一种滇丹参中酚酸类活性成分的高效制备方法

技术领域

本发明涉及一种滇丹参中酚酸类活性成分的高效制备方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

迷迭香酸是一种天然抗氧化剂，具有较强的抗氧化活性，有助于防止自由基造成的细胞受损，因此降低了癌症和动脉硬化的风险。迷迭香酸具有较强的抗炎活性，同时迷迭香酸还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的活性。咖啡酸是一种有机酸，可在化妆品中安全使用，有较广泛的抑菌和抗病毒活性，同时具有吸收紫外线的能力；低浓度的咖啡酸就可以作为抑制皮肤型发用染料的助剂，有利于增强色泽的强度。原儿茶醛不仅对急性心肌缺血缺氧所致的心肌损伤具有明显保护作用，而且具有扩张心脑血管的作用，还具有改善微循环、降低血液粘度、抗菌抗炎、钙拮抗等作用。

据研究表明，滇丹参同时含有上述三种化合物，但是发明人研究发现，由于滇丹参中化合物成分较多，导致目前提取纯化上述三种化合物的方法存在多次色谱分离纯化、操作复杂等问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种滇丹参中酚酸类活性成分的高效制备方法，该方法能够更简便的对滇丹参中的迷迭香酸、咖啡酸、原儿茶醛进行分离提取。

为了减少色谱分离次数，本发明采用pH区带逆流色谱(pH-ZRCCC)对滇丹参总酚酸提取物进行处理，然而，经过研究发现，由于滇丹参总酚酸提取物中含有大量丹酚酸类化合物，这类化合物与咖啡酰奎宁酸类化合物的极性将近，导致迷迭香酸、咖啡酸和原儿茶醛难以提取或提取的化合物纯度较低。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种用于提取滇丹参中迷迭香酸、咖啡酸和/或原儿茶醛的pH区带逆流色谱的溶剂系统，包括石油醚、乙酸乙酯、乙腈和水，其中，石油醚、乙酸乙酯、乙腈和水的体积比为1.46～1.54:2.46～2.54:1:4.6～5.4。

另一方面，一种滇丹参中酚酸类活性成分的高效制备方法，从滇丹参提取获得滇丹参总酚酸提取物，采用pH区带逆流色谱对滇丹参总酚酸提取物进行分离纯化获得迷迭香酸、咖啡酸和/或原儿茶醛；pH区带逆流色谱的溶剂系统为上述溶剂系统。

因而，本发明针对滇丹参总酚酸提取物的问题，改进了pH区带逆流色谱的溶剂系统，经过试验证实，当采用上述溶剂系统对滇丹参总酚酸提取物的pH区带逆流色谱分离纯化时，能够将迷迭香酸、咖啡酸和原儿茶醛分离提取，且提取的化合物的纯度均在96％以上。

本发明的有益效果为：

1.本发明采用石油醚、乙酸乙酯、乙腈和水作为pH区带逆流色谱的溶剂系统，能够将滇丹参中迷迭香酸、咖啡酸和原儿茶醛完全分离，分离效果好。

2.本发明提供的方法仅采用一次色谱分离即可对提取物中的迷迭香酸、咖啡酸和原儿茶醛进行提取，由于pH区带逆流色谱是以液体作为固定相，所以避免了固体固定相对样品的不可逆吸附，大大提高了样品的回收率，提高了纯组分的得率。因而无需后续纯化处理即可获得高纯度(96％以上)的迷迭香酸、咖啡酸和原儿茶醛，大大简化了操作步骤，方法简单，纯化成本较低。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中滇丹参总酚酸提取物与经pH-ZRCCC分离得到的纯组分的高效液相色谱(HPLC)分析图；

图2为本发明实施例中pH-ZRCCC的分离图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

迷迭香酸的化学结构式为

咖啡酸的化学结构式为

原儿茶醛的化学结构式为

鉴于现有色谱技术从滇丹参中提取迷迭香酸、咖啡酸、原儿茶醛需要采用多次色谱分离纯化的步骤，本发明提出了一种滇丹参中酚酸类活性成分的高效制备方法。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种用于提取滇丹参中迷迭香酸、咖啡酸和/或原儿茶醛的pH区带逆流色谱的溶剂系统，包括石油醚、乙酸乙酯、乙腈和水，其中，石油醚、乙酸乙酯、乙腈和水的体积比为1.46～1.54:2.46～2.54:1:4.6～5.4。

在一些实施例中，将石油醚、乙酸乙酯、乙腈和水混合均匀，静止分液，分液后的上相为固定相，分液后的下相作为流动相。

固定相需要进行酸化后使用，流动相需要进行碱化后使用，在一种或多种实施例中，固定相中添加三氟乙酸，流动相中添加氨水。固定相与流动相进行超声脱气处理后，分离提取效果更好。当固定相中三氟乙酸的浓度为9～11mM、流动相中氨水的浓度为29～31mM时，分离提取的效果更为优异。

本发明的另一种实施方式，提供了一种滇丹参中酚酸类活性成分的高效制备方法，从滇丹参提取获得滇丹参总酚酸提取物，采用pH区带逆流色谱对滇丹参总酚酸提取物进行分离纯化获得迷迭香酸、咖啡酸和/或原儿茶醛；pH区带逆流色谱的溶剂系统为上述溶剂系统。

本发明针对滇丹参总酚酸提取物，根据“相似相溶”原理，对pH区带逆流色谱溶剂系统的成分进行改进，使其在进行pH区带逆流色谱分离提取时，能够对迷迭香酸、咖啡酸和原儿茶醛一步分离提取，操作简便，提取的化合物纯度较高。

在一些实施例中，从滇丹参提取获得滇丹参总酚酸提取物的过程为：采用乙醇提取法对滇丹参进行提取，提取后的液体采用石油醚进行一次萃取，萃取后的水相调节pH至1.5～2.5，然后添加乙酸乙酯进行二次萃取，对二次萃取的乙酸乙酯相进行浓缩获得滇丹参总酚酸提取物。

本发明所述的一次萃取、二次萃取中的“一次”、“二次”仅表明不同的萃取过程，并不是对萃取次数的限定。

在一种或多种实施例中，将滇丹参加入乙醇水溶液，在65～75℃条件下进行回流提取，将提取液进行浓缩，再加水复溶，然后采用石油醚进行一次萃取。其中，乙醇水溶液的浓度55～65％体积分数。滇丹参与乙醇水溶液的料液比为1:7.5～8.5，kg：L。回流提取的次数为2～4次，每次回流提取的时间为1.5～2.5h。

在一种或多种实施例中，二次提取的次数为3～7次。

在一些实施例中，pH区带逆流色谱分离提取的过程为：将固定相输送至分离柱，将滇丹参总酚酸提取物的溶液注入分离柱，然后将流动相输送持续输送至分离柱进行分离提取。

在一种或多种实施例中，固定相输送至分离柱的流速为25～35mL/min。

在一种或多种实施例中，流动相的流速为1.5～2.5mL/min。收集馏分的时间为每次(瓶)收集6min。

在一些实施例中，pH区带逆流色谱分离提取中，紫外检测器的检测波长为252～256nm。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例中采用的试剂若未进行特殊说明，均为市售获得。滇丹参药材购于云南省新平县。

实施例

样品的提取与制备：

称取滇丹参药材3kg并粉碎，使用60％乙醇在70℃下回流提取3次，每次2h，料液比为1:8(w/v)。将提取液过滤，50℃下减压浓缩至约800mL，并用水复溶至1000mL。提取液使用等量石油醚萃取三次，弃去上层，在水相加入盐酸将提取液pH调至2，然后使用等量乙酸乙酯萃取5次。合并乙酸乙酯相，减压浓缩，得滇丹参总酚酸提取物136g。

两相溶剂系统与样品溶液的制备：

根据两相溶剂系统，将各溶剂按比例分别量取并依次加入到分液漏斗中。振荡后静置12h，分出上、下两相。上相作为固定相加入一定浓度的三氟乙酸，下相作为流动相加入一定浓度的氨水。将上、下两相超声脱气2min，作为pH-ZRCCC分离使用的溶剂系统。

将样品放入试管中，使用酸化后的上相溶液和等量未碱化的下相超声溶解，且总体积不超过20mL，制得pH-ZRCCC分离使用的样品溶液。

pH区带逆流色谱的分离

将上相溶液以30mL/min的流速泵入，直至充满分离柱，然后将样品溶液通过进样环注入分离柱，将分离柱调为正转800rpm，同时将下相溶液以2mL/min的流速泵入。将紫外检测器的检测波长调为254nm，以6min/瓶的间隔收集馏分，并使用pH计检测各瓶馏分的pH值。分离过程结束后，使用空气压缩机将柱内剩余液体吹入到量筒中，计算固定相的保留率。最后使用水和乙醇依次对分离柱进行清洗。

HPLC分析与结构鉴定

滇丹参总酚酸提取物与经pH-ZRCCC分离得到的纯组分的HPLC分析条件为CompassC18色谱柱(250×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈(A)–0.1％甲酸水溶液(B)：0–10min，14％A；10–20min，14％–17％A；20–35min，17％–30％A。流速1.0mL/min，检测波长280nm，进样量10μL。

pH-ZRCCC分离得到的纯组分使用HPLC-ESI-QTOF-MS和

HPLC分析结果

图1所示为滇丹参总酚酸提取物与经pH-ZRCCC分离得到的纯组分的HPLC分析图，在280nm下使用峰面积归一化法进行计算，化合物I-III在总酚酸粗提物中的峰面积比分别为5.5％(迷迭香酸)、1.29％(咖啡酸)、0.77％(原儿茶醛)。

两相溶剂系统的优化

首先使用乙酸乙酯–乙腈–水(4:1:5,v/v/v)作为分离溶剂系统，上相加入三氟乙酸(10mM)，下相加入氨水(10mM)对2g滇丹参总样进行分离，但化合物很难被洗脱出来，保留时间较长。考虑到滇丹参总酚酸中含有大量的丹酚酸类化合物，与咖啡酰奎宁酸类化合物相比极性稍低，因此根据“相似相溶”原理，将溶剂系统改为极性较低的石油醚–乙酸乙酯–乙腈–水(1.5:2.5:1:5,v/v/v/v)，同时增加下相氨水的浓度至30mM，上相加入三氟乙酸10mM，对2g样品进行分离。结合HPLC分析发现，迷迭香酸、咖啡酸和原儿茶醛在4h内被成功分离。随后逐渐增加进样量至4g，发现迷迭香酸、咖啡酸和原儿茶醛依旧得到了良好的分离效果，pH-ZRCCC分离图变化不大，如图2所示。经一次分离，从4g滇丹参酚酸粗提物中分离得到迷迭香酸55.6mg，咖啡酸69.0mg，原儿茶醛18.9mg，纯度分别为98.4％、96.1％和96.6％。

化合物的结构鉴定

根据ESI-MS、

迷迭香酸：准分子离子峰为m/z 359[M–H]

咖啡酸：准分子离子峰为m/z 179[M–H]

原儿茶醛：准分子离子峰为m/z 137[M–H]

本发明使用溶剂系统石油醚–乙酸乙酯–乙腈–水(1.5:2.5:1:5,v/v/v/v)(上相加入三氟乙酸(10mM)，下相加入氨水(30mM))从4g滇丹参总酚酸粗提物中分离得到55.6mg迷迭香酸、69.0mg咖啡酸以及18.9mg原儿茶醛，纯度均高于96％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。