铁载体-二氢叶酸还原酶抑制剂偶联物及其应用

技术领域

本发明涉及化合物领域，具有地，本发明涉及铁载体-二氢叶酸还原酶抑制剂偶联物及其应用。

背景技术

天然的铁载体抗生素的发现，为新型抗生素的开发提供了思路。但天然的铁载体抗生素只有为数不多的几类，因此化学家通过人工合成的途径，开发了一系列铁载体-抗生素偶联物，丰富了铁载体抗生素的种类。

1977年，第一个人工合成的铁载体-抗生素偶联物诞生，它借鉴了Ferrimycin和阿波霉素的结构特点，将铁载体与磺胺类药物相连。抗菌活性测试发现，该类抗生素的抗菌谱与铁载体密切相关。作者还发现将铁载体与药物连接起来的连接臂对抗菌活性起着至关重要的作用，需要合理设计连接臂来控制抗生素的释放。这一研究开辟了铁载体-抗生素偶联物向抗生素开发的领域，对后续的研究有很好的指导价值。

许多人工合成的铁载体-抗生素偶联物相继被报道，它们含有各具特色的铁载体、连接臂和抗生素靶头。β-内酰胺类抗生素，氟喹诺酮类抗生素，Lactivicin，大环内酯类抗生素，氨基香豆素，5-氟尿嘧啶，青蒿素，三聚氰酸，镓，抗菌肽类抗生素，等均已用于人工合成铁载体-抗生素偶联物。

合成铁载体-抗生素偶联物最合适的药物莫过于β-内酰胺类抗生素和氟喹诺酮类抗生素。其中，β-内酰胺类抗生素的作用靶点是胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白(PBPs)，该靶点暴露在革兰氏阳性菌的外表面，存在于革兰氏阴性菌周质中。而氟喹诺酮类抗生素的作用靶点是存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞质中的DNA回旋酶。β-内酰胺类抗生素和氟喹诺酮类抗生素都含有可以引入较大侧链取代的位点，即可以接上铁载体且不影响其与相应靶点的结合。于是科学家将其应用于人工合成铁载体-抗生素偶联物，以期开发出具有市场潜力的抗生素。

2013年，Miller教授报道了链状的铁载体，即Danoxamine，与环丙沙星(一种氟喹诺酮类抗生素)偶联物和氯碳头孢(一种β-内酰胺类抗生素)偶联物的合成并分别测试了其对金黄色葡萄球菌的活性。Danoxamine-氯碳头孢偶联物只表现出微弱的抗金黄色葡萄球菌活性，与单独的氯碳头孢相比抗菌活性明显下降。这是因为氯碳头孢的作用靶点胞壁粘肽合成酶存在于金黄色葡萄球菌的外表面，而Danoxamine-氯碳头孢偶联物将药物载到细菌体内，使得药物远离了作用靶点，导致抗菌活性的缺失。

Danoxamine-环丙沙星偶联物对金黄色葡萄球菌SG511的MIC值为1μM，这与环丙沙星的抗菌效力相当。在环丙沙星上修饰上一个相对比较大的铁载体很可能在一定程度上减弱了其对DNA回旋酶的亲和力。而铁载体主动转运的方式，能够让药物在细菌体内富集，从而补偿了DNA回转酶亲和力的降低，两个因素的叠加使得Danoxamine-环丙沙星偶联物与单独的环丙沙星表现出相似的抗金黄色葡萄球菌活性。从抗菌谱来看，环丙沙星本身是一种广谱抗菌药物，其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抑制效果；而 Danoxamine-环丙沙星偶联物只对革兰氏阳性细菌有抑制效果，抗菌谱明显变窄。这是因为该类铁载体偶联物通过铁载体转运系统以主动运输的方式进入细菌，不同的铁载体只被相应的铁载体转运系统识别，由于Danoxamine的转运系统只存在于某些革兰氏阳性菌中，所以Danoxamine-环丙沙星偶联物只对相应的革兰氏阳性菌有抑制活性。

合成铁载体-抗生素偶联物一个容易被忽视而又非常重要的方面是连接臂的选择。现在大多数偶联物利用了常规的诸如酰胺键、酯键、铜催化的叠氮与炔的Click反应或硫醇与马来酰亚胺的加成等连接方式作为连接臂。β-内酰胺类抗生素和氟喹诺酮类抗生素制备的偶联物不需要断开连接臂仍能发挥抗菌活性，但大多数抗生素由于作用位点空间有限或很保守，必须从连接臂上释放出来。因此探究和开发可断开式连接臂是非常有必要的。

Miller教授在可断开式连接臂研究方面做了很多工作。2012年，他们报道了Desferrioxamine B-环丙沙星两个偶联物的合成，分别选用了具有可被酯酶和磷酸酶断开的连接臂。抗菌活性研究发现，第一个偶联物对测试菌株表现出一定的活性，但没有环丙沙星效果好。第二个偶联物对测试菌株未表现出抗菌活性。尽管未取得理想的效果，但作者并未放弃对连接臂的研究。2015年，他们报道了新的研究成果，即第三偶联物的合成及抗菌测试。这次作者选用了可通过还原方式断开的连接臂将铁载体与环丙沙星相连，抗菌活性测试表明，可断开式连接臂比非断开式的连接臂制备的偶联物抗菌效果要好一些。

美国麻省理工学院的Nolan教授在儿茶酚类铁载体肠杆菌素-抗生素偶联物的设计与开发方面也做出了非常突出的成绩。他们从肠杆菌素出发，先后与环丙沙星、氨苄西林和万古霉素等通过多种连接臂进行偶联，构建了一系列铁载体抗生素。活性测试表明这些偶联分子能够被大肠杆菌和绿脓杆菌等革兰氏阴性菌铁转运系统识别并转运，有进一步研究和开发潜力。

现在大多数偶联物利用了常规的诸如酰胺键、酯键、铜催化的叠氮与炔的Click反应或硫醇与马来酰亚胺的加成等连接方式作为连接臂。β-内酰胺类抗生素和氟喹诺酮类抗生素制备的偶联物不需要断开连接臂仍能发挥抗菌活性，但大多数抗生素由于作用位点空间有限或很保守，必须从连接臂上释放出来。因此探究和开发可断开式连接臂是非常有必要的。

铁载体抗生素在临床应用方面的开发也取得了一定的成果，辉瑞、诺华、默克、巴塞利亚和百时美施贵宝等公司都开展了铁载体抗生素的研究项目。1987年，百时美施贵宝制药研究所开发了第一个临床候选铁载体抗生素，即吡拉莫南(Pirazmonam)，这是将铁载体与β-内酰胺类抗生素偶联的例子。随后BAL30072，MC-1和S-649266(Cefiderocol)临床研究相继被报道。这些临床分子对多药耐药的革兰氏阴性病原菌，如绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等均有显著活性。现在Cefiderocol正处于临床三期研究阶段，预期用于治疗成人的尿路感染。

多药耐药菌甚至“超级细菌”的不断出现使得细菌感染对人类生命健康构成了新的威胁，科学家亟需开发新型抗生素以抵御日益严峻的细菌耐药问题。铁载体靶向输送抗生素是一个非常有前景的抗生素开发策略，它是将铁载体与现有抗生素进行偶联，偶联物被铁转运系统识别并运送，最终达到抑制或杀死进细菌的目的。同时，人工合成铁载体-抗生素偶联物弥补了天然的铁载体抗生素短缺的现状，有非常大的临床开发前景。

现有人工合成的铁载体抗生素多是以铁载体与抗生素进行偶联，如果能实现将铁载体与一些本来不具有抗菌活性的抗癌药物等进行偶联，并将其用于抗生素开发，可以大大拓宽该领域的研究思路，为临床提供更多的候选药物。

甲氨蝶呤(MTX)是一种高效抗肿瘤药物，作用靶点是二氢叶酸还原酶。二氢叶酸还原酶催化二氢叶酸还原为四氢叶酸，四氢叶酸是合成胸腺嘧啶、嘌呤和某些氨基酸的重要原料。甲氨蝶呤竞争性的抑制二氢叶酸还原酶，阻断四氢叶酸的合成，最终使核酸合成受阻，从而抑制肿瘤生长。人和动物等真核生物以及细菌等原核生物都有二氢叶酸还原酶存在，而且均可作为药物作用靶点。甲氨蝶呤除具有抗肿瘤活性外，也有一定的抗菌活性，其中对肠球菌和肺炎链球菌的MIC值分别是4μM和0.5μM，但由于其对人体正常细胞的毒性太大不能作为抗菌试剂来使用。

铁载体的识别和转运系统只存在于细菌等微生物中，而在哺乳动物中是不存在的。因此，甲氨蝶呤与铁载体偶联有望克服甲氨蝶呤对正常细胞的毒性问题，并通过细菌高效的铁转运系统提高其抗菌活性。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种偶联化合物，其为式(I)所示化合物或式(I) 所示化合物的立体异构体、互变异构体、同系物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药，

其中，A为连接基团，B为二氢叶酸还原酶抑制剂。

根据本发明的实施例，上述偶联化合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述偶联化合物被氕取代或氘取代。

根据本发明的实施例，所述连接基团包括选自烷烃，烯烃，炔烃，芳香烃，含杂原子的烷烃、烯烃、炔烃、芳香烃，氨基酸，酮，脂，酰胺，磺酰胺，脲，烯胺的至少之一。

根据本发明的实施例，所述二氢叶酸还原酶抑制剂包括选自甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物、甲氧苄啶、甲氧苄啶衍生物的至少之一。

根据本发明的实施例，所述甲氨蝶呤衍生物具有如下所示结构，

根据本发明的实施例，甲氧苄啶衍生物具有如下所示结构，

根据本发明的实施例，其为式(II)～(VII)所示化合物或式(II)～(VII)所示化合物的立体异构体、互变异构体、同系物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药，

根据本发明的实施例，所述的连接基团进一步连接有芳香环化合物、烷烃环化合物和杂环化合物的一种或几种。

根据本发明的实施例，所述的芳香环化合物为任选取代的苯、苯多酚、苯氨、苯多氨、卤代苯、苯羟酸、苯多羟酸、蒽、

根据本发明的实施例，所述环烷烃化合物为任选取代的环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷或环庚烷。

根据本发明的实施例，所述的杂环化合物为任选取代的呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、咪唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚、喹啉、蝶啶、吖啶、环氧乙烷、环硫乙烷、吖丙啶、β-丙内脂、β-丙内酰胺、顺丁烯二酸酐、γ-丁内脂、己内酰胺、氧杂

根据本发明的实施例，所述的氨基酸链为天然和/或非天然氨基酸，任选地，所述连接基团为单个氨基酸或单个氨基酸的重复链或不同氨基酸的组合链。

根据本发明的实施例，所述烷烃或含杂原子的烷烃为C2～C30烷烃或杂环烷烃。

根据本发明的实施例，所述连接基团通过酰胺键，酯键，醚键，磺酰胺键，碳碳键或碳硫键与

根据本发明的实施例，所述连接基团具有如下所示结构：

在本发明的第二方面，本发明提出了一种偶联化合物，其为如下所示化合物或所示化合物的立体异构体、互变异构体、同系物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药，

在本发明的第三方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述偶联化合物。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。

在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述偶联化合物或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制致病菌。

根据本发明的实施例，所述致病菌包括选自葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、无芽胞厌氧菌、肉毒杆菌、沙门氏菌的至少之一。

根据本发明的实施例，所述球菌为肺炎链球菌。发明人发现，根据本发明实施例的化合物对肺炎链球菌的抑制效果显著。

本发明可以人工对铁载体-抗生素偶联物进行合成，能够拓展抗生素开发途径，为临床提供更多的候选药物分子。使如甲氨蝶呤活性有了显著提高，毒性也大大的下降，克服甲氨蝶呤对正常细胞的毒性问题，并通过细菌高效的铁转运系统提高其抗菌活性。人工铁载体抗生素借鉴了天然铁载体抗生素模板结构，通过细菌特有的高效主动铁转运系统进行药物输送，发挥抗菌作用。并将其用于抗生素开发，可以大大拓宽该领域的研究思路，为临床提供更多的候选药物。人工合成铁载体-抗生素偶联物弥补了天然的铁载体抗生素短缺的现状，有非常大的临床开发前景。

定义和一般术语

现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

除非另外说明，应当应用本文所使用得下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考"Organic Chemistry",Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和 "March's Advanced Organic Chemistry”by Michael B.Smith and Jerry March,John Wiley& Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。

本发明所使用的术语“受试对象”是指动物。典型地所述动物是哺乳动物。受试对象，例如也指灵长类动物(例如人类，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，所述受试对象是灵长类动物。在其他实施方案中，所述受试对象是人。

本发明所使用的术语“患者”是指人(包括成人和儿童)或者其他动物。在一些实施方案中，“患者”是指人。

术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几何异构体(顺 /反)异构体、阻转异构体，等等。

“手性”是具有与其镜像不能重叠性质的分子；而“非手性”是指与其镜像可以重叠的分子。

“对映异构体”是指一个化合物的两个不能重叠但互成镜像关系的异构体。

“非对映异构体”是指有两个或多个手性中性并且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体混合物可通过高分辨分析操作如电泳和色谱，例如HPLC来分离。

本发明所使用的立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；andEliel，E.and Wilen， S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。

许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子关于其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)是用于指定化合物所致平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。一种具体的立体异构体是对映异构体，这种异构体的混合物称作对映异构体混合物。对映异构体的 50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或过程中没有立体选择性或立体特异性时，可出现这种情况。

本发明公开化合物的任何不对称原子(例如，碳等)都可以以外消旋或对映体富集的形式存在，例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型形式存在。在某些实施方案中，各不对称原子在(R)- 或(S)-构型方面具有至少50％对映体过量，至少60％对映体过量，至少70％对映体过量，至少80％对映体过量，至少90％对映体过量，至少95％对映体过量，或至少99％对映体过量。

依据起始物料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物，例如外消旋体和非对应异构体混合物(这取决于不对称碳原子的数量)的形式存在。光学活性的(R)-或(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。如果化合物含有一个双键，取代基可能为E或Z构型；如果化合物中含有二取代的环烷基，环烷基的取代基可能有顺式或反式构型。

所得的任何立体异构体的混合物可以依据组分物理化学性质上的差异被分离成纯的或基本纯的几何异构体，对映异构体，非对映异构体，例如，通过色谱法和/或分步结晶法。

可以用已知的方法将任何所得终产物或中间体的外消旋体通过本领域技术人员熟悉的方法拆分成光学对映体，如，通过对获得的其非对映异构的盐进行分离。外消旋的产物也可以通过手性色谱来分离，如，使用手性吸附剂的高效液相色谱(HPLC)。特别地，对映异构体可以通过不对称合成制备，例如，可参考Jacques,et al.,Enantiomers,Racematesand Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Principles of AsymmetricSynthesis(2

术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(lowenergy barrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子转移互变异构体 (prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体(valence tautomer)包括通过一些成键电子的重组来进行的互相转化。酮-烯醇互变异构的具体实例是戊烷-2,4-二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的互变。互变异构的另一个实例是酚-酮互变异构。酚-酮互变异构的一个具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1H)-酮互变异构体的互变。除非另外指出，本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。

像本发明所描述的，本发明的化合物可以任选地被一个或多个取代基所取代，如上面的通式化合物，或者像实施例里面特殊的例子，子类，和本发明所包含的一类化合物。

一般而言，术语“取代的”表示所给结构中的一个或多个可被取代的氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个取代的基团可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不只一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。

术语“未取代的”，表示指定基团不带有取代基。

术语“任选”或者“任选地”意味着随后所描述的事件或者环境可以但不必发生，该说明包括该事情或者环境发生或者不发生的场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情景和杂环基团不被烷基取代的情景。

术语“任选地被……所取代”，可以与术语“未取代或被……所取代”交换使用，即所述结构是未取代的或者被一个或多个本发明所述的取代基取代，本发明所述的取代基包括，但不限于D、F、Cl、Br、I、CN、N

另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本发明中所采用的描述方式“各……独立地为”与“……各自独立地为”和“……独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。

在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C

在本发明的各部分，描述了连接取代基。当该结构清楚地需要连接基团时，针对该基团所列举的马库什变量应理解为连接基团。例如，如果该结构需要连接基团并且针对该变量的马库什基团定义列举了“烷基”或“芳基”，则应该理解，该“烷基”或“芳基”分别代表连接的亚烷基基团或亚芳基基团。

本发明使用的术语“烷基”或“烷基基团”，表示含有1至20个碳原子，饱和的直链或支链一价烃基基团，其中，所述烷基基团可以任选地被一个或多个本发明描述的取代基所取代。除非另外详细说明，烷基基团含有1-20个碳原子。在一些实施方案中，烷基基团含有1-12个碳原子；在另一些实施方案中，烷基基团含有1-6个碳原子；在又一些实施方案中，烷基基团含有1-4个碳原子；还在一些实施方案中，烷基基团含有1-3个碳原子。所述烷基基团可以任选地被一个或多个本发明描述的取代基所取代。

烷基基团的实例包含，但并不限于，甲基(Me、-CH

术语“亚烷基”表示从饱和的直链或支链烃基中去掉两个或多个氢原子所得到的饱和的二价或多价烃基基团。除非另外详细说明，亚烷基基团含有1-12个碳原子。在一些实施方案中，亚烷基基团含有1-6个碳原子；在另一些实施方案中，亚烷基基团含有1-4个碳原子；在另一些实施方案中，亚烷基基团含有0-4个碳原子；还在一些实施方案中，亚烷基基团含有0-3个碳原子；还在另一些实施方案中，亚烷基基团含有1-3个碳原子。亚烷基含有0 个碳原子是指亚烷基不存在，其直接为一个单键。亚烷基的实例包括亚甲基(-CH

术语“烯基”表示含有2-12个碳原子的直链或支链一价烃基，其中至少有一个不饱和位点，即有一个碳-碳sp

术语“炔基”表示含有2-12个碳原子的直链或支链一价烃基，其中至少有一个不饱和位点，即有一个碳-碳sp三键，其中，所述炔基基团可以任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。在一些实施方案中，炔基基团包含2-8个碳原子；在另一些实施方案中，炔基基团包含2-6个碳原子；在又一些实施方案中，炔基基团包含2-4个碳原子。炔基基团的实例包括，但并不限于，乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH

术语“烷氧基”表示烷基基团通过氧原子与分子其余部分相连，其中烷基基团具有如本发明所述的含义。除非另外详细说明，所述烷氧基基团含有1-12个碳原子。在一些实施方案中，烷氧基基团含有1-6个碳原子；在另一些实施方案中，烷氧基基团含有1-4个碳原子；在又一些实施方案中，烷氧基基团含有1-3个碳原子。所述烷氧基基团可以任选地被一个或多个本发明描述的取代基所取代。

烷氧基基团的实例包括，但并不限于，甲氧基(MeO、-OCH

术语“卤代烷基”、“卤代烯基”或“卤代烷氧基”表示烷基，烯基或烷氧基基团被一个或多个卤素原子所取代，这样的实例包含，但并不限于，二氟乙基(-CH

术语“羟基烷基”和“羟基烷氧基”表示烷基或烷氧基，视情况而定，被一个或多个羟基基团所取代，其中，“羟基烷基”与“羟烷基”可以交换使用，这样的实例包含，但并不限于，羟甲基(-CH

术语“碳环基”或“碳环”表示含有3-12个碳原子的，单价或多价的非芳香性的饱和或部分不饱和单环、双环或者三环体系。碳双环基包括螺碳双环基、稠合碳双环基和桥碳双环基，合适的碳环基基团包括，但并不限于，环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团的实例进一步包括，环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊基-1-烯基、1-环戊基-2-烯基、1-环戊基-3- 烯基、环己基、1-环己基-1-烯基、1-环己基-2-烯基、1-环己基-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基，等等。

术语“环烷基”表示含有3-12个碳原子的，单价或多价的饱和单环，双环或三环体系。在一些实施方案中，环烷基包含3-12个碳原子；在另一些实施方案中，环烷基包含3-8个碳原子；在另一些实施方案中，环烷基包含3-6个碳原子。在一些实施方案中，环烷基为包含7-12个碳原子的C

术语“杂环基”和“杂环”在此处可交换使用，都是指包含3-12个环原子的、单价或多价的、饱和或部分不饱和的、非芳香性的单环、双环或三环体系，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。除非另外说明，杂环基可以是碳基或氮基，且-CH

在一些实施方案中，杂环基为3-8个原子组成的杂环基，是指包含3-8个环原子的、单价或多价的、饱和或部分不饱和的、非芳香性的单环，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。除非另外说明，3-8个原子组成的杂环基可以是碳基或氮基，且-CH

在另一些实施方案中，杂环基为4-7个原子组成的杂环基，是指包含4-7个环原子的、单价或多价的、饱和或部分不饱和的、非芳香性的单环，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。除非另外说明，4-7个原子组成的杂环基可以是碳基或氮基，且-CH

在另一些实施方案中，杂环基为7-12个原子组成的杂环基，是指包含7-12个环原子的、单价或多价的、饱和或部分不饱和的螺杂双环基、稠合杂双环基或桥杂双环基，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。除非另外说明，7-12个原子组成的杂环基可以是碳基或氮基，且-CH

在又一些实施方案中，杂环基为7-12个原子组成的螺杂双环基，是指包含7-12个环原子的、单价或多价的、饱和或部分不饱和的、非芳香性的螺杂双环基，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。除非另外说明，7-12个原子组成的螺杂双环基可以是碳基或氮基，且-CH

还在另一些实施方案中，杂环基为8-11个原子组成的螺杂双环基，是指包含8-11个环原子的、单价或多价的、饱和或部分不饱和的、非芳香性的螺杂双环基，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。除非另外说明，8-11个原子组成的螺杂双环基可以是碳基或氮基，且-CH

还在又一些实施方案中，杂环基为7-12个原子组成的稠合杂双环基，是指包含7-12 个环原子的、单价或多价的、饱和或部分不饱和的、非芳香性的稠合杂双环基，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。除非另外说明，7-12个原子组成的稠合杂双环基可以是碳基或氮基，且-CH

术语“桥双环”、“桥环”、“桥双环基”和“桥环基”在此处可交换使用，都是指单价或多价的，饱和或部分不饱和的非芳香性的双环体系，所述环体系中的两个环共用两个原子和两个以上的单键。这样的体系可以包含独立的或共轭的不饱和体系，但其核心结构不包含芳香环或芳杂环(但是芳香族基团可以作为其上的取代基)。

术语“稠合双环”，“稠环”，“稠合双环基”和“稠环基”在此处可交换使用，都是指单价或多价的，饱和或部分不饱和但非芳香性的环体系，所述环体系中的两个环共用一个键。这样的体系可以包含独立的或共轭的不饱和体系，但其核心结构不包含芳香环或芳杂环(但是芳香族基团可以作为其上的取代基)。

术语“螺环基”，“螺环”，“螺双环基”或“螺双环”在此处可交换使用，是指单价或多价的，饱和或部分不饱和的环体系，其中一个环起源于另一个环上特定的环碳原子，并且两个环只共用一个原子。例如，像下面式a-1和式a-2所描述的，一个饱和的环体系(环B和B′)被称为“稠合双环”，而环A′和环B共享一个碳原子，被称为“螺环”或“螺双环”；环C′和环C则被称为“桥双环基”。稠合双环基、螺双环基和桥双环基中的每个环都可以是碳环基或杂环基，并且每个环任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。

术语“杂环烷基”是指含有3-12个环原子的单价或多价的饱和单环、双环或者三环体系，其中至少一个环原子选自氮、硫或氧原子。除非另外说明，杂环烷基可以是碳基或氮基，且-CH

在一些实施方案中，杂环烷基为7-12个原子组成的杂环烷基，是指含有7-12个环原子的，单价或多价的，饱和的螺杂双环烷基、稠合杂双环烷基或桥杂双环烷基，其中至少一个环原子选自氮、硫或氧原子。除非另外说明，杂环烷基可以是碳基或氮基，且-CH

在一些实施方案中，杂环烷基为4-7个原子组成的杂环烷基，是指含有4-7个环原子的，单价或多价的，饱和的杂环基，其中至少一个环原子选自氮、硫或氧原子。除非另外说明，杂环烷基可以是碳基或氮基，且-CH

在另一些实施方案中，杂环烷基为7-12个原子组成的螺杂双环烷基，是指含有7-12 个环原子的、单价或多价的、饱和的螺杂双环烷基，其中至少一个环原子选自氮、硫或氧原子。除非另外说明，杂环烷基可以是碳基或氮基，且-CH

在另一些实施方案中，杂环烷基为7-12个原子组成的稠合杂双环烷基，是指含有7-12 个环原子的、单价或多价的、饱和的稠合杂双环烷基，其中至少一个环原子选自氮、硫或氧原子。除非另外说明，杂环烷基可以是碳基或氮基，且-CH

在另一些实施方案中，杂环烷基为8-10个原子组成的稠合杂双环烷基，是指含有8-10 个环原子的，单价或多价的，饱和的稠合杂双环烷基，其中至少一个环原子选自氮、硫或氧原子。除非另外说明，8-10个原子组成的稠合杂双环烷基可以是碳基或氮基，且-CH

术语“n个原子组成的”，其中n是整数，典型地描述分子中成环原子的数目，在所述分子中成环原子的数目是n。例如，哌啶基是6个原子组成的杂环烷基，而1,2,3,4-四氢萘基是10个原子组成的碳环基基团。

在本发明中所使用的术语“不饱和的”表示基团中含有一个或多个不饱和度。

术语“杂原子”是指O、S、N、P和Si，包括N、S和P任何氧化态的形式；伯、仲、叔胺和季铵盐的形式；或者杂环中氮原子上的氢被取代的形式，例如，N(像3,4-二氢-2H- 吡咯基中的N)，NH(像吡咯烷基中的NH)或NR(像N-取代的吡咯烷基中的NR)。

术语“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。

术语“叠氮基”或“N

术语“芳基”表示含有6-14个环原子，或6-12个环原子，或6-10个环原子的单环、双环和三环的碳环体系，其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含3-7个原子组成的环，且有一个或多个连接点与分子的其余部分相连。术语“芳基”可以和术语“芳香环”交换使用。芳基基团的实例可以包括苯基、萘基和蒽基。所述芳基基团可以独立任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。

术语“杂芳基”表示含有5-12个环原子，或5-10个环原子，或5-6个环原子的单环、双环和三环体系，其中至少一个环体系是芳香族的，且至少一个芳香环体系包含一个或多个杂原子，其中每一个环体系包含5-7个原子组成的环，且有一个或多个连接点与分子其余部分相连。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳环”或“杂芳族化合物”交换使用。在一些实施方案中，杂芳基为包含1、2、3或4个独立选自O、S和N的杂原子的5-12个原子组成的杂芳基。在另一些实施方案中，杂芳基为包含1、2、3或4个独立选自O、S和N的杂原子的5-10个原子组成的杂芳基。还在一些实施方案中，杂芳基为包含1、2、3或4个独立选自 O、S和N的杂原子的5-6个原子组成的杂芳基。所述杂芳基基团任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。

5-12个原子组成的杂芳基基团的实例包括，但绝不限于下面的这些双环杂芳基：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基(如2-吲哚基,3-吲哚基,4-吲哚基,5-吲哚基,6- 吲哚基,7-吲哚基)、嘌呤基、喹啉基(如2-喹啉基，3-喹啉基，4-喹啉基)、异喹啉基(如1- 异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基)、吲唑基(如3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、6-吲唑基、7-吲唑基)、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、吡唑并[1,5-a]嘧啶基、咪唑并[1,2-b]哒嗪基、[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪基、 [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶基、[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶基，等等。5-12个原子组成的杂芳基基团还包括5-6个原子组成的单环杂芳基基团，其实例包括，但并不限于以下的单环，呋喃基(如2-呋喃基、3-呋喃基)、咪唑基(如1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基)、异噁唑基(如3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噁唑基(如2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、吡咯基(如1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、吡啶基(如2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、吡啶酮基、嘧啶基(如2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、嘧啶酮基、嘧啶二酮基、哒嗪基(如3-哒嗪基,4-哒嗪基)、吡嗪基(如2-吡嗪基、3-吡嗪基)、噻唑基(如 2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、四唑基(如5-四唑基)、三唑基(如2-三唑基和5-三唑基)、噻吩基(如2-噻吩基、3-噻吩基)、吡唑基(如1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基、5- 吡唑基)、吡唑啉酮基、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,3- 三唑基、1,2,3-硫代二唑基、1,3,4-硫代二唑基、1,2,5-硫代二唑基、吡嗪基和1,3,5-三嗪基等。

术语“唑基”是指包含至少两个杂原子且其中至少有一个为氮原子的，由5个或9个原子组成的杂芳环体系。唑基的实例包括，但并不限于吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、二唑基、三唑基、吲唑基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基和1H-苯并[d]咪唑基。

像本发明所描述的，取代基画一个键连接到中心的环上形成的环体系(如式b所示) 代表取代基在该环体系上所有可取代的位置择一取代。例如，式b代表取代基R可以择一取代D环上所有可以被取代的位置，如式c～式e所示。

像本发明所描述的，一个连接键连接到环的中心上形成的环体系(如式f所示，其中， X和X′独立地为CH

像本发明所描述的，两个连接键连接到环的中心上形成的环体系(如式i示)代表两个连接键均可以在环体系上任何可连接的位置与分子其余部分相连，并且连接的两端(端点Q和端点Q′)是可以相互交换的。式i代表G环上任何两个可能连接的位置均可与分子其余部分相连。

术语“保护基团”或“PG”是指一个取代基与其他官能团起反应的时候，通常用来阻断或保护特殊的功能性。例如，“氨基的保护基团”是指一个取代基与氨基基团相连来阻断或保护化合物中氨基的功能性，合适的氨基保护基团包括乙酰基，三氟乙酰基，甲酸叔丁酯(BOC,Boc)，苄氧羰基(CBZ,Cbz)和9-芴亚甲氧羰基(Fmoc)。相似地，“羟基保护基团”是指羟基的取代基用来阻断或保护羟基的功能性，合适的保护基团包括乙酰基和甲硅烷基。“羧基保护基团”是指羧基的取代基用来阻断或保护羧基的功能性，一般的羧基保护基包括 -CH

本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式(I)或式(II)所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类，脂肪族(C

“代谢产物”是指具体的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧化，还原，水解，酰氨化，脱酰氨作用，酯化，脱脂作用，酶裂解等等方法得到。相应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一段时间所产生的代谢产物。

本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1-19.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2- 羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐，等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N

本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸和氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。

如本发明所使用的术语“治疗”任何疾病或病症，在其中一些实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一些实施方案中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的身体参数。在另一些实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数) 或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的发作、发生或恶化。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

化合物3-4a的合成：如下方路线所示，铁载体片段2-81与化合物3-5在HATU和DIPEA 条件下缩合，得到化合物3-1a。化合物3-1a用三氟乙酸脱去Boc保护，再与叔丁酯保护的甲氨蝶呤3-8偶联，得到化合物3-3a。同样的用三氟乙酸脱去叔丁酯保护，再用K

1)化合物3-1a的制备

在氮气保护下，将化合物2-81(300mg，0.281mmol，1.0equiv)、化合物3-5(45mg，0.281mmol，1.0equiv)、HATU(160mg，0.421mmol，1.5equiv)溶于干燥的DMF(5mL)，置于-15℃的低温反应器中并搅拌，缓慢滴加DIPEA(93μL，0.562mmol，2.0equiv)。反应2小时后，用2M HCl溶液将反应液pH调至中性。油泵减压旋蒸除去溶剂，再溶于乙酸乙酯，分别用0.5MHCl溶液、饱和NaHCO

3-1a核磁数据：

2)化合物3-3a的制备

将化合物3-1a(200mg，0.165mmol，1.0equiv)溶于二氯甲烷(4mL)，置于0℃的低温反应器中并搅拌，然后缓慢加入三氟乙酸(0.8mL)。反应3小时后，加入甲苯(5mL)，旋干带出三氟乙酸，然后重复该操作三次。所得粗产品直接用于下一步反应，无需进一步纯化。

在氮气保护下，将上一步所得粗品、化合物3-8(151mg，0.165mmol，1.0equiv)、HATU(94mg，0.247mmol，1.5equiv)溶于干燥的DMF(4mL)，置于-15℃的低温反应器中并搅拌，缓慢滴加DIPEA(55μL，0.330mmol，2.0equiv)。反应2小时后，用2M HCl溶液将反应液pH调至中性。油泵减压旋蒸除去溶剂，再溶于乙酸乙酯，分别用0.5M HCl溶液、饱和NaHCO

4)化合物3-4a的制备

将化合物3-3a(100mg，0.059mmol，1.0equiv)溶于二氯甲烷(3mL)，置于0℃的低温反应器中并搅拌，然后缓慢加入三氟乙酸(1.5mL)和水(5μL，0.295mmol，5.0equiv)。反应3小时后，加入甲苯(5mL)，旋干带出三氟乙酸，然后重复该操作三次。所得粗产品直接用于下一步反应，无需进一步纯化。

将上一步制得粗产品溶于甲醇(3mL)，加入200mg/mL的碳酸钾水溶液(81μL)，然后每隔1小时，加等量等浓度的碳酸钾溶液，直至反应结束，过反相柱得到化合物3-4a。

3-4a核磁数据：

实例2-11

实例3-12的合成与实例1合成路线一样，分别可以合成3-4b,3-4c,3-4f,3-4j,3-4k,3-4l, 3-4n,3-4p,3-4r,3-4u.

实施例12

化合物3-4e的合成：如下方路线所示，铁载体片段2-81与化合物3-5在HATU和DIPEA 条件下缩合，得到化合物3-1e。化合物3-1e用三氟乙酸脱去Boc保护，再与Boc保护的丝氨酸3-7偶联，得到化合物3-2e。同样的用三氟乙酸脱去Boc保护，再与叔丁酯保护的甲氨蝶呤3-8缩合，得到化合物3-3e。最后先用三氟乙酸脱去叔丁酯保护，再用K

其中：

1)化合物3-1a的制备

在氮气保护下，将化合物2-81(300mg，0.281mmol，1.0equiv)、化合物3-5(45mg，0.281mmol，1.0equiv)、HATU(160mg，0.421mmol，1.5equiv)溶于干燥的DMF(5mL)，置于-15℃的低温反应器中并搅拌，缓慢滴加DIPEA(93μL，0.562mmol，2.0equiv)。反应2小时后，用2M HCl溶液将反应液pH调至中性。油泵减压旋蒸除去溶剂，再溶于乙酸乙酯，分别用0.5MHCl溶液、饱和NaHCO

2)化合物3-2e的制备

将化合物3-1e(200mg，0.165mmol，1.0equiv)溶于二氯甲烷(4mL)，置于0℃的低温反应器中并搅拌，然后缓慢加入三氟乙酸(0.8mL)。反应3小时后，加入甲苯(5mL)，旋干带出三氟乙酸，然后重复该操作三次。所得粗产品直接用于下一步反应，无需进一步纯化。

在氮气保护下，将上一步所得粗品、化合物3-7(34mg，0.165mmol，1.0equiv)、HATU(94mg，0.247mmol，1.5equiv)溶于干燥的DMF(4mL)，置于-15℃的低温反应器中并搅拌，缓慢滴加DIPEA(55μL，0.330mmol，2.0equiv)。反应2小时后，用2M HCl 溶液将反应液pH调至中性。油泵减压旋蒸除去溶剂，再溶于乙酸乙酯，分别用0.5M HCl 溶液、饱和NaHCO

3-2e核磁数据：

3)化合物3-3e的制备

将化合物3-2e(180mg，0.139mmol，1.0equiv)溶于二氯甲烷(4mL)，置于0℃的低温反应器中并搅拌，然后缓慢加入三氟乙酸(0.8mL)。反应3小时后，加入甲苯(5mL)，旋干带出三氟乙酸，然后重复该操作三次。所得粗产品直接用于下一步反应，无需进一步纯化。

在氮气保护下，将上一步所得粗品、化合物3-8(71mg，0.139mmol，1.0equiv)、HATU(79mg，0.208mmol，1.5equiv)溶于干燥的DMF(4mL)，置于-15℃的低温反应器中并搅拌，缓慢滴加DIPEA(46μL，0.278mmol，2.0equiv)。反应2小时后，用2M HCl 溶液将反应液pH调至中性。油泵减压旋蒸除去溶剂，直接硅胶拌样，经硅胶柱层析除去大部分副产物，然后再用硅胶制备板进一步纯化得到化合物3-3e。

4)化合物3-4e的制备

将化合物3-3e(100mg，0.059mmol，1.0equiv)溶于二氯甲烷(3mL)，置于0℃的低温反应器中并搅拌，然后缓慢加入三氟乙酸(1.5mL)和水(5μL，0.295mmol，5.0equiv)。反应3小时后，加入甲苯(5mL)，旋干带出三氟乙酸，然后重复该操作三次。所得粗产品直接用于下一步反应，无需进一步纯化。

将上一步制得粗产品溶于甲醇(3mL)，加入200mg/mL的碳酸钾水溶液(81μL)，然后每隔1小时，加等量等浓度的碳酸钾溶液，直至反应结束，过反相柱得到化合物3-4e。

3-4e核磁数据：

实例13-19

实例13-19的合成与实例12合成路线一样，分别可以合成3-4h,3-4g,3-4i,3-4m,3-4s, 3-4q,3-4t.

实施例20

化合物3-4d的合成：如下方路线所示，

将另一分子谷氨酸叔丁酯接到甲氨蝶呤γ位羧基上，所得化合物3-11与接了乙二胺的铁载体片段3-10偶联，得到化合物3-3d。最后用同样的条件脱保护基得到目标产物3-4d。

3-4d核磁数据：

实施例21

按照实例20的合成策略可以合成3-4o.

实施例22化合物对肺炎链球菌抑制活性检测

最小抑菌浓度(MIC)测定参照美国临床和实验室标准协会(CLSIM07)标准执行。对肺炎链球菌的MIC测定采用微量肉汤稀释法进行：首先将待测化合物溶于水配制成高浓度母液，再对化合物母液依次进行2倍梯度稀释，共10次，配制成11份10×工作溶液；然后将化合物梯度稀释液转移至96-孔圆底板，第1-11孔依次含有10μL上述配制的10×工作溶液，第12孔加入10μL的水作为溶剂对照。取MH肉汤II(加阳离子调节)培养基，按照1:20加入马血，按照每5mL培养基加80μL 2,2-联吡啶(1mg/mL)，挑取新鲜单克隆菌株于灭菌生理盐水制成菌悬液，调制浓度为0.5麦氏浊度，将菌悬液用上述MH(II)液体培养基按照1:200进行稀释，然后在上述制备的含药96孔板中依次加入90μL菌悬液。将已接种的96-孔板置于二氧化碳培养箱(37℃，5％CO

本申请化合物对临床肺炎链球菌的活性，并分别与环丙沙星、万古霉素和甲氨蝶呤作了对比，具体结果如表1所示。

表1：化合物对临床肺炎链球菌活性对比

上表显示，化合物对临床肺炎链球菌均有较好的抑制活性。

实施例23化合物的毒性测试

细胞毒性测试：

细胞毒性测试按照MTT比色法进行。取对数期细胞，按每孔5×10^3个细胞接种于96孔板，然后在5％CO

化合物分别测试了人正常肝细胞(L02)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人肾上皮细胞(293T)的半数抑制浓度IC

表2：化合物的细胞毒性数据

从上表中数据可以看出，铁载体-甲氨蝶呤偶联物与甲氨蝶呤相比对人正常肝细胞、人脐静脉内皮细胞和人肾上皮细胞的毒性显著降低。化合物3-4b、3-4g和3-4h毒性最小。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。