一种制备复杂器官的专用组合模具及制备复杂器官的方法

技术领域

本发明属于器官制造技术领域，尤其涉及一种制备复杂器官的专用组合模具及制备复杂器官的方法。

背景技术

作为一种常见的葡萄糖代谢和内分泌障碍继而引起全身性代谢紊乱的慢性疾病，糖尿病已成为严重威胁人类健康的世界性、公共性疾病。糖尿病主要分为两种类型:Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。Ⅰ型糖尿病是因为患者的免疫系统对自身分泌胰岛素的B细胞发生攻击并杀死它们，结果不能分泌足够的胰岛素。此类糖尿病多发生于青少年，患者需要依赖外源性胰岛素补充以维持生命; Ⅱ型糖尿病则是患者体内存在胰岛素“抵抗”现象，不能有限利用体内的胰岛素进行葡萄糖的吸收、转化和利用，此类型多发生于成人，占糖尿病患者的90%以上。目前糖尿病的主要治疗方式是外源性注射胰岛素，但传统的胰岛素注射除了给患者带来痛苦外，还会使血糖波动明显，易发生低血糖现象。

组织工程是一门近年来发展迅速的交叉学科。组织工程（Tissue engineering），是由美国国家科学基金会在1987年正式提出和确立的，是一门以细胞生物学、材料科学和工程学相结合，进行体外或体内构建具有和天然组织类似结构和功能的用于修复人体病损的组织、甚至器官的新兴学科。

近年来，组织工程已迅速扩展到许多领域。主要在结构相对简单的骨和皮肤等少数几个领域取得了一些成就，而对一些复杂器官的研究迟迟难以取得突破。以人工胰脏组织制造为例，胰脏中存在有大量丰富的血管、胰管等管状网络。血管网络为组成胰脏的各部分组织细胞提供氧气和营养的同时将代谢废物排出体外，保证各种生理功能正常运行。缺乏足够精细的血管网络将很难实现体积较大的组织的构建。胰管结构是胰外分泌部的导管。开口于十二指肠，是胰的主要排泄管。如果不能在人工胰组织中很好地实现这些管状网络的构建，那么制造出的胰脏产品可能会不能维持胰脏正常的组织结构，也可能不会顺利地实现胰脏功能。目前，血管、胰管网络的构建已成为生物型人工胰脏制造领域的主要研究热点。其中在胰脏制造过程中，常用的构建血管的方法主要有使用相应的生长因子缓慢促进血管不同组织层形成，多细胞联合培养形成血管结构，利用生物反应器和微流体通道等技术形成血管以及基于先进成型技术的血管化组织直接构建等。

发明专利（申请号为201110448154.3）《基于一种组合模具的复杂器官前体的制备方法》中提供了一种多分支及多层结构的复杂组织器官前体的制备方法，利用组合模具分层灌注来形成含有多分支结构的复杂器官组织前体。该发明的缺点在于采用直接拆模的方式，在脱模时实心多分支内模具由于其形状不规则会破坏已经成型的细胞基质层，该制备方法对模具内部形状及粗糙度要求较高。同时由于交联剂或聚合剂与高分子溶液材料接触面过少，会容易影响交联或聚合效果，继而影响细胞基质层的成形效果。

发明专利（申请号为201210324600.4）《利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法》中提出了一种利用旋转组合模具制备纺锤体状的复杂器官前体的方法。理论上可以通过模具的旋转形成带多分支管状通路的纺锤体状的复杂器官，但缺点在于模具的旋转速度不同，纺锤体成型高度就不同，对于不同组合模具，其旋转速度难以进行定量限制，所以难以确定纺锤体的具体成型形状。这种组合模具目前只用于含一组分支通道的纺锤体状器官前体的成形，且在拔除内模具时易造成含细胞基质材料结构的破坏。

发明专利（申请号为201510419730.X）《一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具》中提出了一种制备带多分支通道的组织器官前体的专用模具，其缺点在于中间操作步骤复杂，大小管道间易错位。粘稠度稍高的水凝胶溶液很难充满整个内腔，分支内模具不可拆卸，从细胞基质层中取出时会对已成形的结构造成破坏。

发明专利（申请号为201910682212.5）《可拆卸式专用模具及制备多分支通道复杂器官前体的方法》中提出了一种制备多分支通道的复杂器官前体的专用模具以及方法。该专用模具内部分支模具可拆卸的，从细胞基质层取出时不会对已成形的结构造成破坏。

发明内容

本发明就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种制备复杂器官的专用组合模具及制备复杂器官的方法，其利用仿生学原理模拟复杂器官并设计多级外模具，可以得到具有中间大通道和周围许多小通道的具有不同细胞基质层的组织结构。有望实现带有多通道血管、胆管、肾小管和胰管的复杂器官体外快速制造。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，制备复杂器官的专用组合模具，包括底座模具、底层内环外模具，中间层内环外模具、顶层内环外模具、三个中央主通道模具、中环外模具、外环外模具和分支通道模具；所述底座模具底面设置有用于固定三个中央主通道模具的孔，且底座模具采用多层台阶状，阶梯数和外模具级数相同；底层内环外模具、中间层内环外模具、顶层内环外模具上设置有多个对应的分支通道模具的安装孔，分支通道模具长度高于外模具的长度；分支通道模具的尺寸和数目与三个中间主通道上对应的安装孔的尺寸和数目相同；外模具的外围尺寸和底座模具对应的阶梯的尺寸相同，下一级外模具的内腔和上一级外模具的内腔平滑过渡，且外模具的内腔具有和预设组织器官相同的轮廓。

进一步地，所述底座模具底面可以是平面、凹面或者凸面中的任意一种，模具采用仿生学方法模仿复杂器官结构，可固定在底座模具中心的中间三个主通道用于模仿复杂器官中的动脉血管、静脉血管、胆管、肾小管和胰管，多个通道模具可模仿围绕中间动静脉血管的小血管和分支血管结构。

进一步地，所述底座模具、中央主通道模具、分支通道模具和外模具的材料均为无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、光敏树枝或聚氨酯等）或者金属材料。

进一步地，分支通道模具的直径范围均在0.1mm～5mm；中央三个主通道的直径根据通道模具直径的变化进行调整；底座模具的台阶从中间向两边逐级升高，台阶的级数为1～20；底座模具外形及各级台阶截面为圆型。

一种制备复杂器官的方法，包括以下步骤：（1）以动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×10

（2）在所有的通道模具上涂覆一层含细胞（如内皮细胞，胰管上皮细胞等）的基质溶液，采用使用物理、化学交联或聚合等方法进行交联得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（3）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将（2）中已经进行交联处理的所有分支通道模具固定在底层模具上对应的孔内，再将三个中央主通道固定在底座模具的中央凹槽内，再连接上分支通道模具；将底层内环外模具安装到底座模具的内侧阶梯上，将一种含有细胞的基质溶液加到底层内环外模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合等方法制成第一层细胞基质层。然后对准底层内环外模具凹槽，放置已经固定好通道的中间层内环外模具以及分支通道模具，将一种含有细胞的基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。最后对准中间层内环外模具凹槽，放置已经固定好通道的顶层内环外模具以及分支通道模具，将一种含有细胞的基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。

（4）拔出所有安装的分支通道模具，去除上中下三层内环外模具，将较大的中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环内模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入第二种含有细胞的基质溶液，并进行交联，制成第二层细胞基质层。

（5）去除中环外模具，安装外环外模具到底模具相应阶梯上，重复步骤（4）的加料步骤制备出第三层细胞基质层。

（6）将外环外模具、底座模具和中间三个主通道模具去除，取出已形成的带有中央大通道和周围多个小通道的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多通道胰脏器官前体。

（7）在得到的复杂器官的外部涂覆一层合成高分子溶液,然后用细胞培养液或PBS萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层,增加复杂器官的机械强度。

进一步地，水凝胶溶液采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇中的一种或者几种，以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳。

进一步地，用于制备合成高分子溶液的合成高分子材料采用聚乳酸、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚羟基酸酯、聚己内酯、聚乙二醇和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物，用于溶解合成高分子材料的有机溶剂采用异丙醇、1，4-二氧六环、乙二醇或四乙二醇；用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、PBS溶液、生理盐水、3－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液、pH＝6～8的0.09M氯化钠或细胞培养液。

进一步地，可成型多层含有不同细胞的细胞基质层，完成多种细胞组织的组装。

进一步地，在细胞基质溶液中可加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或胰细胞生长因子等细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或几种，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。

与现有技术相比本发明有益效果。

本发明采用仿生学方法模仿复杂器官的结构设计出的多通道可拆分组合模具可制备内部带有模仿中间动静脉血管、胆管、肾小管和胰管的大通道和周围模仿分支血管（包括毛细血管）、分支胆管、分支肾小管和分支胰管的小通道的复杂器官。多级外模具的设计可以通过分层灌注得到不同的细胞基质层，内部通道可通过细胞-水凝胶的诱导形成血管、胆管、肾小管和胰管结构，外层合成高分子材料能提高所得复杂器官的机械性能。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。

图1是专用模具的整体剖面图。

图2是专用模具的整体剖面拆分图。

图3是专用模具的透视图。

图4是中央主通道模具分支通道模具结构示意图。

图5是带多通道网络的复杂器官成型图（以三种不同细胞基质层的器官前体为例）。

图6专用模具整体示意图。

图中，101-底座模具；102-外环外模具；103-中环外模具；104-底层内环外模具；105-中间层内环外模具；106-顶层内环外模具；201-分支通道模具；202-分支通道模具；203-分支通道模具；301-中央主通道模具； 302-中央主通道模具；303-中央主通道模具；401-第一种细胞基质层；402-第二种细胞基质层；403-第三种细胞基质层；404-第四种细胞基质层；405-第五种细胞基质层。

具体实施方式

如图1-6所示，专用模具包括底座模具101、底层内环外模具104，中间层内环外模具105、顶层内环外模具106、三个中央主通道模具201、202、203、中环外模具103、外环外模具102和分支通道模具301、302、303；所述底座模具101底面为平面、凹面或者凸面，中间有可以固定三个中央主通道模具的孔，并采用多层台阶形状，阶梯数和外模具级数相同；底层内环外模具、中间层内环外模具、顶层内环外模具上有多个对应的分支通道模具的安装孔，分支通道模具长度高于外模具的长度，便于拆卸；分支通道模具的尺寸和数目与三个中间主通道上对应的安装孔的尺寸和数目相同；外模具的外围尺寸和底座模具对应的阶梯的尺寸完全相同，下一级外模具的内腔和上一级外模具的内腔平滑过渡，且外模具的内腔具有和预设组织器官相同的轮廓。

所述的一种用于制备复杂器官的专用组合模具，其特征在于：所述的专用组合模具采用仿生学方法模仿复杂器官的结构，可固定在底座模具中心的中间主通道模具可模仿复杂器官中间的静脉血管、动脉血管、胆管、肾小管、胰管，多个通道模具可模仿围绕中间动静脉血管的小血管、小胆管、小肾小管、小胰管分支结构。

所述的一种用于制备复杂器官的专用组合模具，其特征在于：所述的专用组合模具采用从下至上三层结构和从外至内三层结构。从下至上三层结构可以选用最适合的水凝胶材料用来培养胰管和动静脉血管。从外至内三层结构可以通过使用不同生物材料配比用来培养管道细胞，器官实质性组织细胞。

所述的一种用于制备复杂器官的专用组合模具，其特征在于：所述的底座模具，底层内环外模具，中间层内环外模具，顶层内环外模具，通道模具和其他外模具的材料为无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、光敏树枝或聚氨酯等）或者金属材料。

所述的一种用于制备复杂器官的专用组合模具，其特征在于：分支通道模具301、302、303的直径范围在0.1mm～5mm；中间中央三个主通道201、202、203的直径根据通道模具直径的变化进行调整；底座模具101的台阶从中间向两边逐级升高，台阶的级数为1～20；底座模具外形及各级台阶截面为圆型、椭圆型。

所述的一种专用组合模具制备复杂器官的方法，包括如下步骤：（1）、提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×10

（2）、在所有的通道模具上涂覆一层含细胞（如内皮细胞，胆管上皮细胞等）的基质溶液，采用使用物理、化学交联或聚合等方法进行交联得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（3）、将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将（2）中已经进行交联处理的所有分支通道模具固定在底层模具上对应的孔内，再将三个中央主通道固定在底座模具的中央凹槽内，再连接上分支通道模具。将底层内环外模具安装到底座模具的内侧阶梯上，将一种含有细胞的基质溶液加到底层模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合等方法制成第一层细胞基质层。然后对准底层模具凹槽，放置已经固定好通道的中间层模具以及分支通道模具，将一种含有细胞的基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。最后对准中间层模具凹槽，放置已经固定好通道的顶层模具以及分支通道模具，将一种含有细胞的基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。

（4）、去除上中下三层内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将较大的中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环内模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入第二种含有细胞的基质溶液，并进行交联，制成第二层细胞基质层。

（5）、去除中环外模具，安装外环外模具到底模具相应阶梯上，重复步骤（4）的加料步骤制备出第三层细胞基质层。

（6）、将外环外模具和三个中央主通道模具去除，取出已形成的带有中央大通道和周围多个小通道的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多通道复杂器官。

（7）、在得到的胰脏前体的外部涂覆一层合成高分子溶液,然后用细胞培养液或PBS萃取合成高分子溶液中的溶剂，形成外层合成高分子材料层,增加复杂器官的机械强度。

本发明的优选方案是配制的水凝胶溶液的天然高分子材料通常采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇等材料中的一种或者几种，以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳。用于增加机械强度的合成高分子材料通常采用聚乳酸、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚羟基酸酯、聚己内酯、聚乙二醇和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。用于溶解合成高分子材料的有机溶剂采用异丙醇、1，4-二氧六环、乙二醇或四乙二醇。在萃取部分用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、PBS溶液、生理盐水、3－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液、pH＝6～8的0.09M氯化钠或细胞培养液。在细胞基质溶液中可加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或胰细胞生长因子等细胞生长因子中的一种或几种，以及胰素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或几种，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。

所述的一种用于制备复杂器官的专用组合模具，所述的底座模具，底层内环外模具，中间层内环外模具，顶层内环外模具，通道模具和其他外模具的材料为无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、光敏树枝或聚氨酯等）或者金属材料。

所述的一种用于制备复杂器官的专用组合模具，分支通道模具301、302、303的直径范围在0.1mm～5mm；中央三个主通道201、202、203的直径根据通道模具直径的变化进行调整；底座模具101的台阶从中间向两边逐级升高，台阶的级数为1～20；底座模具外形及各级台阶截面为圆型、椭圆型。

实施例1：制备带多通道血管网络的复杂器官胰脏。

（1）使用光敏树脂制备含二级台阶的底模具、中央支架模具、20个通道模具和外环模具。

（2）配制1%纤维蛋白原水凝胶溶液，配备浓度为5%（w/v）的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液作为合成高分子溶液，并加入1%（w/v）的胰素。

（3）在所有的通道模具上涂覆一层内皮细胞和纤维蛋白原的混合物，该基质溶液的细胞密度为1×10

（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将（3）中已经进行交联处理的所有分支通道模具固定在底层内环外模具上对应的孔内，再将三个中央主通道固定在底座模具的中央凹槽内。将底层内环外模具安装到底模具的内侧阶梯上，通过顶部将细胞密度为1×10

（5）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向外环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入胰岛细胞、骨髓干细胞和纤维蛋白原混合的基质溶液，细胞密度为1×10

（6）将中环外模具、底座模具和中间三个主通道去除，取出已形成的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的多血管网络胰脏前体。

（7）在得到的多血管网络胰组织前体的外部涂覆一层配制好的PLGA溶液,然后用细胞培养液进行萃取，形成外层合成高分子材料层,增加胰脏组织前体的机械强度。

实施例2：制备带多通道肾小管的肾脏。

（1）使用聚四氟乙烯制备含三级台阶的底模具、中央支架模具、16个通道模具和外环模具。

（2）将5%明胶、2%海藻酸钠共混溶于PBS溶液中作为基质溶液，配备5%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入1%（w/v）的胰素。

（3）在所有的通道模具上涂覆一层肾小管细胞和基质溶液的混合物，该基质溶液的细胞密度为1×10

（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将（3）中已经进行交联处理的所有分支通道模具固定在底层内环外模具上对应的孔内，再将中间三个主通道固定在底座模具的中央凹槽内。将底层内环外模具安装到底模具的内侧阶梯上，通过顶部将细胞密度为1×10

（5）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的分支通道模具，将中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入肾脏组织细胞、脂肪干细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10

（6）去除中环外模具，将外环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向外环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入脂肪干细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10

（7）将外环外模具、底座模具和中央通道模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的含多个肾小管网络的肾脏。

（8）在得到的含多个肾小管网络的肾脏外部涂覆一层配制好的聚氨酯溶液,然后用PBS溶液进行萃取，形成最外层合成高分子材料层,增加含多个肾小管网络的肾脏的机械强度。

实施例3：制备带多通道血管、胰管管网络的可植入肝脏。

（1）使用硅橡胶制备含三级台阶的底模具、中央支架模具、20个通道模具和外环模具。

（2）配制10%的明胶溶液作为基质溶液，配备20%的聚乳酸/异丙醇溶液，加入1%（w/v）的胰素。

（3）在一半的通道模具上涂覆一层胰管上皮细胞和基质溶液的混合物，在另一半的通道模具上涂敷一层内皮细胞，肝干细胞和基质溶液的混合物，基质溶液中细胞的密度为1×10

（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将（3）中已经进行交联处理的所有分支通道模具固定在底层内环外模具上对应的孔内，再将中间三个主通道固定在底座模具的中央凹槽内。将底层内环外模具安装到底座模具的相应阶梯上，通过顶部将细胞密度为1×10

（5）去除内环外模具，用镊子拔出所有安装的通道模具，将中环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向中环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入肝细胞、肝干细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10

（6）去除中环外模具，将外环外模具安装到底模具的相应阶梯上，通过顶部加料口向外环模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入胰组织细胞、胰岛细胞和基质溶液的混合物，细胞密度为1×10

（7）将外环外模具、底座模具和中央通道模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的人工肝脏。

（8）在得到的多胰管网络胰组织前体的外部涂覆一层配制好的聚乳酸溶液,然后用细胞培养液进行萃取，形成最外层合成高分子材料层,增加人工肝脏的机械强度。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。