限，且可能有感染和骨吸收的风险。同种异体骨移植和异种移植的失败率很高，具有免疫排斥反应和较高的感染风险，并且骨吸收较自体骨可能更加严重。这些局限性促使人们努力研究支架与生化信号联合使用来促进骨修复。

近年来，再生医学提出用生物水凝胶配合生长因子或促进骨生长的材料来对骨缺损修复。利用水凝胶成胶前液体的特性，可以直接经皮注射修复骨缺损。天然生物水凝胶具有优异的生物相容性，更接近人体细胞外基质成分。目前应用最多的有天然多糖类，蛋白质等生物大分子。单一成分水凝胶会存在生物相容性不佳和机械性能差的特点，常需要对天然材料进行化学改性，或将两种或多种物质配合使用对力学性能以及生物相容性等参数进行调节，制备出具有特异性功能的双网络水凝胶，更真实的模拟人体组织环境情况。

海藻酸钠是一种天然多糖，通过和钙离子交联生成水凝胶。但是现有技术中，海藻酸钠在修复骨损研究方面，其单一成分的海藻多糖凝胶弹性模量低于骨组织，并且体内容易降解。

因此，有必要研究一种新的骨损修复材料。

发明内容

本发明实施方式的目的是提供一种具有可注射后形成具有一定韧性等力学性能结构的镁合金复合多网络水凝胶，从而用于骨缺损修复。

为解决上述技术问题，本发明的具体技术方案如下：

一种可注射镁合金复合多网络水凝胶预聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将海藻酸钠溶解于无菌水溶液中，得到海藻酸钠水溶液；

在所述海藻酸钠水溶液中加入甲基丙烯酸酐，进行反应；

所述反应结束后进行沉淀并溶解透析，得到透析液；

将所述透析液冻干，获得甲基丙烯酰化海藻酸钠粉末；

将所述甲基丙烯酰化海藻酸钠粉末溶解于缓冲液与光引发剂混合，得到甲基丙烯酰化海藻酸钠和光引发剂的第一混合溶液；

调节胶原溶液的PH值至中性；

混合第一混合溶液和所述胶原溶液，得到第二混合溶液；

按比例在所述第二混合溶液中加入镁合金粒子，获得水凝胶预聚体。

可选地，所述海藻酸钠水溶液的质量浓度为0.1％-10％。

可选地，所述光引发剂包括苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。

可选地，所述镁合金为约含5％质量锌的镁锌合金。

可选地，所述镁合金按照质量比例0.05％-1％添加。

可选地，所述甲基丙烯酰化海藻酸钠缓冲溶液的质量体积分数为0.05％-1％。

可选地，所述第二混合溶液与所述胶原溶液的体积比为1:(1-0.1)。

本发明还提出一种可注射镁合金复合多网络水凝胶的制备方法，利用本发明所提出的可注射镁合金复合多网络水凝胶预聚体的方法制备。

可选地，还包括以下步骤：

将所述水凝胶预聚体至于含有钙离子的培养基中进行培养；

以特定波长的光照射，以形成多网络水凝胶。

可选地，所述培养基的钙离子浓度为0.1-5mM。

本发明还提出一种骨缺损修复材料，利用本发明所提出的水凝胶或者水凝胶预聚体的制备方法制备。

本发明利用多网络水凝胶能够提高水凝胶的力学性能，提供支架通道，利于营养物质和养分传输，改善降解速度，通过镁金属对骨细胞的刺激作用，促进骨细胞生长，达到修复骨缺损的目的。同时注射用水凝胶可以更便捷的填充缺损部位，减少患者多次开创手术的痛苦。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。

图1是根据本发明其中一实施例的含有1％甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶SEM图；

图2是根据本发明其中一实施例的含含有2％甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶SEM图；

图3是根据本发明实施例1、实施例2的水凝胶的弹性模量测试图；

图4是根据本发明其中一实施例的MC3T3-E1在含有1％甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶表面生长7天细胞形态示意图；

图5根据本发明其中一实施例的MC3T3-E1在含有2％甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶表面生长7天细胞形态示意图；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。以下各个实施例的划分是为了描述方便，不应对本发明的具体实现方式构成任何限定，各个实施例在不矛盾的前提下可以相互结合相互引用。

本发明涉及一种镁合金复合多网络水凝胶制备方法，用于骨缺损修复。按下述方法执行：

甲基丙烯酸酰化海藻酸钠制备：

将海藻酸钠溶于无菌水中，过夜搅拌，使其完全溶解。使得海藻酸钠水溶液浓度为0.1％-10％，避光条件下逐滴加入甲基丙烯酸酐，1g海藻酸钠加入5-20ml甲基丙烯酸酐。充分搅拌，室温下避光反应24-72小时，丙酮沉淀后溶解透析，-80℃冻干形成甲基丙烯酰化海藻酸钠粉末。

镁合金复合多网络水凝胶预聚体制备：

将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶解于未添加钙、镁离子的缓冲液中，该缓冲液比如是磷酸氢钠-磷酸二氢钠(DPBS)，室温下过夜搅拌使其完全溶解，将光引发剂与甲基丙烯酰化海藻酸钠混合，使得甲基丙烯酰化海藻酸钠质量体积分数为0.05％-1％。将胶原置于4℃环境下，用0.06M乙酸和5M氢氧化钠调节胶原的PH为6.5-8。该胶原比如是鼠尾I型胶原。在低温下(4℃-10℃)，将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液和中性胶原溶液按比例(体积比1：1-0.1)混匀。混入0.05％-1％的镁合金微粒，镁合金为镁锌合金，质量比为镁95％，锌5％。

可注射镁合金复合多网络水凝胶使用方法

将上述水凝胶预聚体注射于含有0.1-5mM钙离子浓度的37℃培养基中，37℃培养30-60min,600-700nm红外照射30-60min，形成多网络水凝胶。将骨细胞接种在多网络水凝胶上，培养7-21天，观察细胞形态，对细胞活性及相应指标进行检测。

实施例1：

将1g海藻酸钠溶于无菌水中，过夜搅拌，使其完全溶解。使得海藻酸钠水溶液质量体积分数(w/v)为2.5％，避光条件下逐滴加入甲基丙烯酸酐，1g海藻酸钠加入12ml甲基丙烯酸酐。充分搅拌，室温下避光反应48小时，4倍体积丙酮加入发反应体系中，甲基丙烯酰化海藻酸钠沉淀析出。将甲基丙烯酰化海藻酸钠沉淀自然风干后溶解于无菌水中，置于10000Da透析袋中透析7天，每4小时换水一次。-80℃冻干形成甲基丙烯酰化海藻酸钠粉末。

将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶解于未添加钙、镁离子的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液(DPBS)中，室温下过夜搅拌使其完全溶解，将光引发剂与溶解的甲基丙烯酰化海藻酸钠混合，使得甲基丙烯酰化海藻酸钠质量体积分数为2.5％。将鼠尾I型胶原置于4℃环境下，0.06M乙酸和5M氢氧化钠调节胶原的PH为7。在低温下(4℃-10℃)，将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液和中性胶原溶液按比例混匀后加入镁合金微粒混合均匀。使得最后复合水凝胶预聚体各成分份浓度(w/v)为：甲基丙烯酰化海藻酸钠1％，光引发剂0.5％，胶原2％，镁合金微粒1％。将上述水凝胶预聚体溶液保存在4℃中。

本实施方式中的镁合金为镁锌合金，质量比为镁95％，锌5％。

将上述水凝胶预聚体置于含有2.5mM钙离子浓度的37℃DMEM培养基中60min培养,选择600nm红外照射约45min,形成多网络水凝胶，用PIUMA纳米压痕仪测试水凝胶内部弹性模量Gˊ为15±2.01KPa，如图3所示。将水凝胶冻干后，SEM扫描观察孔径以及镁微粒分布情况如图1所示。

将上述水凝胶预聚体注射于含有2.5mM钙离子浓度的37℃DMEM培养基中，37℃培养30min,600nm红外照射45min,形成多网络水凝胶。将MC3T3-E1细胞接种在多网络水凝胶上，培养7天，观察细胞形态，对骨细胞活性及相应指标进行检测，检测结果如图4所示，通过对MC3T3-E1细胞进行活死染色，可以观察到细胞形态正常，死细胞很少，镁合金复合多网络水凝胶生物相容性良好。

实施例2：

将1g海藻酸钠溶于无菌水中，过夜搅拌，使其完全溶解。使得海藻酸钠水溶液质量体积分数(w/v)为2.5％，避光条件下逐滴加入甲基丙烯酸酐，1g海藻酸钠加入12ml甲基丙烯酸酐。充分搅拌，室温下避光反应48小时，4倍体积丙酮加入发反应体系中，甲基丙烯酰化海藻酸钠沉淀析出。将甲基丙烯酰化海藻酸钠沉淀自然发风干后溶解于无菌水中，置于10000Da透析袋中透析7天，每4小时换水一次。-80℃冻干形成甲基丙烯酰化海藻酸钠粉末。

将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶解于未添加钙、镁离子的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液(DPBS)中，室温下过夜搅拌使其完全溶解，将光引发剂与溶解的甲基丙烯酰化海藻酸钠混合，使得甲基丙烯酰化海藻酸钠质量体积分数为2.5％。将鼠尾I型胶原置于4℃环境下，0.06M乙酸和5M氢氧化钠调节胶原的PH为7。在低温下(4℃-10℃)，将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液和中性胶原溶液按比例混匀后加入镁合金微粒混合均匀。使得最后复合水凝胶预聚体各成分份浓度(w/v)为：甲基丙烯酰化海藻酸钠2％，光引发剂0.5％，胶原2％，镁合金微粒1％。将上述水凝胶预聚体溶液保存在4℃中。本实施方式中的镁合金为镁锌合金，质量比为镁95％，锌5％。

将上述水凝胶预聚体置于含有2.5mM钙离子浓度的37℃DMEM培养基中60min,600nm红外照射约45min,形成多网络水凝胶，用PIUMA纳米压痕仪测试水凝胶内部弹性模量Gˊ为30.5±1.3KPa，如图3所示，将水凝胶冻干后，SEM扫描观察孔径以及镁合金微粒分布情况如图2所示。结果显示，与实例一进行对比，提高甲基丙烯酰化海藻酸钠的浓度能够改变水凝胶交联密度，改变孔径大小，显著提高多网络水凝胶力学性能。

将上述水凝胶预聚体注射于含有2.5mM钙离子浓度的37℃DMEM培养基中，37℃培养30min,600nm红外照射约45min,形成多网络水凝胶。将MC3T3-E1细胞接种在多网络水凝胶上，培养7天，观察细胞形态，对骨细胞活性及相应指标进行检测，如图5所示。由图2可知，对MC3T3-E1细胞进行活死染色，可以观察到细胞形态正常，死细胞很少，镁合金复合多网络水凝胶生物相容性良好，与实例一对比可知，弹性模量较大的多网络水凝胶更利于MC3T3-E1细胞增殖生长。

本发明还提出一种骨缺损修复材料，利用本发明所提出的水凝胶或者水凝胶预聚体的制备方法制备。

本发明利用多网络水凝胶能够提高水凝胶的力学性能，提供支架通道，利于营养物质和养分传输，改善降解速度，通过镁金属对骨细胞的刺激作用，促进骨细胞生长，达到修复骨缺损的目的。同时注射用水凝胶可以更便捷的填充缺损部位，减少患者多次开创手术的痛苦。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。