一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法及应用

技术领域

本公开涉及细胞检测技术领域，具体提供一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法及应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

随着全球气候变暖和水环境变化，生长在河流、湖库底部基质上有害底栖蓝藻大量繁殖，底栖蓝藻水华不仅会危害水体自身的生态结构和功能，其分泌的大量藻毒素和气味物质进入水体严重影响供水水质。水华形成是藻类生物量在水体中逐渐增加的一个连续的、可预测的过程。开展河流、湖库水体底栖蓝藻水华的监测预警工作，有助于水环境保护及饮用水供应相关部门掌握底栖蓝藻种群的动态变化，主动地去处理水体中潜在的有毒蓝藻，有效防控地表水蓝藻水华暴发的风险，对保障河流、湖库水环境生态和保证饮用水水质安全具有重要意义。

由于底栖蓝藻通常是附着在底部沉积物或固体表面的丝状蓝藻，在生长的过程中互相缠绕形成团状，故对于底栖蓝藻样品应进行预处理解团后才能利用光学显微镜进行下一步的鉴定和计数。现存的底栖蓝藻藻垫解聚方法主要有机械研磨和温和超声。发明人发现，由于丝状底栖蓝藻在生长的过程中藻丝缠绕严重，这两种方法虽然能都使藻丝解聚，但是会造成藻丝断裂严重及藻细胞大量破损，严重影响底栖蓝藻鉴定和计数的准确性。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种有效解聚底栖蓝藻藻垫，进行观察的方法，不仅能够有助于后续光学显微镜的鉴定和计数，而且能够避免藻细胞大量破损从而影响光学显微镜的鉴定和计数准确性。

本公开一个或一些实施方式中，提供一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法，包括如下步骤：将底栖蓝藻垫粉碎，然后在高倍光学显微镜下观察藻丝形态。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法在除藻净化水源中的应用。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法在生物环境模拟中的应用。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法在藻类养殖中的应用。

上述技术方案中的一个或一些技术方案具有如下优点或有益效果：

1)本公开将底栖蓝藻藻垫粉碎，保留了蓝藻藻垫中长度较长的藻丝，避免了藻丝碎片化，在高倍显微镜下视野清晰，无碎片化藻丝干扰，便于观察藻丝形态和细胞形态。

2)本公开粉碎方式较为温和，基本避免了细胞破裂，破裂的细胞液体渗出，一方面影响视野观察，一方面导致细胞计数准确性较低。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为本公开实施例1的温和粉碎功率为150W时，不同粉碎时间与底栖蓝藻叶绿素a含量的关系柱状图；

图2为本公开实施例2的温和粉碎功率为200W时，不同粉碎时间与底栖蓝藻叶绿素a含量的关系柱状图；

图3为本公开实施例3的温和粉碎功率为250W时，不同粉碎时间与底栖蓝藻叶绿素a含量的关系柱状图；

图4为本公开实施例3的温和粉碎功率为250W时，不同粉碎时间下((a)0,(b)1s,(c)2s,(d)3s,(e)4s和(f)5s)藻丝形态显微镜照片；

图5为本公开对比例1的温和超声功率为20W时，不同超声时间与底栖蓝藻叶绿素a含量的关系柱状图；

图6为本公开对比例1的温和超声功率为20W时，不同超声时间下((a)0,(b)2s,(c)5s,(d)10s,(e)15s和(f)20s)藻丝形态显微镜照片；

图7为本公开对比例2的研磨次数与底栖蓝藻叶绿素a含量的关系柱状图；

图8为本公开对比例2的不同研磨次数下((a)0,(b)5次,(c)10次,(d)20次,(e)40次和(f)100次)藻丝形态显微镜照片。

具体实施方式

下面将对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本公开的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本公开的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本公开保护的范围。

为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种有效解聚底栖蓝藻藻垫，进行观察的方法，不仅能够有助于后续光学显微镜的鉴定和计数，而且能够避免藻细胞大量破损从而影响光学显微镜的鉴定和计数准确性。

藻泛指生长在水中的植物，亦包括某些水生的高等植物。藻类是隐花植物的一大类，无根、茎、叶等部分的区别，有叶绿素可以自己制造养料，种类很多，海水和淡水里都有，极少数可生活在陆地的阴湿地方。常见藻类如海藻，小球藻。

底栖藻垫(benthic algae,periphyton)是指生长于浸没在水中的基质上的藻类的统称，通常由多个藻类在生长过程中缠绕而成，现有技术中为实现在显微镜下对底栖藻垫进行观察，通常需要先将缠绕在一起的藻类进行解聚，解聚过程中务必会导致藻类破坏，影响藻类细胞的观察。

通常而言，同一种藻类中可能有多种不同细胞，用以实现不同的生理功能，如《一种鱼腥藻的超微结构》(王模善，北京大学生物系，1981)中公开了一种鱼腥草，该文作者观察到，该鱼腥藻每条藻丝上有数十个细胞，细胞分化成三种类型，即具有光合能力的营养细胞、异性胞和厚壁孢子，进而判断出了鱼腥草能量储存方式，光合作用方式等生理活动，这对于生物学而言，是非常有意义的研究。

然而，从该文描述“1979年秋，我们在北京圆明园的洼地积水处采集到一种蓝藻门植物—鱼腥藻”来看，该文作者采集到的样品应该是包含完整的藻丝，非常方便观察，因此可以获得上述宝贵的研究成果。

但对于底栖藻垫而言，底栖藻垫由多条藻丝缠绕而成，现有技术中通常经过机械研磨和温和超声进行解聚，但发明人在实验过程中发现，机械研磨及温和超声后处理的底栖藻垫，碎片较多，难以获得一条完整的藻丝，在观察过程中，观察到很多碎片化的藻丝及破损细胞，难以判断具体是哪一条藻丝的细胞，以及各个功能性细胞具体的分布方式，即难以判断一条藻丝的真正结构，也很难准确对藻丝进行种属鉴定。

此外，藻类在生长过程中，藻丝也随着藻类生长而变化，如《条斑紫菜壳抱子采苗前贝壳丝状体的显微观察》(朱建一、陆勤勤等，水产养殖[J]，2003)中对条斑紫菜壳贝壳丝状体进行了检查，发现藻丝有退化成营养藻丝的过程(图8)，这对于研究藻类生长过程，进而实现藻类养殖有着非常重要的意义。

对于底栖藻垫而言，底栖藻垫可能是多种不同类型的藻丝缠绕而成，若没有一条或多条完整的藻丝，则观察者视野中出现大量各个形态的藻丝碎片，难以真正根据藻丝分辨具体底栖藻垫的具体构成，这些都对研究造成了极大困难。

为此，发明人认为，如果能有一种方法，使底栖藻垫在解聚过程中，保留大量长度较长，完整度较高的藻丝，则能够大大方便观察者观察。

本公开一个或一些实施方式中，提供一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法，包括如下步骤：将底栖蓝藻垫适当粉碎，然后在高倍光学显微镜下观察藻丝形态。

所述粉碎专指使用刀片粉碎，由于刀片切割过程中，底栖藻垫中部分藻丝可以会从刀片与刀片间的缝隙穿过，因此保留了大量的长度较为完整的藻丝，相对于超声、研磨等针对整个藻垫碎片化处理的方式，粉碎的方式更适合高倍光学显微镜下的观察。

当然，应当理解的是，现有技术中针对游离藻类，可以很轻易的获取一条藻丝，然后利用光学显微镜直接观察细胞，但对于底栖蓝藻垫而言，则不适用，原因前述已经充分分析，在此不做赘述。

本公开的底栖蓝藻藻垫解聚方法不仅能够有助于后续光学显微镜鉴定和计数，而且能够避免藻丝大量断裂和藻细胞大量破损，保证后续底栖蓝藻鉴定和计数的准确性。

本公开所述的底栖蓝藻藻垫样品是指采集于自然界，包括河流、湖泊、水库等水体底部基质上，且含有蓝藻的藻垫。

优选的，使用粉碎仪进行粉碎；

优选的，所述粉碎仪包括粉碎室，所述粉碎室内固定有横向安装的粉碎刀片。

本公开所述的粉碎仪是指由不锈钢上盖和下体粉碎室构成，螺扣式封闭，通过直立式电机的高速运转带动横向安装的粉碎刀片，对样品进行撞击、剪切式粉碎，如小型粉碎机，具体的，本公开实施例所用为Target，手持式搅拌机，TARHB40S。

优选的，所述粉碎机为小型粉碎机；

优选的，粉碎功率为150～250W；

或，粉碎时间为1-5s。

优选的，所述高倍光学显微镜的倍数为100-400×，

优选的，目镜为10×，物镜为10×至40×。

优选的，还包括蓝藻鉴定过程，包括如下步骤：根据观察到的藻丝形态以及细胞形态，判断蓝藻种属。

优选的，还包括藻细胞计数过程，包括如下步骤：选择一定视野中的藻丝，将藻丝中不同细胞进行分类，对相同种类的细胞进行计数。

优选的，还包括制备玻片过程，包括如下步骤：将粉碎后藻类样品充分摇匀，用滴管取0.1mL样品至计数框中，盖上盖玻片，标本制成后，静止3～5min使藻体沉至框底，再进行镜检。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法在除藻净化水源中的应用。即研究藻垫中藻类的种类，细胞特点，然后制定合理的藻类清理方式。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法在藻类观察实验中的应用。即观察者可以选择不同时期的底栖蓝藻藻垫进行生理观察，所述观察包括但不限于，蓝藻优势种，蓝藻细胞形态特征。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法在藻类养殖中的应用。即研究藻类不同生长时期的细胞及藻丝特点，根据细胞及藻丝特点对应补充养分并创造合适的生长环境。

实施例1

本实施例提供一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法，包括如下步骤：

从山东某水库采集底栖蓝藻藻垫，此底栖蓝藻藻垫中主要有害蓝藻为席藻，将200mL藻垫样品加入小型粉碎仪中，粉碎仪功率为150W，粉碎不同时间(1、2、3、4、5s)后取出样品，然后测量样品叶绿素a含量变化和在高倍光学显微镜下观察藻丝形态变化情况。

本实施例及如下实施例中，叶绿素a测量步骤如下：

1、抽滤样品后滤膜放入冰箱冷藏24h(使滤膜水分蒸发)，取出滤膜放入离心管中，加少量碳酸镁粉末及5mL 90％丙酮，用玻璃棒碾磨后，静止5min后用离心机(4000r/min)离心10min,将上清液吸到10mL容量瓶中。

2、再加入3mL 90％丙酮，继续碾磨提取，离心10min,并将上清液吸到10mL容量瓶中，定容。

3、将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm和630nm波长的吸光度，并以90％丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。

4、计算方法

Chl-a(mg/m

V—水样体积：0.5L

V1—提取液定容后体积(mL)：10mL

δ—比色皿光程(cm)：1cm

实施例2

本实施例提供一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法，包括如下步骤：

从山东某水库采集底栖蓝藻藻垫，此底栖蓝藻藻垫中主要有害蓝藻为席藻，将200mL藻垫样品加入小型粉碎仪中，粉碎仪功率为200W，粉碎不同时间(1、2、3、4、5s)后取出样品，然后测量样品叶绿素a含量变化和在高倍光学显微镜下观察藻丝形态变化情况。

实施例3

本实施例提供一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法，包括如下步骤：

从山东某水库采集底栖蓝藻藻垫，此底栖蓝藻藻垫中主要有害蓝藻为席藻，将200mL藻垫样品加入小型粉碎仪中，粉碎仪功率为250W，粉碎不同时间(1、2、3、4、5s)后取出样品，然后测量样品叶绿素a含量变化和在高倍光学显微镜下观察藻丝形态变化情况。

实施例1-3所述的解聚方法区别在于功率不同，如图1-3所示，在不同功率下，叶绿素a的含量相似，显然功率在100-250W之间，功率对于蓝藻叶绿素a的影响不大。

如图4所示，随着粉碎时间延长，底栖蓝藻藻垫被解聚成藻丝，各藻丝长度适中，藻丝较为完整，破碎藻细胞较少，视野干净，没有碎藻丝片段干扰视野，可以实现藻丝形态、细胞形态观察与计数。

对比例1

本实施例提供一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法，包括如下步骤：

从山东某水库采集底栖蓝藻藻垫，此底栖蓝藻藻垫中主要有害蓝藻为席藻，将20mL藻垫样品放入超声仪中，超声功率为20W，超声不同时间(2、5、10、15、20s)后取出样品，然后测量样品叶绿素a含量变化和在高倍光学显微镜下观察藻丝形态变化情况。

如图5所示，对比例1所述的解聚方法比实施例1-3中叶绿素a损失率更大，但总体上叶绿素a损失率并不高，可以推测得知，超声处理会导致蓝藻细胞发生一定程度的破裂。另外，如图6所示，底栖蓝藻被分解成蓝藻碎片，蓝藻碎片多，视野混乱，且少有长度较长的藻丝，难以观察藻丝形态，由于碎片藻丝的重叠效应，也难以观察细胞形态。

显然，超声粉碎可以实现藻丝解聚，但藻丝解聚后粉碎度较高，在显微镜下视野混乱，难以实现藻丝和细胞检测，即实施例1-3中，粉碎机粉碎与高倍光学显微镜的配合，实现了底栖藻类解聚过程中保留大量长度较长的藻丝，便于高倍光学显微镜下观察。

对比例2

本实施例提供一种底栖蓝藻藻垫的解聚观察方法，包括如下步骤：

从山东某水库采集底栖蓝藻藻垫，此底栖蓝藻藻垫中主要有害蓝藻为席藻，将20mL藻垫样品放入玻璃研磨管中，研磨不同次数(5、10、20、40、100次)后取出样品，然后测量样品叶绿素a含量变化和在高倍光学显微镜下观察藻丝形态变化情况。

如图7所示，对比例2所述的解聚方法与实施例1-3相比，叶绿素a损失量大，显然细胞破裂程度较高，如图8所示，随着放大倍数的增加，高倍光学显微镜视野中出现了大量的模糊阴影部分，与细胞破裂数目增加相对应。

另外，从图7来看，当研磨次数为5次，10次时，对比例2所述的解聚方法中叶绿素a损失量较小，即细胞破裂较少，但对应图8来看，虽然研磨次数5次、10次时，细胞破裂较少，但藻丝严重碎片化，视野十分混乱，非常不利于观察。

即从对比例1以及对比例2中5次，10次的数据结果以及高倍光学显微镜下的视野可以看出，超声处理或研磨处理即使不导致细胞破裂，也会导致藻丝碎片化程度较高，观察视野较差，难以实现形态观察及计数需求。因此，应当理解的是，在采用相对激烈的解聚方式，减少处理次数或时间的方式，并不适用于藻垫解聚观察。

以上所揭露的仅为本公开的优选实施例而已，当然不能以此来限定本公开之权利范围，因此依本公开申请专利范围所作的等同变化，仍属本公开所涵盖的范围。