桑黄和百蕊草复方作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及桑黄和百蕊草复方作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途。

背景技术

新型冠状病毒，是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新发呼吸道病原体，与重症急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于β-冠状病毒，具有较高的传染性和一定的致死率。新型冠状病毒，世界卫生组织称其为2019-nCoV，世界病毒分类委员会称其为SARS-CoV-2。

COVID-19大流行是21世纪以来人类面临的最大全球公共卫生危机，但目前仍无安全有效的药物应用于临床治疗。所以急需筛选出具有明显抗新冠病毒的药物，药物研发面临的主要挑战包括：

(1)目前的新冠相关的文献报导中，大多以综述或基于数据库的理论分析，在中医药方面体现的更为明显，这些说法只能说在理论上提供了一些参考数据，但实际上却没有确切证据证明药物可改善病毒清除率；

(2)现有的新冠相关的文献报导中，大部分都是参考药物对β冠状病毒属SARS-CoV和MERS-Cov的相关研究，虽然COVID-19也属于β冠状病毒，但序列分析显示,2019-nCoV与SARS-CoV的核苷酸同源性为79.0％,与MERS-CoV的同源性为51.8％,也明显看出COVID-19与二者在序列方面就有所不同，故药物研发上应逐一研究，不能一概而论；

(3)缺乏新药，故大多科研文章会主张使用老药新用或是多联合策略，但同时未在临床试验中显示出明显优势，没有确切证据证明哪种药物真正有效。

发明内容

本发明的目的是提供桑黄和百蕊草复方作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途。

本发明提供了桑黄和百蕊草的应用；所述应用为以下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)：

(a1)桑黄和百蕊草在制备治疗新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；

(a2)桑黄和百蕊草在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；

(a3)桑黄和百蕊草在制备预防新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；

(a4)桑黄和百蕊草在制备预防新型冠状病毒感染的药物中的应用；

(a5)桑黄和百蕊草在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。

所述应用中，桑黄和百蕊草作为原料。

本发明还提供了一种药物(中药组合物)，其原料为桑黄和百蕊草；

所述药物的功能为以下(b1)和/或(b2)和/或(b3)和/或(b4)：

(b1)治疗新型冠状病毒所致疾病；

(b2)治疗新型冠状病毒感染；

(b3)预防新型冠状病毒所致疾病；

(b4)预防新型冠状病毒感染。

本发明还提供了一种新型冠状病毒抑制剂，其原料为桑黄和百蕊草。

本发明还提供了桑黄提取物和百蕊草提取物的应用；所述应用为以下(c1)和/或(c2)和/或(c3)和/或(c4)和/或(c5)：

(c1)桑黄提取物和百蕊草提取物在制备治疗新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；

(c2)桑黄提取物和百蕊草提取物在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；

(c3)桑黄提取物和百蕊草提取物在制备预防新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；

(c4)桑黄提取物和百蕊草提取物在制备预防新型冠状病毒感染的药物中的应用；

(c5)桑黄提取物和百蕊草提取物在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。

本发明还提供了一种药物，其活性成分为桑黄提取物和百蕊草提取物；

所述药物的功能为以下(b1)和/或(b2)和/或(b3)和/或(b4)：

(b1)治疗新型冠状病毒所致疾病；

(b2)治疗新型冠状病毒感染；

(b3)预防新型冠状病毒所致疾病；

(b4)预防新型冠状病毒感染。

本发明还提供了一种新型冠状病毒抑制剂，其活性成分为桑黄提取物和百蕊草提取物。

本发明还提供了一种药物的制备方法，包括如下步骤：将桑黄提取物和百蕊草提取物作为活性成分，得到药物；

所述药物的功能为以下(b1)和/或(b2)和/或(b3)和/或(b4)：

(b1)治疗新型冠状病毒所致疾病；

(b2)治疗新型冠状病毒感染；

(b3)预防新型冠状病毒所致疾病；

(b4)预防新型冠状病毒感染。

所述制备方法中，桑黄提取物和百蕊草提取物混合后包装。

所述制备方法中，桑黄提取物和百蕊草提取物分别独立包装。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1-10:10-1。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1-5:5-1。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1-3:3-1。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1-2:2-1。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1:0.1-10。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1:0.2-5。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1:0.3-3。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1:0.4-2.5。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1:0.5-2。

所述桑黄提取物和所述百蕊草提取物的质量配比可为1:1或者2:1或者1:2。

以上任一所述所述桑黄提取物具体可为桑黄水提取物。

以上任一所述百蕊草提取物具体可为百蕊草乙醇提取物。

所述桑黄水提取物为以桑黄为原料采用水进行提取得到的。

所述桑黄水提取物为以桑黄为原料采用水提取出来的物质。

以上任一所述桑黄水提取物的制备方法包括如下步骤：以桑黄为原料采用水进行提取。

具体的，所述方法包括如下步骤：取桑黄，采用水进行单次提取，然后过滤并收集滤液。

具体的，所述方法包括如下步骤：取桑黄，采用水进行多次提取，每次提取均过滤并收集滤液，然后合并滤液。所述多次提取中，从第二次提取开始，以前一次提取的滤渣为原料进行提取。所述多次具体可为2-4次，例如3次。

所述提取中，桑黄和每次提取的水的配比可为250g：1000-3000mL。

所述提取中，桑黄和每次提取的水的配比可为250g：1500-2500mL。

所述提取中，桑黄和每次提取的水的配比可为250g：1800-2200mL。

所述提取中，桑黄和每次提取的水的配比可为250g：2000mL。

所述方法中，所述桑黄的量以干重计。

每次提取的条件具体可为：浸泡，然后超声提取。

具体的，浸泡的时间可为2-20h。

具体的，浸泡的时间可为2-15h。

具体的，浸泡的时间可为2-12h。

所述浸泡具体可为20-25℃浸泡。

具体的，超声提取的时间可为0.5-2h。

具体的，超声提取的时间可为1h。

所述超声提取具体可为60-100℃超声提取。

所述超声提取具体可为70-90℃超声提取。

所述超声提取具体可为80℃超声提取。

所述超声提取的参数具体可为500W，40KHZ。

所述过滤的孔径具体可为120mm。

所述方法还可包括如下步骤：将滤液依次进行浓缩和干燥，获得产物。

所述浓缩具体采用旋转蒸发的方法。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：60℃以下。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：55-60℃。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：58℃。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：50-60rpm。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：55rpm。

所述干燥具体可为冷冻干燥。

示例性的，冷冻干燥的方法具体可为：-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。

示例性的，所述方法包括如下步骤：

(1)称取桑黄250g，剪碎，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡12h，然后80℃超声提取1h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；

(2)取步骤(1)得到的滤渣，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡2h，然后80℃超声提取1h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；

(3)取步骤(2)得到的滤渣，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡2h，然后80℃超声提取1h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液；

(4)将步骤(1)得到的滤液、步骤(2)得到的滤液和步骤(3)得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪浓缩，然后-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到桑黄水提取物。

以上任一所述百蕊草乙醇提取物为以百蕊草为原料采用乙醇或乙醇溶液进行提取得到的。

以上任一所述百蕊草乙醇提取物为以百蕊草为原料采用乙醇或乙醇溶液提取出来的物质。

所述乙醇溶液具体可为乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为乙醇浓度大于50％(体积比)小于100％(体积比)的乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为50％-99％(体积比)乙醇水溶液。

所述乙醇水溶液可为70％-95％(体积比)乙醇水溶液。

以上任一所述百蕊草乙醇提取物的制备方法包括如下步骤：以百蕊草为原料采用乙醇或乙醇溶液进行提取。

具体的，所述方法包括如下步骤：取百蕊草，采用乙醇或乙醇溶液进行单次提取，然后过滤并收集滤液。

具体的，所述方法包括如下步骤：取百蕊草，采用乙醇或乙醇溶液进行多次提取，每次提取均过滤并收集滤液，然后合并滤液。所述多次提取中，从第二次提取开始，以前一次提取的滤渣为原料进行提取。所述多次具体可为2-6次，例如4次。

具体的，所述方法包括如下步骤：取百蕊草，依次采用95％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液和70％乙醇水溶液进行提取，每次提取均过滤并收集滤液，然后合并滤液。

所述提取中，百蕊草和每次提取的乙醇或乙醇溶液的配比可为2300g：5-50L。

所述提取中，百蕊草和每次提取的乙醇或乙醇溶液的配比可为2300g：10-30L。

所述提取中，百蕊草和每次提取的乙醇或乙醇溶液的配比可为2300g：18-20L。

所述方法中，所述百蕊草的量以干重计。

每次提取的条件具体可为：浸泡，然后超声提取。

具体的，浸泡的时间可为2-20h。

具体的，浸泡的时间可为2-15h。

具体的，浸泡的时间可为2-12h。

所述浸泡具体可为20-25℃浸泡。

具体的，超声提取的时间可为1-5h。

具体的，超声提取的时间可为2-4h。

具体的，超声提取的时间可为3h。

所述超声提取具体可为40-60℃超声提取。

所述超声提取具体可为50℃超声提取。

所述超声提取的参数具体可为500W，40KHZ。

所述过滤的孔径具体可为120mm。

所述方法还可包括如下步骤：将滤液依次进行浓缩和干燥，获得产物。

所述浓缩具体采用旋转蒸发的方法。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：60℃以下。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：50-60℃。

示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：55℃。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：50-60rpm。

示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：55rpm。

所述干燥具体可为冷冻干燥。

示例性的，冷冻干燥的方法具体可为：-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。

示例性的，所述方法包括如下步骤：

(1)取百蕊草2300g，切碎，加入95％乙醇溶液20L，室温浸泡12h，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；

(2)取步骤(1)得到的滤渣，加入85％乙醇溶液18L，室温浸泡2h，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；

(3)取步骤(2)得到的滤渣，加入75％乙醇溶液18L，室温浸泡2h，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；

(4)取步骤(3)得到的滤渣，加入70％乙醇溶液18L，室温浸泡2h，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液；

(5)将步骤(1)得到的滤液、步骤(2)得到的滤液、步骤(3)得到的滤液和步骤(4)得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪浓缩。

所述方法还包括如下步骤：(6)取步骤(5)得到的浓缩液，-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为杨树桑黄。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为购买的中药桑黄。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为采集并干燥后的桑黄。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为新鲜采集的桑黄。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为采集并干燥后的桑黄子实体。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为新鲜采集的桑黄子实体。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为桑黄孔菌的子实体和/或菌丝和/或孢子。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为采集并干燥后的桑黄孔菌的子实体和/或菌丝和/或孢子。

以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为新鲜采集的桑黄孔菌的子实体和/或菌丝和/或孢子。

以上任一所述百蕊草(作为原料的百蕊草)可为购买的中药百蕊草。

以上任一所述百蕊草(作为原料的百蕊草)可为采集并干燥后的百蕊草全草。

以上任一所述百蕊草(作为原料的百蕊草)可为新鲜采集的百蕊草全草。

桑黄是一类大型药用真菌的统称，分布于全国多省区，生长于柳树、桦树、杨树等阔叶树的树桩或树干上或倒木上，主要包括桑树桑黄、杨树桑黄和鲍姆桑黄等，药用部位为桑黄的子实体。杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)，简称杨黄，生长在杨树的活立木或倒木上，广泛分布于我国东北地区，全国多地均有人工种植，分类学地位隶属真菌界、担子菌门、层菌纲、非褶菌目、锈革孔菌科、桑黄孔菌属(Sanghuangporus)。

百蕊草(学名：Thesium chinense Turcz.)是檀香科、百蕊草属植物。分布于中国、日本和朝鲜。在中国大部省区均产。生长于荫蔽湿润或潮湿的小溪边、田野、草甸，也见于草甸和砂漠地带边缘、干草原与栎树林的石砾坡地上。中药百蕊草，为百蕊草的全草。春、夏采收，晒干。

发明人在前期研究发现桑黄和百蕊草具有抗新冠病毒的作用效果。百蕊草提取物表现出较强的抑制新冠病毒复制的作用，但是使用剂量不宜太大，在高浓度时对正常细胞的毒性也相对较大。百蕊草乙醇提取物的细胞毒性对Vero细胞的IC50值为849.441μg/mL，同时在640μg/mL药物浓度下抗病毒效果较显著。桑黄提取物具有较好的抑制新冠病毒复制的作用，且其毒性非常低。桑黄水提取物的细胞毒性非常小，对Vero细胞的IC50值为3408.216μg/mL，抗病毒效果却非常显著，可以明显抑制病毒复制，从而提高病毒的清除率。

进一步的，发明人考虑百蕊草提取物与桑黄提取物组合使用，以达到高效低毒的抗新冠病毒作用。组合药物的毒性并没有增加，同时百蕊草有很强的抗炎作用，桑黄具有调节人体免疫力作用，这种组合药物对于治疗新冠肺炎病人是理想的选择药物。

组合药物所表现出的优点如下

(1)桑黄在抗病毒方面表现出高效低毒，百蕊草在抗病毒方面高效，同时表现有一定毒性，两者复合使得细胞毒性明显降低，从而呈现出高效低毒的药物效果；

(2)两者的复合，可以兼顾百蕊草的抗炎作用以及桑黄具免疫调节作用。百蕊草具较强抗菌消炎作用，抗炎作用是被临床认可的，被誉为“植物抗生素”。桑黄中多糖类、酶类等多种的活性成分物质，能明显增强免疫细胞活性和提高机体免疫力。本发明药物的治疗目标为新型冠状病毒肺炎，故考虑到抗病毒活性的同时，使用百蕊草和桑黄进行复方配药，从而达到较强的抗炎作用和调节人体免疫力的作用，也更好的从多面清除新型冠状病毒肺炎所带来的不良影响，成为治疗新冠肺炎的理想药物。

附图说明

图1为不同浓度的RD-1对Vero细胞的抑制率。

图2为不同浓度的FHA对Vero细胞的抑制率。

图3为不同浓度的FHB对Vero细胞的抑制率。

图4为不同浓度的FHC对Vero细胞的抑制率。

图5为不同浓度的RD-1对病毒RNA拷贝数的影响。

图6为不同浓度的FHA对病毒RNA拷贝数的影响。

图7为不同浓度的FHB对病毒RNA拷贝数的影响。

图8为不同浓度的FHC对病毒RNA拷贝数的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中采用的酶标仪为荷兰雷勃MK3酶标仪。实施例中用于荧光定量PCR的为ABI QuantStudio5 Q5实时荧光定量PCR仪。实施例中的乙醇溶液均指的是乙醇水溶液，其中的％代表体积百分含量。实施例中的双抗均指的是青霉素和链霉素。如无特殊说明，实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。室温的含义：20-25℃。如无特殊说明，实施例中提及的培养基均为含10％胎牛血清和2％双抗的DMEM培养基。如无特殊说明，实施例中的细胞培养条件均为：37℃，5％CO

Vero细胞：非洲绿猴肾细胞，是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的一种细胞系。实施例中所用的新型冠状病毒均为COVID-19(SZ005)，是安徽省疾病预防控制中心实验室从病人分离出的毒株，记载于如下文献：Low dose of emetine as potentialantiSARS-CoV-2virus therapy:preclinical in vitro inhibition and in vivopharmacokinetic evidences；Wang et al.Molecular Biomedicine(2020)1:14。实施例中所用的桑黄为杨树桑黄的干燥的子实体(计量重量为干重)，产地为安徽金寨。实施例中所用的百蕊草为市售中药百蕊草(干燥的百蕊草全草)(计量重量为干重)，产地为湖北襄阳。瑞德西韦(Remdesivir，用RD-1表示)：上海源叶生物科技有限公司，C20A11L121820。

实施例1、桑黄水提取物和百蕊草乙醇提取物的制备

一、桑黄水提取物的制备

1、称取桑黄250g，剪碎，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡12h，然后80℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

2、取步骤1得到的滤渣，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡2h，然后80℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

3、取步骤2得到的滤渣，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡2h，然后80℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，收集滤液。

4、将步骤1得到的滤液、步骤2得到的滤液和步骤3得到的滤液合并(总体积约为5500-5800mL)，然后用旋转蒸发仪(负压、58℃、55rpm)浓缩至约100mL，然后-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，然后取出研磨并获得粉末状产物，即为桑黄水提取物(用SHS表示)。共获得3.655g SHS。

二、百蕊草乙醇提取物的制备

1、取百蕊草2300g，切碎，加入95％乙醇溶液20L，室温浸泡12h，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

2、取步骤1得到的滤渣，加入85％乙醇溶液18L，室温浸泡2h，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

3、取步骤2得到的滤渣，加入75％乙醇溶液18L，室温浸泡2h，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。

4、取步骤3得到的滤渣，加入70％乙醇溶液18L，室温浸泡2h，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，收集滤液。

5、将步骤1得到的滤液、步骤2得到的滤液、步骤3得到的滤液和步骤4得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪(负压、55℃、55rpm)浓缩，得到1.8L浓缩液。

6、取1L步骤5得到的浓缩液，置于-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到产物357.52g，即为百蕊草乙醇提取物，用BRY表示。

实施例2、细胞毒性试验和病毒抑制试验

一、样本液的制备

取1mg RD-1，溶解于1000μl DMSO，得到RD-1母液(RD-1浓度为1mg/mL)。取RD-1母液，用培养基稀释，得到各个浓度的RD-1样本液。

取40mg SHS和40mg BRY，一起溶解于500μl DMSO，得到FHA母液(总药物浓度为160mg/mL)。取FHA母液，用培养基稀释，得到各个浓度的FHA样本液。总药物浓度指的是SHS和BRY的总浓度。FHA样本液的浓度，指的是FHA样本液的总药物浓度。FHA组合物指的是由1质量份SHS和1质量份BRY形成的组合物。

取107mg SHS和53mg BRY，一起溶解于1000μl DMSO，得到FHB母液(总药物浓度为160mg/mL)。取FHB母液，用培养基稀释，得到各个浓度的FHB样本液。总药物浓度指的是SHS和BRY的总浓度。FHB样本液的浓度，指的是FHB样本液的总药物浓度。FHB组合物指的是由2质量份SHS和1质量份BRY形成的组合物。

取53mg SHS和107mg BRY，一起溶解于1000μl DMSO，得到FHC母液(总药物浓度为160mg/mL)。取FHC母液，用培养基稀释，得到各个浓度的FHC样本液。总药物浓度指的是SHS和BRY的总浓度。FHC样本液的浓度，指的是FHC样本液的总药物浓度。FHC组合物指的是由1质量份SHS和2质量份BRY形成的组合物。

二、细胞毒性试验

1、取96孔板，接种Vero细胞(5.0×10

2、完成步骤1后，吸弃上清，用1×PBS缓冲液冲洗2次，加入样本液(100μl/孔)，培养24小时。

样本液分别为步骤一制备的各个样本液。每种样本液设置3个平行处理。

3、完成步骤2后，吸弃上清，用1×PBS缓冲液冲洗2次，然后加入培养基(80μl/孔)和5mg/mL的MTT水溶液(20μl/孔)，培养4h。

4、完成步骤3后，吸弃上清，加入DMSO(100μl/孔)，均匀振荡以使结晶物充分融解，然后采用酶标仪在570nm波长下,测定并记录各孔光吸收值。

设置空白孔：即步骤1中不加入Vero细胞，步骤2中用等体积培养基代替样本液，其他步骤同上。

设置对照孔：即步骤2中用等体积培养基代替样本液，其他步骤同上。

计算半抑制浓度(IC50值)。

RD-1样本液的细胞抑制率结果见图1。RD-1的IC50值为40.865μg/mL。根据IC50值筛选出RD-1进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度如下：0.390μg/mL、0.781μg/mL、1.5625μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL。

FHA样本液的细胞抑制率结果见图2。FHA组合物整体上对细胞毒性较小，1280μg/mL以上的浓度梯度细胞存活率出现一定的下降，但细胞存活率依旧大于50％。FHA的IC50值大于2560μg/mL。根据IC50值筛选出FHA进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度如下：40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL、1280μg/mL。

FHB样本液的细胞抑制率结果见图3。FHB组合物整体上对细胞毒性较小，1280μg/mL以上的浓度梯度细胞存活率出现明显的下降。FHB的IC50值为2084.889μg/mL。根据IC50值筛选出FHB进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度如下：40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL、1280μg/mL。

FHC样本液的细胞抑制率结果见图4。FHC组合物整体上对细胞毒性较小，药物浓度大于960μg/mL时，药物使得细胞的存活率呈现出逐步递减的趋势，但细胞存活率依旧大于50％。FHC的IC50值大于2560μg/mL。根据IC50值筛选出FHC进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度如下：40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL、1280μg/mL。

三、体外抗病毒试验

试验在安徽省疾病预防控制中心实验室进行。

1、取96孔板，接种Vero细胞，采用培养基培养至95％汇合度(此时细胞数量约为1.0×10

2、完成步骤1后，吸弃上清，用维持培养基洗涤2遍，然后每孔加入20μL病毒液，培养1.5h(培养过程中轻轻左右摇匀，保证病毒与细胞充分接触)。

病毒液的制备方法：将新型冠状病毒加至DMEM培养基中，得到TCID

3、完成步骤2后，吸弃上清，用维持培养基洗涤2遍，然后加入含供试物的维持培养基(100μl/孔)，培养48小时。含供试物的维持培养基是将步骤一中制备的母液和维持培养基混合得到的。供试物在培养体系中的浓度采用步骤二确定的各个浓度。每个浓度设置3个平行处理。设置用等体积维持培养基代替含供试物的维持培养基的孔，作为模型组。

4、完成步骤3后，每孔加入20μl TRIZOL，反复吹吸7-8次，充分混匀，先-80℃冷冻30min然后56℃融化30min，然后提取总RNA，即为RNA样本液。

5、采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测病毒核酸的拷贝数。

反应体系的组成(20μL)：RNA样本液5μL，引物探针混合液1μL、4×

上游引物N-F：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；

下游引物N-R：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；

探针N-P：5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3’。

反应程序见表1。

表1

供试物为RD-1时的拷贝数浓度结果见图5(Virus代表模型组)。药物浓度为6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在呈现出递减趋势，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。步骤二中已确定RD-1的IC50值为40.865μg/mL，故可以选择使用12.5μg/mL药物浓度作为其他供试物的阳性对照组。

供试物为FHA时的拷贝数浓度结果见图6(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在呈现出递减趋势。药物浓度为320μg/mL与模型组相比有显著性差异，药物浓度为640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL时与模型组相比显著性差异极大。步骤二中已确定FHA的IC50值大于2560μg/mL，故药物浓度为320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL均可供使用，且高浓度时效果显著。

供试物为FHB时的拷贝数浓度结果见图7(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在呈现出递减趋势。药物浓度为320μg/mL与模型组相比有显著性差异，药物浓度为640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL时与模型组相比显著性差异极大。步骤二中已确定FHB的IC50值为2084.889μg/mL，故药物浓度为320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL均可供使用，且高浓度时效果显著。

供试物为FHC时的拷贝数浓度结果见图8(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数在呈现出递减趋势。药物浓度为320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL时与模型组相比显著性差异极大。步骤二中已确定FHC的IC50值大于2560μg/mL，故药物浓度为320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL均可供使用，且高浓度时效果显著。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 安徽省森湶谷药业股份有限公司

安徽医科大学

<120> 桑黄和百蕊草复方作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途

<130> GNCYX211879

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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