一种定量检测Lp-PLA2含量的试剂盒

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种定量检测Lp-PLA2含量的试剂盒。

背景技术

脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)是磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)超家族中的一员，由441个氨基酸残基组成，相对分子量为45.4kD。PLA2是一类能水解磷脂甘油支架Sn-2位上的短链酰基的酶族。根据存在的部位、底物特异性、辅助因子的需求和生理学作用等，PLA2主要分为分泌型(sPLA2)、胞质型(cPLA2)和非钙离子依赖型(iPLA2)、血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)、溶酶体型和脂肪特异型6种。Lp-PLA2属于血小板活化因子乙酰水解酶，不需要钙离子维持其催化活性，是丝氨酸依赖的磷脂酶，主要作用于氧化磷脂而不是在Sn-2带有长链脂肪酸的未氧化磷脂。Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节，人循环中的Lp-PLA2以与脂蛋白颗粒结合的形式存在，其中2/3与LDL结合，1/3与HDL、VLDL结合。Lp-PLA2作为一种新的炎性反应标志物，在动脉粥样硬化的几个主要阶段中均起作用。

Lp-PLA2的测定方法很多，主要分为两大类：酶法和质量法。酶法生化平台检测血清/血浆中Lp-PLA2的酶活性；质量法检测血清/血浆中Lp-PLA2的含量。目前检测方法有影像学检查方法、生化检查方法、免疫学检查方法，免疫学检查方法包括发光免疫测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金层析法等。现有进行Lp-PLA2的检测方法，各有优缺点，具体描述如下：

影像学检查：冠状动脉造影及血管内成像技术是目前冠状动脉粥样硬化疾病诊断的“金标准”，可以明确冠状动脉有无狭窄、狭窄的部位、程度、范围等，并可据此指导进一步治疗。但是血管造影对患者有一定的创伤，存在患者不愿使用该方法，并且有部分患者不适合进行该检查(对造影剂过敏等)，因此影响学检查的应用存在一定的局限性。

生化检查：目前进行生化检查主要是测定酶活。适用于全自动生化分析仪，能高通量检测，且定量准确，批间批内差小，重复性好。但是易受环境干扰。

免疫学检查：免疫学检查利用抗原抗体特异性反应。主要检查方法有化学发光法、ELISA、胶体金、层析法等。其中化学发光以上转发光免疫分析为代表，具有操作简单、结果稳定、重复性好等特点，但是通量小。ELISA操作略显复杂，影响因素多，但作为高通量检测，可满足大样本检测需求。胶体金、免疫层析法标本用量少，简便快速，适合于Lp-PLA2的床边检测。但是对于定量测定则灵敏度很差。

基于上述检测方法的不足之处，有必要提供一种自动化程度高、通量大，并且在灵敏度、特异性、准确性上符合临床需求的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种定量检测Lp-PLA2含量的试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确性好、高通量等优点，适用于半自动或全自动检测系统，具有较高的使用价值，适于推广应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种定量检测Lp-PLA2含量的试剂盒，包括磁微粒混悬液、样品稀释液、酶结合物、校准品；

样品稀释液的配方为：牛血清白蛋白10～30g、Proclin300 0.1～10mL、Bronidox0.01～10g、CHAPS 1～20g、Tris-NaCl缓冲液1L；

磁微粒混悬液的配方为：Lp-PLA2抗体-磁微粒、CHAPS、Tris-NaCl缓冲液；

酶结合物的配方为：生物酶标记的Lp-PLA2抗体、牛血清白蛋白、Proclin300、Bronidox、Tris-NaCl缓冲液。

本发明公开了一种检测血清中脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)含量的检测方法。该方法以磁性微球为载体，通过与特异的抗Lp-PLA2抗体的定向结合，捕获血清中Lp-PLA2，用HRP标记的特异性抗体实现抗体-抗原-抗体(HRP)夹心复合物，通过HPR催化反应收集光信号，光信号的强弱与血清中Lp-PLA2的含量成正比。从而实现动脉粥样硬化的辅助诊断，指导临床用药。本发明所用表面活性剂为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)，分子式为C

作为优选，样品稀释液的配方为：牛血清白蛋白15～25g、Proclin300 0.5～1.5mL、Bronidox 0.1～0.3g、CHAPS 5～15g、Tris-NaCl缓冲液1L。

优选地，样品稀释液的配方为：牛血清白蛋白20g、Proclin300 1mL、Bronidox0.2g、CHAPS 10g、Tris-NaCl缓冲液1L。

作为优选，生物酶标记的Lp-PLA2抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的Lp-PLA2抗体。

作为优选，磁微粒混悬液的配方为：Lp-PLA2抗体-磁微粒20～40mg、CHAPS 1～15g、Tris-NaCl缓冲液1L。

优选地，磁微粒混悬液的配方为：Lp-PLA2抗体-磁微粒32mg、CHAPS 10g、Tris-NaCl缓冲液1L。

作为优选，酶结合物的配方为：生物酶标记的Lp-PLA2抗体0.2～2g、牛血清白蛋白10～30g、Proclin300 0.1～10mL、Bronidox 0.01～10g、Tris-NaCl缓冲液1L。

作为优选，Tris-NaCl缓冲液的浓度为0.4～0.6M，pH7.4±0.1。

优选地，Tris-NaCl缓冲液的浓度为0.5M，pH7.4±0.02。

作为优选，校准品的配方为：Lp-PLA2抗体、含有1w/v％～2w/v％酪蛋白的PBS缓冲液。

优选地，校准品的配方为：Lp-PLA2抗体、含有1.5w/v％酪蛋白的PBS缓冲液。

作为优选，校准品中Lp-PLA2抗体的浓度为0～1000ng/mL范围内的一系列浓度。

在本发明提供的具体实施例中，校准品中Lp-PLA2抗体的浓度为0、15、50、150、300、450ng/mL一系列浓度。

作为优选，试剂盒还包括阴性质控品和/或阳性质控品。

作为优选，阴性质控品的配方为：Lp-PLA2抗体、含有1w/v％～2w/v％酪蛋白的PBS缓冲液；阴性质控品中Lp-PLA2抗体浓度＜170ng/mL。

作为优选，阳性质控品的配方为：Lp-PLA2抗体、含有1w/v％～2w/v％酪蛋白的PBS缓冲液；阳性质控品中Lp-PLA2抗体浓度＞175ng/mL。

作为优选，PBS缓冲液的浓度为0.005～0.02M，pH7.4±0.1。

优选地，PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH7.4±0.02。

本发明提供了一种定量检测Lp-PLA2含量的试剂盒。该试剂盒包括磁微粒混悬液、样品稀释液、酶结合物、校准品；样品稀释液的配方为：牛血清白蛋白10～30g、Proclin3000.1～10mL、Bronidox 0.01～10g、CHAPS 1～20g、Tris-NaCl缓冲液1L；磁微粒混悬液的配方为：Lp-PLA2抗体-磁微粒、CHAPS、Tris-NaCl缓冲液；酶结合物的配方为：生物酶标记的Lp-PLA2抗体、牛血清白蛋白、Proclin300、Bronidox、Tris-NaCl缓冲液。本发明具有的技术效果为：

1、本发明所用表面活性剂CHAPS。在反应体系的样品稀释液中加入表面活性剂CHAPS，相比其他表面活性剂，线性关系和稳定性良好，检测结果与酶法一致性高，确保了检测血清中真实Lp-PLA2水平。

2、本发明的优点在于操作简便，能在较短时间内实现对Lp-PLA2的定量检测。

3、本发明制备的试剂盒将化学发光技术与磁微粒技术相结合，具有灵敏度高、特异性强、准确性好、高通量等优点，适用于半自动或全自动检测系统，具有较高的使用价值，适于推广应用。

附图说明

图1示实施例1检测试剂盒的线性关系。

具体实施方式

本发明公开了一种定量检测Lp-PLA2含量的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

Lp-PLA2：脂蛋白相关磷脂酶A2；

PLA2：磷脂酶A2；

AS：动脉粥样硬化；

HRP：辣根过氧化物酶；

ELISA：酶联免疫吸附试验。

本发明公开了一种定量检测血清中Lp-PLA2含量的试剂盒，包括连接有特异性Lp-PLA2抗体的磁微粒试剂，含有HRP标记的Lp-PLA2抗体的保存缓冲液，样本稀释液，含Lp-PLA2的校准品，含Lp-PLA2的阴性质控品和阳性质控品；所述磁微粒的表面含有羧基基团，所述样本稀释液含有表面活性剂。本发明的优点在于检测便捷，能在较短时间内实现对Lp-PLA2的定量检测，从而辅助诊断动脉粥样硬化，指导医生临床用药。本发明制备的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确性好、高通量等优点，适用于半自动或全自动检测系统；本发明试剂盒将化学发光技术与磁微粒技术相结合，在临床上具有较高的使用价值，适于推广应用。

本发明以磁微粒为固相载体，可以使用发光板代替磁微粒作为固相载体，在不改变底物系统的前提下，实现对Lp-PLA2的检测；也可以使用酶标板代替磁微粒作为固相载体，以H

本发明提供的定量检测Lp-PLA2含量的试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本发明的制备方法，包含以下步骤：

一、磁微粒混悬液的制备：

选用JSR厂家MS160羧基磁珠(磁珠分散性好)。

取30mg磁珠，用pH7.4 0.01M的PBS缓冲液洗5次，去上清用活化剂(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺分别溶于pH5.00.5M的MES，配制后的浓度5-100mg/mL)室温活化1小时。用pH5.00.5M的MES洗3次，再加入Lp-PLA2特异性的鼠单抗，室温反应2小时。去上清，用乙醇胺溶液终止反应30分钟-2小时(终止提高反应效价)。去上清，封保液(pH7.40.5M Tris-NaCl，含有0.01％CHAPS)封闭4次。去上清，用封保液重悬，于2～8℃保存。

二、样品稀释液：(pH7.4 0.5M Tris-NaCl，含有0.1％--2％CHAPS)

将1000ml纯化水、6.05g三羟甲基氨基甲烷、8.5g氯化钠加入容器中充分搅拌溶解；浓盐酸调溶液pH值在7.40±0.02范围内；将20g牛血清白蛋白、1ml Proclin300、0.2gBronidox和1％CHAPS表面活性剂加入容器中，充分搅拌至完全溶解后，样本稀释液配制完毕，2～8℃保存待用。

三、酶结合物：(pH7.4 0.5M Tris-NaCl，含有特异性Lp-PLA2鼠单抗)

向酶结合物缓冲溶液(pH7.40.5M Tris-NaCl+2％BSA+1ml Proclin300+0.2gBronidox)中加入HRP标记的Lp-PLA2鼠单抗，酶标抗体的工作浓度为1:500-1:5000。

四、校准品：(采用冻干工艺)

用校准品稀释液(pH7.4 0.01M的PBS溶液，含1.5％酪蛋白)将Lp-PLA2抗原稀释至0、15、50、150、300、450ng/mL6个浓度点。配制好的校准品冻干，2～8℃保存。

五、阴性质控品

用校准品稀释液(pH7.4 0.01M的PBS溶液，含1.5％酪蛋白)将Lp-PLA2抗原稀释至浓度＜170ng/mL得到Lp-PLA2阴性质控品，冻干，2～8℃保存。

六、阳性质控品

用校准品稀释液(pH7.4 0.01M的PBS溶液，含1.5％酪蛋白)将Lp-PLA2抗原稀释至浓度＞175ng/mL得到Lp-PLA2阳性质控品，冻干，2～8℃保存。

七、反应模式

本发明采用双抗体夹心一步法检测血清中Lp-PLA2含量。具体步骤如下。

每瓶校准品、阴阳质控品分别加入1.0mL纯化水，待冻干品完全溶解后使用。准备测试样本(校准品、质控品或待测样本)并正确放置后，点击启动按钮进行定标程序或样本检测程序，仪器将执行以下操作：

1)将样本架传递到吸样位，将反应容器加载到加样位。

2)执行定标程序时，完成15μL校准品、20μL磁微粒混悬液、85μL样品稀释液、50μL酶结合物的分注。

3)执行样本检测程序时，完成15μL样本、20μL磁微粒混悬液、85μL样品稀释液、50μL酶结合物的分注。

4)对反应液进行混匀、温育，温育温度为37℃，温育时间为15分钟。

5)温育完成后，使用清洗液对反应液进行清洗分离。

6)完成50μL发光底物A液和50μL发光底物B液的分注。

7)对反应液进行混匀，检测发光强度。

选择适当的曲线拟合方式进行结果计算。本发明推荐采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为x轴，以校准品发光值的log值为y轴建立定标曲线，根据待测样本的发光值回算相应的浓度值。仪器自动操作系统可通过存储的定标曲线以及样本测试得到的发光值自动计算样本测试结果。

试验例1性能指标

1.检出能力：

空白限(LOB)：1.10ng/mL；

最低检出限(LOD)：5.00ng/mL；

功能灵敏度(FS)：10.00ng/mL。

2.线性范围：

将1份高浓度血清样本与1份低值血清样本按不同比例混合，在15.00-450.00ng/mL范围内制备5份浓度的样本(样本2-6)，另外还设置了阴性对照(样本1)，每一个浓度的样本重复检测2次，在此范围内线性相关系数不低于0.9900。

表1线性范围

3.测量范围：5.00-450.00ng/mL(由检出限和校准品最高浓度定义)。检测结果若低于检出限，仪器将报告结果＜5.00ng/mL，检测结果若高于测量范围上限，仪器将报告结果＞450.00ng/mL。

4.干扰：

当样本中Lp-PLA2浓度＞100.00ng/mL时，含有不超过以下浓度水平的内源性物质时检测结果的相对偏倚不超过10％。

表2内源性物质浓度

5.精密度：

表3精密度

6.回收率：

选择高值样本1份，按照1：9的比例分别加入到低值样本/基质样本中，制成回收样本，加入高值样本的体积不得超过总体积的10％。每个回收样本重复检测3次求均值，计算回收率。回收率应在85.0％～115.0％。

表4回收率

试验例2不同表面活性剂对试剂盒线性关系的影响

参照实施例1的检测试剂盒和检测方法，对比不同表面活性剂对试剂盒线性关系的影响。结果如下：

表5不同表面活性剂对试剂盒线性关系的影响

结论：样品稀释液中使用CHAPS，与活性厂家的相关性优于T-20、T-X100，其线性关系见图1。

试验例3不同表面活性剂对试剂盒稳定性的影响

参照实施例1的检测试剂盒和检测方法，对比不同表面活性剂对试剂盒稳定性的影响。结果如下：

表6不同表面活性剂对试剂盒稳定性的影响

结论：1、样品稀释液中T-X100/CHAPS稳定性满足要求，T-20稳定性不满足要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。