抗IGF-I受体人源化抗体

技术领域

本发明涉及抗IGF-I受体人源化抗体。具体而言，涉及特异性地与脊椎动物的IGF-I受体结合的抗IGF-I受体人源化抗体。

背景技术

1. IGF-I

IGF-I是胰岛素样生长因子，通过由下垂体分泌的生长激素(GH)激活GH受体，而主要由肝脏分泌，与IGF-I受体作用，从而在各种脏器中体现各种生理功能。因此，IGF-I被期待治疗各种疾病。IGF-I与胰岛素原的氨基酸序列相比具有高达约40%的相似性，因此有时还与胰岛素受体结合而体现胰岛素样作用(非专利文献1)。另外，IGF-I受体与胰岛素受体的氨基酸序列相比具有高达约60%的相似性，因此这两种受体有时会形成异源二聚体(非专利文献1)。需要说明的是，胰岛素通过与胰岛素受体作用而体现强效的降血糖作用，因此作为降血糖药被用于治疗。

2. IGF-I受体

IGF-I受体是跨膜蛋白，该跨膜蛋白由α链和β链构成，包含L1、CR、L2、Fn1、Fn2和Fn3这6个胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域(非专利文献2)。IGF-I受体的胞内结构域具有酪氨酸激酶。作为胞外结构域的富半胱氨酸结构域(CR：cysteine-rich domain)参与IGF-I与IGF-I受体结合时的该受体的立体结构的变化所伴随的细胞内的酪氨酸激酶的激活。若IGF-I受体形成同源二聚体复合物(同型)、且IGF-I与之结合，则通过激活受体激酶来传递信号。另外，若与胰岛素受体形成异源二聚体复合物(异型)、且胰岛素或IGF-I与之结合，则通过激活受体激酶来传递信号(非专利文献3、4)。

3. IGF-I的生理作用

已明确了IGF-I的增加身长或体重等的生长促进作用、和促进糖代谢或降血糖作用等的胰岛素样代谢作用。已确认到作为人重组IGF-I的美卡舍明(Mecasermin)会改善胰岛素受体异常症的高血糖、高胰岛素血症、黑色表皮瘤和多毛等症状。另外，还确认到其会改善生长激素抵抗性侏儒症(Dwarfism)的生长障碍(非专利文献5)。

4. IGF-I的生长促进作用

已知IGF-I使人软骨细胞的DNA合成能力亢进。另外，给予IGF-I会使摘出了下垂体的大鼠的体重增加，使大腿骨(股骨)骨长伸长(非专利文献5)。

5. IGF-I的肌肉量增加作用

由IGF-I介导的细胞增殖活性的亢进需要IGF-I受体的持续激活(非专利文献6)。在使IGF-I受体过度表达的动物中肌肉量增加(非专利文献7)。另外，IGF-I/IGFBP3的持续给予(给药)会使大腿骨近端骨折患者的握力亢进，使无辅助下的从座位站起的能力改善(非专利文献8)。已知高龄的人和小鼠的肌肉中的IGF-I浓度较低龄者下降(非专利文献9、10)，但在使IGF-I在肌肉组织中特异性地强制表达的高齢小鼠中，与野生型小鼠相比肌肉量有所改善(非专利文献11)。

6. 使肌肉量增加的现有品

作为生长素释放肽受体激动剂的阿拉莫林(Anamorelin)在废用性肌肉萎缩症即恶病质(Cachexia)的临床试验中使瘦体重增加。另一方面，作为副作用，确认到恶心和血糖值的上升(非专利文献12)。

肌肉生长抑制素(Myostatin)是与激活素受体II (ActRII)作用以抑制Akt/mTOR的骨骼肌形成的负向调控因子(非专利文献13～15)。作为抗肌肉生长抑制素抗体的LY2495655使实施了全人工股关节置换术的患者和高齢者的肌肉量增加(非专利文献16、17)。

另外，作为抗ActRII抗体的比玛格鲁单抗(Bimagrumab)使神经肌肉疾病患者的肌肉量增加(非专利文献18)。然而，可促进骨骼肌的形成并用于治疗的药物目前尚不存在。

7. IGF-I的降血糖作用

作为IGF-I的胰岛素样作用，已知有降血糖作用。IGF-I在来自大鼠肌肉的细胞中使葡萄糖摄取作用亢进(非专利文献5)。另外，给予IGF-I会使大鼠的血糖值降低(非专利文献5)。

据报道，IGF-I的降血糖作用会引起低血糖，这成为临床上的副作用(非专利文献19)。而且，IGF-I通过对人给予而引起低血糖，因此在开始治疗时从低剂量起依次给予适当量，并需要观察给予后的包括血糖值等在内的各种临床所见(非专利文献5)。

IGF-I经由作为IGF-I受体的下游信号的Akt的磷酸化的亢进来体现降血糖作用。Akt的活性型突变体使3T3-L1细胞的葡萄糖摄取亢进(非专利文献20)。另一方面，Akt2缺损的小鼠的血糖值上升(非专利文献21)。另外，在来自大鼠肌肉的细胞中，Akt抑制剂会抑制基于胰岛素刺激的葡萄糖摄取(非专利文献22)。而且，已知IGF-I会激活参与降血糖作用的胰岛素受体。由这些结果认为：Akt的过度激活和胰岛素受体的激活参与IGF-I的降血糖作用。

8. IGF-I的短的血中半衰期

由于IGF-I的血中半衰期短，所以在治疗中需要频繁给予。实际上，作为人重组IGF-I的美卡舍明的血中半衰期为约11小时～16小时，在侏儒症的治疗中需要1天给予1次～2次(非专利文献5)。

血中的IGF-I的约70～80%与IGFBP3结合。IGF-I的游离体显示生理活性。与IGFBP3的结合使IGF-I的血中半衰期维持约10小时～16小时(非专利文献1)。

作为IGF-I与IGFBP3的复方制剂的IPLEX与IGF-I相比血中半衰期长达约21小时～26小时，是可1天给予1次的药剂(非专利文献23)。然而，IPLEX正退出市场。

还尝试开发了IGF-I的动力学得到改善的PEG化IGF-I，但用于治疗的药剂并不存在(专利文献1)。

9. 通过IGF-I的作用而期待的治疗效果

已知IGF-I与多种脏器作用，其生理功能涉及多方面(非专利文献19)。

据报道，IGF-I在中枢神经系统中经由IGF-I受体的激活而具有线粒体的保护和基于抗氧化作用的神经保护作用(非专利文献24、25)。IGF-I促进受伤后的神经突起的形成(非专利文献26)。

IGF-I是生长促进的主要因子(非专利文献27、28)。实际上，作为人重组IGF-I的美卡舍明在临床上被用作侏儒症的治疗药。

认为IGF-I对肝硬化的治疗有效。肝硬化是从肝损伤或慢性肝病开始病情进展而形成的疾病，是伴有肝脏的纤维化的疾病。在肝硬化模型动物中，给予IGF-I使肝脏的纤维化得到抑制(非专利文献29)。

已知IGF-I还参与肾脏的发育、功能。在肾脏的系膜细胞中，IGF-I对糖毒性所引起的氧化应激和细胞凋亡具有保护作用(非专利文献30)。IGF-I被期待作为肾病的治疗药。

通过给予IGF-I而期待改善的病态包括：侏儒症、Laron症、肝硬化、肝纤维化、衰老、子宫内胎儿发育迟缓(IUGR)、神经疾病、中风、脊髓损伤、心血管保护、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、肾病、骨质疏松症、囊性纤维化、伤口愈合、肌强直性营养不良、爱滋病肌肉衰减症、HIV所伴随的脂肪重新分布综合征、烧伤、克罗恩病、Werner综合征、X-连锁性复合免疫缺陷、听力损失、神经性厌食症和早产儿视网膜病变(非专利文献19)。

IGF-I因其丰富多彩的生理作用，而被期待作为各种疾病的治疗药。然而，作为副作用的降血糖作用、和因半衰期短而导致的多次给予成为其在临床应用上的课题。

10. IGF-I受体激动剂抗体

抗体制剂通常半衰期长，每月给予1次～2次即显示有效性。关于IGF-I受体激动剂抗体，虽然报道了其在体外(in vitro)的受体激活作用，但尚无在体内(in vivo)对IGF-I受体显示激动剂活性的抗体的报道(非专利文献31～35)。

抗体3B7和抗体2D1在体外使细胞的DNA合成亢进(非专利文献32)。

抗体11A1、11A4、11A11和24-57在体外使IGF-I受体的酪氨酸的磷酸化亢进(非专利文献33)。

抗体16-13、17-69、24-57、24-60、24-31和26-3显示出在体外具有细胞的DNA合成、和葡萄糖摄取的亢进作用，这些抗体有可能具有降血糖作用(非专利文献34、35)。

然而，迄今为止，尚无使用原代培养细胞、尤其是使用人成肌细胞在体外显示细胞增殖活性的IGF-I受体激动剂抗体的报道，更没有在体内显示肌肉量增加作用的IGF-I受体激动剂抗体。

11. IGF-I受体拮抗剂抗体

关于与IGF-I受体结合的抗体，利用其抑制IGF-I与IGF-I受体的结合的拮抗剂作用，试着将其用于恶性肿瘤等的治疗。然而，现有的IGF-I受体拮抗剂抗体不仅在单独治疗中高血糖等的副作用多(非专利文献36)，通过与其他抗癌药并用还使高血糖的出现率上升(非专利文献37)，因此认为其在治疗中的适用受限。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2011-518778号公报；

非专利文献

非专利文献1：Ohlsson, C.等人, The role of liver-derived insulin-likegrowth factor-I. Endocr Rev, 2009. 30 (5): 第494-535页；

非专利文献2：Kavran, J. M.等人, How IGF-I activates its receptor.Elife, 2014. 3；

非专利文献3：Bailyes, E. M.等人, Insulin receptor/IGF-I receptorhybrids are widely distributed in mammalian tissues: quantification ofindividual receptor species by selective immunoprecipitation andimmunoblotting. Biochem J, 1997. 327 (Pt 1): 第209-15页；

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非专利文献5：オーファンパシフィック(OrphanPacific), IF. 2015；

非专利文献6：Fukushima, T.等人, Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)activity bound to insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor, which iscontinuously sustained by IGF-I stimulation, is required for IGF-I-inducedcell proliferation. J Biol Chem, 2012. 287 (35): 第29713-21页；

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非专利文献22：Green, C. J.等人, Use of Akt inhibitor and a drug-resistant mutant validates a critical role for protein kinase B/Akt in theinsulin-dependent regulation of glucose and system A amino acid uptake. JBiol Chem, 2008. 283 (41): 第27653-67页；

非专利文献23：FDA申请资料, APPLICATION NUMBER 21-884;

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非专利文献26：Joseph D'Ercole, A.和P. Ye, Expanding the mind: insulin-like growth factor I and brain development. Endocrinology, 2008. 149 (12): 第5958-62页；

非专利文献27：Abuzzahab, M. J.等人, IGF-I receptor mutations resultingin intrauterine and postnatal growth retardation. N Engl J Med, 2003. 349(23): 第2211-22页；

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非专利文献29：Perez, R.等人, Mitochondrial protection by low doses ofinsulin-like growth factor-I in experimental cirrhosis. World JGastroenterol, 2008. 14 (17): 第2731-9页；

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非专利文献31：Bhaskar, V.等人, A fully human, allosteric monoclonalantibody that activates the insulin receptor and improves glycemic control.Diabetes, 2012. 61 (5): 第1263-71页；

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非专利文献36：Atzori, F.等人, A Phase I Pharmacokinetic andPharmacodynamic Study of Dalotuzumab (MK-0646), an Anti-Insulin-like GrowthFactor-1 Receptor Monoclonal Antibody, in Patients with Advanced SolidTumors. Clin Cancer Res., 2011. 17 (19): 第6304-12页；

非专利文献37：de Bono J. S.等人, Phase II randomized study offigitumumab plus docetaxel and docetaxel alone with crossover formetastaticcastration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res., 2014. 20(7): 第1925-34页。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的之一在于：提供特异性地与脊椎动物的IGF-I受体结合的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物。另外，本发明的目的之一还在于：提供抗体，该抗体经由IGF-I受体使肌肉量增加，但不会降低血糖值。

用于解决课题的手段

即，本发明涉及以下内容。

[1] 抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，该抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物包含：作为重链可变区的CDR-1(CDR-H1)序列的SEQ ID NO:1的氨基酸序列、或在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中有1处氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；作为重链可变区的CDR-2(CDR-H2)序列的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列、或在SEQ IDNO: 2的氨基酸序列中有1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；作为重链可变区的CDR-3(CDR-H3)序列的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列、或在SEQ ID NO: 3的氨基酸序列中有1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；作为轻链可变区的CDR-1(CDR-L1)序列的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列、或在SEQ ID NO: 4的氨基酸序列中有1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；作为轻链可变区的CDR-2(CDR-L2)序列的SEQ ID NO: 5的氨基酸序列、或在SEQ ID NO: 5的氨基酸序列中有1处氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；以及作为轻链可变区的CDR-3(CDR-L3)序列的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列、或在SEQID NO: 6的氨基酸序列中有1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列，且特异性地与SEQ ID NO: 14(人IGF-I受体)的胞外结构域结合。

[2] [1]所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，上述抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物包含：作为重链可变区的氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列、或在SEQ ID NO: 7的氨基酸序列中有1处或多处的氨基酸残基被取代、缺失或添加而得的氨基酸序列；以及作为轻链可变区的氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列、或在SEQ ID NO: 8的氨基酸序列中有1处或多处的氨基酸残基被取代、缺失或添加而得的氨基酸序列。

[3] [1]或[2]所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，上述抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物包含：作为重链可变区的SEQ IDNO: 7的氨基酸序列；以及作为轻链可变区的选自SEQ ID NO: 8、9、10、11和12的任一个氨基酸序列。

[4] [1]～[3]所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其进一步包含作为恒定区的人免疫球蛋白的各类中的恒定区。

[5] [4]所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，重链恒定区为人IgG4类的重链恒定区。

[6] [1]～[5]中任一项所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其与包含肽的表位或其附近结合，该肽具有相当于SEQ ID NO: 14(人IGF-I受体)的氨基酸编号308～319的氨基酸序列(ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet)。

[7] [1]～[6]中任一项所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，在诱导来自人或豚鼠的成肌细胞的增殖的剂量下，其不诱导该培养细胞中的葡萄糖摄取。

[8] [1]～[7]中任一项所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，在对脊椎动物给予以诱导该脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的剂量下，其不会使该脊椎动物的血糖值降低。

[9] [8]所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，即使在相对于对脊椎动物给予以诱导该脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的有效剂量为10倍以上的血中暴露量下，其也不会使该脊椎动物的血糖值降低。

[10] 核酸分子，该核酸分子由编码[1]～[9]中任一项所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物的多核苷酸序列构成。

[11] 克隆载体或表达载体，其包含至少一个[10]所述的核酸分子。

[12] 重组体细胞(重组细胞)，其是在宿主细胞中导入有[11]所述的载体而得的。

[13] [1]～[9]中任一项所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物的制造方法，该制造方法包括以下工序：培养[12]所述的重组体细胞，纯化由上述重组体细胞产生的该抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物。

[14] 药物组合物，其包含[1]～[9]中任一项所述的抗IGF-I受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物、[10]所述的核酸分子、[11]所述的载体或[12]所述的重组体细胞作为有效成分。

[15] [14]所述的药物组合物，该药物组合物用于治疗肌肉萎缩性疾病或侏儒症。

[16] [15]所述的药物组合物，其中，肌肉萎缩性疾病为废用性肌肉萎缩、肌肉减少症(Sarcopenia)或恶病质。

[17] [15]所述的药物组合物，其中，侏儒症为Laron型侏儒症或生长激素抵抗性侏儒症。

发明效果

本发明的抗体或其片段、或它们的衍生物具有特异性地与脊椎动物的IGF-I受体结合的效果。

附图说明

[图1] 图1是显示在小鼠、大鼠、人、豚鼠和兔中比较IGF-I受体的CR结构域的氨基酸序列(氨基酸序列以单字母符号来显示)的结果的图。

[图2] 图2是显示对豚鼠通过渗透压泵持续给予IGF-I或单次静脉内给予抗IGF-I受体人源化抗体R11-16B时给予2周后的趾长伸肌的重量的图。

[图3] 图3是显示对禁食条件下的豚鼠单次皮下给予IGF-I时的血中动力学的经时性变化的图。

[图4] 图4是显示对禁食条件下的豚鼠单次静脉内给予抗IGF-I受体人源化抗体R11-16B时的血中动力学的经时性变化的图。

具体实施方式

以下，根据具体的实施方式来说明本发明，但本发明并不受这些实施方式的任何限定。需要说明的是，本说明书中引用的包括专利公报、专利申请公开公报和非专利公报在内的所有文献在一切目的下其整体均通过引用而被纳入本说明书。

本公开中，“IGF”是指胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor)，存在IGF-I和IGF-II。IGF-I和IGF-II是具有激动剂活性的生物体内的配体，与后述的IGF-I受体(胰岛素样生长因子-I受体：Insulin-like Growth Factor-I Receptor)结合，向细胞内传递细胞分裂或代谢的信号。已知IGF-I和IGF-II还弱弱地与胰岛素受体(INSR)交叉结合，该INSR与IGF-I受体在结构上具有类似性。在本说明书中，虽然主要阐述生理功能等更为熟知的IGF-I，但在对由IGF-I受体与配体的结合介导的作用或疾病等进行研究的情况下，有时也包含IGF-I与IGF-II两者的作用进行记载。

IGF-I也称为生长调节素(Somatomedin) C，是由70个氨基酸构成的单一多肽的激素。人的IGF-I的序列可参照EMBL-EBI的UniProtKB-登录号P50919等获取。序列表的SEQ IDNO: 13显示成熟型IGF-I的氨基酸序列。由70个氨基酸构成的该序列以多个种保存。本发明中，在仅记载为“IGF-I”的情况下，只要没有特别说明，则意思是指具有激素活性的IGF-I蛋白。

IGF-I在以肝细胞为首的生物体内的各种细胞中产生，也存在于血液或其他体液中。因此，天然型的IGF-I可由动物的体液、或培养了由动物分离的原代培养细胞或株化细胞(细胞株)等的培养物进行纯化而得到。另外，IGF-I通过生长激素诱导在细胞内的产生，因此还可由给予了生长激素的动物的体液、或在生长激素存在下培养了由动物分离的原代培养细胞或株化细胞等的培养物纯化IGF-I而得到。另外，作为其他方法，还可使用重组体细胞或导入(引入)了IGF-I基因的转基因动物或转基因植物等制造IGF-I，上述重组体细胞是将编码IGF-I的氨基酸序列的核酸分子插入到表达载体中、再导入到大肠杆菌等原核生物或酵母、昆虫细胞或来自哺乳类的培养细胞等真核细胞的宿主中而得的。而且，人IGF-I还可作为研究用试剂(Enzo Life Sciences, catalog: ADI-908-059-0100; Abnova,catalog: 第3452页等)、药品(Somazon

本公开中，“IGF-I受体”是指胰岛素样生长因子-I受体(Insulin-like GrowthFactor-I Receptor)。在本说明书中，只要没有特别说明，则“IGF-I受体”意思是指IGF-I受体蛋白。IGF-I受体是2个由α链和β链构成的亚单位缔合而成的结构的蛋白。在SEQ ID NO:14所示的人IGF-I受体的氨基酸序列中，其氨基酸序列中的由第31位～第735位的氨基酸序列构成的部分相当于α链，β链相当于第740位以后的序列。IGF-I受体的α链具有IGF-I的结合部分，β链是跨膜型结构，起到向细胞内传递信号的作用。IGF-I受体的α链分为L1、CR、L2、FnIII-1和FnIII2a/ID/FnIII2b的结构域。在SEQ ID NO: 14所示的人IGF-I受体的氨基酸序列中，第31位～第179位的部分相当于L1结构域，第180位～第328位的部分相当于CR结构域，第329位～第491位的部分相当于L2结构域，第492位～第607位的部分相当于FnIII-1结构域，第608位～第735位相当于FnIII-2a/ID/FnIII-2b结构域。其中，CR结构域(富半胱氨酸结构域：cysteine-rich domain)参与在IGF-I与IGF-I受体结合时该受体的立体结构的变化所伴随的β链的细胞内酪氨酸激酶的激活。人的IGF-I受体的氨基酸序列可参照EMBL-EBI的UniProtKB-登录号P08069等，也显示在序列表的SEQ ID NO: 14中。

已知IGF-I受体在生物体内的组织或细胞的广泛范围内表达，接受基于IGF-I的细胞增殖的诱导或细胞内信号的激活等的刺激。特别是，成肌细胞可用于以细胞增殖活性为指标评价IGF-I的由IGF-I受体介导的作用。由此可知：成肌细胞在分析与IGF-I受体结合的抗体的作用上有效。另外，在将编码人或其他脊椎动物的IGF-I受体的氨基酸序列的核酸分子插入到表达载体中、再导入到昆虫细胞或来自哺乳类的培养细胞等真核细胞的宿主中而得的重组体细胞中，通过使导入至其细胞膜上的核酸所编码的IGF-I受体表达，可人工制造表达人或其他脊椎动物的IGF-I受体的细胞。该IGF-I受体表达细胞可用于分析抗体的结合性或研究向细胞内的信号传递等。

根据本发明的一个方面，提供新型的抗IGF-I受体人源化抗体(以下，为方便起见，将其称为“本发明的抗体”。)。

本公开中，“抗体”是指包含通过二硫键相互结合的至少2个重(H)链和2个轻(L)链的糖蛋白。各重链包含重链可变区(简称为VH)和重链恒定区，重链恒定区包含3个结构域即CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(简称为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域即CL。在轻链的恒定区中，存在称为λ链和κ链的2种。在重链的恒定区中存在γ链、μ链、α链、δ链和ε链，根据其重链的不同，分别存在IgG、IgM、IgA、IgD和IgE这样的抗体同种型。VH和VL进一步细分为：称为构架区(FR)的更保守的4个区(FR-1、FR-2、FR-3、FR-4)和称为互补性决定区(CDR)的超可变性的3个区(CDR-1、CDR-2、CDR-3)。VH包含从氨基末端到羧基末端以FR-1、CDR-1 (CDR-H1)、FR-2、CDR-2 (CDR-H2)、FR-3、CDR-3 (CDR-H3)、FR-4的顺序排列的3个CDR和4个FR。VL包含从氨基末端到羧基末端以FR-1、CDR-1 (CDR-L1)、FR-2、CDR-2(CDR-L2)、FR-3、CDR-3 (CDR-L3)、FR-4的顺序排列的3个CDR和4个FR。重链和轻链的可变区包含与抗原发生相互作用的结合结构域。

本发明的抗体可以是抗体的片段和/或衍生物。作为抗体的片段，可列举：F(ab’)2、Fab、Fv等。作为抗体的衍生物，可列举：向恒定区部分人工导入氨基酸突变而得的抗体、修饰恒定区的结构域的构成而得的抗体、每1个分子具有2个以上的Fc的形式的抗体、仅由重链或仅由轻链构成的抗体、糖链修饰抗体、双特异性抗体、与抗体或抗体的片段化合物或除抗体以外的蛋白结合而得的抗体缀合物、抗体酶、纳米抗体、串联scFv、双特异性串联scFv、双抗体(Diabody)、VHH等。需要说明的是，本发明中，在简称为“抗体”的情况下，只要没有额外说明，则还包括抗体的片段和/或衍生物。

本公开中，“抗原抗体反应”是指抗体以平衡解离常数(KD)为1×10

本公开中，抗体对抗原具有“特异性”是指在抗体与其抗原之间发生高的抗原抗体反应。特别是，本公开中，“IGF-I受体特异性抗体”是指在对表达了IGF-I受体的细胞明显地显示抗原抗体反应的浓度下，抗原抗体对与IGF-I受体的一级结构(氨基酸序列)和高级结构具有高类似性的INSR的反应性为对Mock细胞的反应性的1.5倍以下的情况。

关于抗原抗体反应的测定，如果是本领域技术人员，则可适当选择固相或液相系统中的结合测定来进行。作为这样的方法，可列举：酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay：ELISA)、酶免疫测定法(enzyme immunoassay：EIA)、表面等离子体共振法(surface plasmon resonance：SPR)、荧光共振能量转移法(fluorescenceresonance energy transfer：FRET)、发光共振能量转移法(luminescence resonanceenergy transfer：LRET)等，但并不限于这些。另外，在测定这样的抗原抗体结合时，还可使用酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素等对抗体和/或抗原进行标记，采用适合于其标记的物质的物理和/或化学特性的测定方法来检测抗原抗体反应。

认为本发明的抗体通过与IGF-I受体的CR结构域结合来激活下述受体：IGF-I受体形成二聚体而得的同型受体、或者IGF-I受体与INSR形成二聚体而得的异型受体。

本发明的抗体优选具有特定的氨基酸序列作为各CDR序列。具体如下。需要说明的是，在本发明中，氨基酸序列的“同一性”(Identity)意思是指一致的氨基酸残基的比例，“相似性”(Similarity)意思是指一致或类似的氨基酸残基的比例。相似性和同一性例如可通过BLAST法(NCBI的PBLAST的默认条件)来确定。

这里，“类似的氨基酸残基”意思是指具有具同样的化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链的氨基酸残基。作为类似的氨基酸残基，例如可列举以下的组合。

1) 具有脂族侧链的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸残基；

2) 具有脂族羟基侧链的氨基酸残基：丝氨酸和苏氨酸残基；

3) 具有含酰胺的侧链的氨基酸残基：天冬酰胺和谷氨酰胺残基；

4) 具有芳族侧链的氨基酸残基：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基；

5) 具有碱性侧链的氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基；

6) 具有酸性侧链的氨基酸残基：天冬氨酸和谷氨酸残基；

7) 具有含硫侧链的氨基酸残基：半胱氨酸和蛋氨酸残基。

在本发明中，作为重链可变区的CDR-1(CDR-H1)序列，优选SEQ ID NO: 1(SerTyrTrpMetHis)、或SEQ ID NO: 1的任意1处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。另外，重链可变区的CDR-H1序列优选与SEQ ID NO: 1具有80%以上的相似性(优选为同一性)。

作为重链可变区的CDR-2(CDR-H2)序列，优选SEQ ID NO: 2 (GluThrAsnProSerAsnSerValThrAsnTyrAsnGluLysPheLysSer)、或SEQ ID NO: 2的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。另外，重链可变区的CDR-H2序列优选与SEQ ID NO: 2具有88%以上、其中94%的相似性(优选为同一性)。

作为重链可变区的CDR-3(CDR-H3)序列，优选SEQ ID NO: 3(GlyArgGlyArgGlyPheAlaTyr)、或SEQ ID NO: 3的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。另外，重链可变区的CDR-H3序列优选与SEQ ID NO: 3具有75%以上、其中87%以上的相似性(优选为同一性)。

作为轻链可变区的CDR-1(CDR-L1)序列，优选SEQ ID NO: 4 (ArgAlaSerGlnAsnIleAsnPheTrpLeuSer)、或SEQ ID NO: 4的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。另外，轻链可变区的CDR-L1序列优选与SEQ ID NO: 4具有81%以上的相似性、其中90%以上的相似性(优选为同一性)。

作为轻链可变区的CDR-2(CDR-L2)序列，优选SEQ ID NO: 5(LysAlaSerAsnLeuHisThr)、或SEQ ID NO: 5的任意1处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。另外，轻链可变区的CDR-L2序列优选与SEQ ID NO: 5具有85%以上的相似性(优选为同一性)。

作为轻链可变区的CDR-3(CDR-L3)序列，优选SEQ ID NO: 6(LeuGlnGlyGlnSerTyrProTyrThr)、或SEQ ID NO: 6的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。另外，轻链可变区的CDR-L3序列优选与SEQ ID NO: 6具有77%以上、其中88%以上的相似性(优选为同一性)。

特别是，本发明的抗体优选具有以下的CDR序列的组合。作为CDR-H1序列的SEQ IDNO: 1的氨基酸序列、作为CDR-H2序列的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列、作为CDR-H3序列的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列、作为CDR-L1序列的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列、作为CDR-L2序列的SEQ ID NO: 5的氨基酸序列、和作为CDR-L3序列的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。

需要说明的是，作为鉴定抗体中的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3的各序列的方法，例如可列举：Kabat法(Kabat等人, The Journal of Immunology,1991, 第147卷, No.5, 第1709-1719页)或Chothia法(Al-Lazikani等人, Journal ofMolecular Biology, 1997, 第273卷, No.4, 第927-948页)。这些方法对于该领域的技术人员而言是技术常识，例如还可由Dr. Andrew C.R. Martin‘s Group的互联网主页(http://www.bioinf.org.uk/abs/)获悉概要。

作为本发明的抗体的免疫球蛋白的构架序列优选为人的免疫球蛋白的各类中的构架序列。

本发明的抗体优选具有特定的氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区。具体如下。需要说明的是，在本公开中，只要没有特别说明，则“1处或多处”是指1处、2处、3处、4处、5处、6处、7处、8处、9处或10处中的任一者。

作为本发明的抗体的重链可变区，优选SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 7的任意1处或多处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO: 7具有90%以上的相似性(优选为同一性)的氨基酸序列。另外，作为本发明的抗体的轻链可变区，优选SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 8的任意1处或多处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列、或者与SEQ IDNO: 8具有90%以上的相似性(优选为同一性)的氨基酸序列。

特别是，本发明的抗体优选：具有SEQ ID NO: 7作为重链可变区，同时具有包含SEQ ID NO: 8、或SEQ ID NO: 8的第36位(Kabat编号：L36)由Tyr取代成Ala、Ser、Phe或Cys而得的氨基酸序列的序列(分别为SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ IDNO: 12)作为轻链可变区。

本发明的抗体的重链和轻链的各构架区和/或各恒定区的氨基酸序列例如可从人的IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的各类以及它们的突变体中选择。根据一例，本发明的抗体的重链恒定区为人的IgG4的重链恒定区。

本发明的抗体以IGF-I受体的CR结构域作为表位。优选的是，本发明的抗体与包含肽的表位或其附近结合，该肽具有与SEQ ID NO: 14(人IGF-I受体)的氨基酸编号308～319相当的氨基酸序列(ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet)。认为本发明的抗体通过与IGF-I受体的CR结构域结合来激活下述受体：IGF-I受体形成二聚体而得的同型受体、或者IGF-I受体与INSR形成二聚体而得的异型受体。然而，后述的本发明的激动剂抗体(作为激动剂抗体的本发明的抗体)对INSR不具有结合性，该INSR与IGF-I受体的一级结构(氨基酸序列)和高级结构具有高的类似性。

本发明的抗体包括激动剂抗体和拮抗剂抗体这两者(以下，为方便起见，将作为激动剂抗体的本发明的抗体称为“本发明的激动剂抗体”，为方便起见，将作为拮抗剂抗体的本发明的抗体称为“本发明的拮抗剂抗体”)。本发明的激动剂抗体在单独作用的情况下，具有使基于IGF-I的成肌细胞的增殖活性亢进的作用。另一方面，本发明的拮抗剂抗体在与IGF-I同时作用的情况下，具有抑制基于IGF-I的成肌细胞的增殖活性的作用。

本发明的激动剂抗体优选为人IgG类或其突变体，优选为人IgG4亚类或其突变体、或者人IgG1亚类或其突变体。在1个例子中，稳定化IgG4恒定区根据Kabat的系统在铰链区的位点241包含脯氨酸。根据EU编号方式(Kabat等人, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, DIANE Publishing, 1992, Edelman等人, Proc. Natl.Acad. Sci USA, 63, 78-85, 1969)，该位点对应于铰链区的位点228。在人IgG4中，该残基通常为丝氨酸，通过由丝氨酸取代成脯氨酸，可诱导稳定化。在1个例子中，可在IgG1的恒定区插入N297A突变，以尽量抑制与Fc受体的结合和/或固定补体的能力。

本发明的激动剂抗体与IGF-I受体的特异性的结构域强力结合，在体外具有成肌细胞的增殖活性的亢进作用。

另外，本发明的激动剂抗体具有下述特征：不具有在体外的分化肌细胞的葡萄糖摄取亢进作用。具体而言，本发明的激动剂抗体即使在使成肌细胞(例如，来自人或豚鼠的成肌细胞)的增殖活性亢进的作用浓度、更优选为比作用浓度高10倍的浓度、进一步优选为高100倍的浓度下，也不具有在体外的培养分化肌细胞的葡萄糖摄取亢进作用。

另外，本发明的激动剂抗体还具有下述特征：在显示肌肉量增加作用的剂量下不具有降血糖作用。IGF-I在以显示肌肉量增加作用的剂量进行给予的情况下具有显著的降血糖作用。然而，本发明的激动剂抗体在诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的剂量下不具有使该脊椎动物的血糖值降低的作用。优选的是，本发明的激动剂抗体即使在以达到诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的有效剂量的10倍以上的血中暴露量的方式进行给予的情况下，也不具有使脊椎动物的血糖值降低的作用。

而且，本发明的激动剂抗体在对豚鼠进行单次给予的情况下，具有与持续给予IGF-I时的肌肉量增加作用同等程度的体内活性。另外，本发明的激动剂抗体的血中半衰期长，通过对动物单次给予显示肌肉量增加作用。

由以上可知：本发明的激动剂抗体有可能成为以IGF-I所期待的、废用性肌肉萎缩和侏儒症等与IGF-I受体相关的各种疾病的治疗药或预防药，可克服作为IGF-I的问题的降血糖作用，延长血中半衰期。

另一方面，本发明的拮抗剂抗体具有抑制IGF-I与IGF-I受体结合的作用。

本发明的拮抗剂抗体的一个方案为：激活IGF-I受体但抑制IGF-I对IGF-I受体的作用的抗体。这种情况下，该抗体具有消除IGF-I的协同的激动剂活性、例如基于IGF-I的成肌细胞的增殖诱导活性的作用。

本发明的拮抗剂抗体的另一方案为：与IGF-I受体结合但不激活IGF-I受体的抗体。作为不会因这样的IGF-I受体的交联而发生激活的拮抗剂抗体的例子，有Fab、scFv等抗原结合性为1价的抗体、如双特异性抗体这样虽具有2价的结合位点但仅其单侧的结合位点与IGF-I受体的特异性结构域结合的抗体、或者利用接头等改变2价的结合位点的距离而得的抗体等。然而，本方案的拮抗剂抗体并不限于这些。

本发明的拮抗剂抗体中，关于与IGF-I受体结合但不具有激动剂活性的方案的抗体，通过测定抗体与IGF-I受体的抗原抗体反应的方法可确认对IGF-I受体具有结合性，通过成肌细胞等细胞中的细胞增殖试验可确认不具有细胞增殖的诱导活性。

另外，本发明的拮抗剂抗体对在体外的分化肌细胞的葡萄糖摄取或在体内的血糖值没有影响。因此，本发明的拮抗剂抗体有可能以不显示高血糖等副作用的抗IGF-I受体人源化抗体的形式，成为乳腺癌、大肠癌、肉瘤、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨髓瘤等恶性肿瘤等的治疗药或预防药。

本发明的抗体优选对其他脊椎动物的IGF-I受体具有交叉反应。交叉反应是指抗体对不同于其抗体进行抗原抗体反应的IGF-I受体的动物种(例如人)的其他动物种的抗原显示结合性。优选与除其抗体进行抗原抗体反应的IGF-I受体的动物种以外的人或非人动物的IGF-I受体具有交叉反应性，该非人动物包括豚鼠、猴、兔、牛、猪、马、羊(绵羊)、狗或鸡。在后述的实施例4中显示出：作为抗IGF-I受体人源化抗体的R11-16B与人IGF-I受体的CR结构域中的ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet的序列结合。在猴(食蟹猴)、兔、豚鼠、牛、羊、马和狗的IGF-I受体的相同部分中，该ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet的序列被保守，与这些种间的IGF-I受体具有结合交叉性。另外，在小鼠和大鼠中，该相同部分的氨基酸序列成为ProSerGlyPheIleArgAsnSerThrGln SerMet，通过获取与该部分结合的抗IGF-I受体抗体，可获取与小鼠或大鼠等的IGF-I受体结合、并与R11-16B具有同样性状或功能的抗体。

另外，通过使用不与本发明的抗体进行交叉反应的动物的物种，以基因工程学方式对其细胞或动物进行修饰，也可制作表达与本发明的抗体进行交叉反应的IGF-I受体的细胞或动物。

本发明的一个方案中的抗IGF-I受体人源化抗体具有来自脊椎动物的细胞的增殖诱导活性。虽然已经知道IGF-I受体激动剂抗体的存在，但尚无在原代培养细胞、其中在成肌细胞中显示细胞的增殖诱导活性的抗体的报道。而且，也没有在体外在低于IGF-I的EC

需要说明的是，在本公开中，“来自脊椎动物的细胞”优选为来自哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或鱼类的细胞，更优选为来自哺乳类或鸟类的细胞，更进一步优选为来自人、猴、兔、豚鼠、牛、猪、羊、马或狗的细胞。在来自这些物种的细胞中，如果是表达IGF-I受体、且本发明的抗体与该IGF-I受体进行交叉反应的细胞，则通过本发明的抗体可诱导细胞增殖。另外，本公开中的“来自脊椎动物的细胞”还包括：以表达与本发明的抗体具有交叉反应性的物种的IGF-I受体的方式进行了修饰的细胞或动物、或来自该修饰动物的细胞。

作为用于研究来自脊椎动物的细胞在体外的增殖诱导活性的细胞，可使用原代培养细胞、株化细胞、或这些细胞的转化体细胞(转化细胞)等。

在本公开中，“原代培养细胞”是指由生物的脏器或组织分离的细胞，该细胞通常能以某种程度的传代数进行传代培养。来自脊椎动物的原代培养细胞可通过酶处理、基于物理方法的分散或外植体法等方法由脊椎动物的脏器或组织得到。另外，还可使用由脊椎动物得到的脏器或组织、或它们的片段。作为调制这些该原代细胞的脏器或组织，可优选列举：甲状腺、甲状旁腺或肾上腺等内分泌组织；阑尾、扁桃体、淋巴结或脾脏等免疫组织；气管或肺等呼吸器官；胃、十二指肠、小肠或大肠等消化器官；肾脏或膀胱等泌尿器官；输精管、睾丸或前列腺等雄性生殖器官；乳房或输卵管等雌性生殖器官；心肌或骨骼肌等肌肉组织等，更优选为肝脏、肾脏或消化器官或肌肉组织等，更进一步优选为肌肉组织。作为用于研究本发明的抗体的增殖诱导活性的该原代培养细胞，使用表达IGF-I受体、且通过与其IGF-I受体结合的IGF-I诱导增殖的细胞。作为其代表，使用作为由肌肉组织分离的原代培养细胞的骨骼肌成肌细胞等。作为来自人或动物的原代培养细胞，还可获取分售或市售的细胞进行使用。人原代培养细胞例如可从ATCC

在本公开中，“株化细胞”是指来自生物的细胞被永生化而保持一定的性质，同时可半永久性地增殖的培养细胞。株化细胞中存在来自非肿瘤的细胞和来自肿瘤的细胞。作为用于研究本发明的抗体的增殖诱导活性的来自脊椎动物的株化细胞，使用表达IGF-I受体、且通过与其IGF-I受体结合的IGF-I诱导增殖的细胞。作为表达IGF-I受体、且通过IGF-I诱导细胞增殖的株化细胞，例如有人成神经细胞瘤SH-SY5Y、人表皮角化细胞株HaCaT、人肺泡基底上皮腺癌细胞株A549、人结肠腺癌细胞株Caco-2、来自人肝癌的细胞株HepG2、人宫颈部癌细胞株Hela、人宫颈部癌细胞株SiHa、人乳腺癌细胞株MCF7、人多能性胚胎癌NTERA-2或人骨肉瘤细胞株U-2-OS等，但并不限于这些。

在本公开中，作为可用于研究本发明的抗体的增殖诱导活性的转化体细胞，可列举：上述的原代培养细胞或株化细胞的转化体细胞。作为这样的转化细胞的一例，可列举由原代培养细胞制作的iPS细胞、或由其iPS细胞分化诱导的细胞或组织等。另外，作为其他的转化细胞的例子，向原代培养细胞或株化细胞中导入基因并使其一过性或持续地表达而得的细胞也包括在该转化细胞中。作为导入至该细胞并使其表达的基因，可包含人或其他物种的IGF-I受体的基因。

作为研究本发明的抗体在来自脊椎动物的细胞中诱导细胞增殖活性的方法，可列举：细胞数计测、DNA合成量的测定、代谢酶活性的变化量的测定等。细胞数计测的方法有使用血球计算盘的方法或使用库尔特计数器等细胞数计测装置的方法，作为测定DNA合成量的方法，有基于[3H]-胸苷或5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的摄取的测定方法，作为观察代谢酶活性的变化量的方法，有MTT法、XTT法或WST法等，如果是本领域技术人员，也可利用其他适当的方法等来实施。

细胞的增殖诱导活性可通过在使本发明的抗体与用于试验的培养细胞反应的情况下细胞的增殖较不使该抗体反应的情况下有所上升来判定。这种情况下，作为该诱导活性的对照，若在相同条件下进行使本来的IGF-I受体的配体即IGF-I反应的测定，则便于评价其活性。在变更本发明的抗体和IGF-I的各自的浓度后使之与进行试验的培养细胞反应时，将显示最大增殖诱导活性的50%时的浓度表示为EC

作为研究来自脊椎动物的细胞在体内的增殖诱导活性的方法，可对该脊椎动物给予本发明的抗体，计测被给予的整个个体或被给予的个体中的脏器或组织的重量、大小、细胞数等的变化，或者，使用移植有该脊椎动物细胞的动物，在接受了该移植的个体中计测包含该被移植的脊椎动物细胞的移植片的重量、大小、细胞数等的变化，从而进行研究。在整个个体的计测中，测定体重、身长、四肢周长等，或者根据阻抗法测定体组成，采用肌酸酐、身长(身高)系数等。关于个体中的脏器或组织、或移植片的计测，对于人以外的动物是直接回收目标脏器、组织或移植片，进行重量、大小或所含的细胞数的计算等。另外，作为非侵袭性地计测个体的脏器、组织或移植片的方法，采用基于X射线摄影图像或CT、MRI的影像分析、使用基于同位素或荧光物质的示踪物的造影法等。在作为对象的组织为骨骼肌的情况下，肌肉力量的变化等成为指标。此外，如果是本领域技术人员，则可通过采用其他适当的方法研究本发明的抗体对来自脊椎动物的细胞在体内的增殖诱导活性的作用。为了研究本发明的抗体在体内对来自脊椎动物的细胞的增殖诱导活性，可在给予了本发明抗体的个体、与给予了除本发明抗体以外的抗体或其他对照物质的个体之间，按照以上所示的方法等进行计测等，比较所得的计测结果，从而进行评价。

本发明的抗体具有下述特征：与天然型IGF-I相比，其增殖诱导作用的持续性相对于与细胞接触的时间而言更长。在体外的细胞增殖诱导活性中，天然型IGF-I在与细胞接触后，若用不含IGF-I的培养基进行洗涤，则细胞增殖诱导活性消失，相对于此，作为本发明抗体的设计基础的小鼠抗体即IGF11-16抗体(日本专利申请：特愿2017-106529)即使在与细胞接触后用不含IGF11-16抗体的培养基进行洗涤的情况下，细胞的增殖诱导活性也会持续。另外，在后述的实施例8中，将IGF-I和本发明的抗体即R11-16B抗体的血中动力学进行了比较，天然型IGF-I在对动物给予后24小时为止有约50%以上从血中消失，相对于此，R11-16B抗体即使在对动物给予后的48小时后也有60%以上存在于血中，由此显示出：R11-16B抗体长期存在于血中。由这些结果可知：本发明的抗体在体外和体内均显示长的细胞增殖诱导效果。

另外，作为本发明的抗体在体内的效果，可列举：肌肉量和/或身长的增加效果。IGF-I在骨骼肌中除了对上述的成肌细胞的增殖或分化起作用以外，还具有加粗肌纤维的作用，作为这样的综合性作用，认为有增加肌肉量的效果。本发明的抗体也和IGF-I同样，通过对动物给予而具有增加该动物的肌肉量的效果。作为IGF-I受体激动剂抗体的作用，是本发明的抗体第一次显示了在体内具有肌肉的增加作用。

作为计测本发明抗体的肌肉量的增加效果的方法，在整个个体的计测中，测定体重、身长、四肢周长等，或者根据阻抗法测定体组成，采用肌酸酐、身长(身高)系数等，另外还采用基于CT、MRI的影像分析、使用基于同位素或荧光物质的示踪物的造影法等方法，除此之外，肌肉力量的变化等也成为指标。另外，在人以外的动物中，还可以是直接采集肌肉并计测其重量或大小的方法等。肌肉量的增加效果可通过在给予了本发明抗体的个体与未给予该抗体的个体中比较肌肉量的增加、或者在一个个体中在给予本发明抗体之前和给予之后比较肌肉量来进行评价。关于肌肉量的增加效果，如果通过给予本发明的抗体而发现了肌肉量增加的差异，则可知晓其效果，但通过确认在给予了本发明抗体的个体与未给予该抗体的个体中、或者在给予本发明抗体之前和之后优选103%以上、更优选104%以上的肌肉量的差异，可判断通过给予本发明的抗体而产生的效果。IGF-I还参与骨骼的生长，还具有增加身长(在人的情况下为身高)的作用。因此，本发明的抗体也具有通过对动物给予而使身长增加的效果。本发明的抗体的身长增加效果可通过测定个体的体重、身长、四肢周长等来计测。

根据一个方案，本发明的抗体具有下述特征：对来自脊椎动物的分化肌细胞中的细胞内的葡萄糖摄取作用和/或脊椎动物中的血糖值没有影响。已知IGF-I会引起细胞内的葡萄糖摄取亢进或血糖值的降低作用，作为对IGF-I受体的激动剂作用的一部分。然而，作为IGF-I受体激动剂抗体起作用的本发明的激动剂抗体具有意料之外的效果、即显示下述特征：即使在来自脊椎动物的细胞中的增殖诱导活性的在体外的EC

作为用于研究本发明的抗体所具有的、对来自脊椎动物的细胞在体外的向细胞内的葡萄糖摄取没有影响的特征的细胞，可使用原代培养细胞、株化细胞、或这些细胞的转化体细胞等。需要说明的是，关于本公开中的原代培养细胞、株化细胞和转化体细胞均如上所述。

作为研究在来自脊椎动物的细胞中本发明的抗体对葡萄糖摄取的影响的方法，可列举：细胞内葡萄糖浓度的测定、葡萄糖类似示踪物质的细胞内摄取量的测定、葡萄糖转运蛋白的变化的测定等。葡萄糖浓度的测定方法有酶法等吸光度测定法，作为测定葡萄糖类似示踪物质的细胞内摄取量的方法，有[3H]-2’-脱氧葡萄糖的摄取量的测定，作为观察葡萄糖转运蛋白的变化的方法，有细胞免疫染色法、蛋白质印迹法等，如果是本领域技术人员，也可通过其他适当的方法等来实施。对细胞内的葡萄糖摄取的影响可通过在使本发明的抗体与用于试验的培养细胞反应的情况下向细胞内的葡萄糖摄取与不使该抗体反应的情况下为同等程度来判定。这种情况下，作为该诱导活性的对照，若在相同条件下进行使本来的IGF-I受体的配体即IGF-I反应的测定，则便于评价其活性。

在变更本发明的抗体和IGF-I的各自的浓度后使之与进行试验的培养细胞反应时，以未处置组(未治疗组)的向细胞内的葡萄糖摄取为100%的情况下的葡萄糖摄取量的形式显示。在使用人分化肌细胞来评价葡萄糖摄取量的情况下，优选本发明的抗体的葡萄糖摄取量为同一浓度的IGF-I的葡萄糖摄取量以下，更优选本发明的抗体的葡萄糖摄取量为未处置组的110%以下，进一步优选本发明的抗体的葡萄糖摄取量为与未处置组同等的100%。另外，在使用人分化肌细胞来评价葡萄糖摄取量的情况下，添加了100nmol/L的本发明抗体的情况下的葡萄糖摄取量优选为110%以下、更优选为105%以下、进一步优选为95～100%。

作为研究来自脊椎动物的细胞在体内的葡萄糖摄取的方法，可通过对该脊椎动物给予本发明的抗体，再计测被给予的个体中的脏器或组织中的葡萄糖含量等的变化来研究。在整个个体的计测中，采用血糖值等的测定、或以糖化蛋白为指标的血红蛋白A1C等。在个体中的脏器或组织中的葡萄糖摄取量等的测定中，对人以外的动物直接回收目标脏器或组织，进行葡萄糖含量或示踪物的计算等。另外，作为非侵袭性地测定个体的脏器或组织中的葡萄糖摄取的方法，采用X射线撮影图像或基于CT、MRI的影像分析、使用基于同位素或荧光物质的示踪物的造影法等。在作为对象的组织为骨骼肌的情况下，葡萄糖钳夹等也成为指标。此外，如果是本领域技术人员，则可通过采用其他适当的方法，研究本发明的抗体对来自脊椎动物的细胞在体内的葡萄糖摄取的影响。

另外，本发明的抗体的特征还在于：在对脊椎动物给予的情况下，即使在相对于诱导该脊椎动物的肌肉量增加的有效剂量为同一剂量、优选10倍以上的剂量下，也不会改变该脊椎动物的血糖值。作为用于研究本发明的抗体在脊椎动物中的血糖值的变化的动物，优选为属于哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或鱼类的动物，更优选为属于哺乳类或鸟类的动物，更进一步优选为人、猴、兔、豚鼠、牛、猪、羊、马或狗。另外，用于研究本发明的抗体在脊椎动物中的血糖值的变化的动物还包括：以表达与本发明的抗体具有交叉反应性的物种的IGF-I受体的方式进行了修饰的动物。在血糖值的测定中，作为观血的方法，采用比色法或电极法等，用于检测的酶有葡萄糖氧化酶法(GOD法)、葡萄糖脱氢酶法(GDH法)等，作为非观血的方法，有光学测定法等，如果是本领域技术人员，则还可选择其他适当的方法。在为人的血糖值的情况下，空腹时血糖值的正常范围是100mg/dL～109mg/dL。因给予药剂而对血糖值造成的不良事件(不良事件通用术语标准v4.0)定义如下：将血糖值为低于77mg/dL～55mg/dL的范围的值的情况定义为低血糖，将血糖值为高于109mg/dL～160mg/dL的范围的值的情况定义为高血糖。通过给予药剂对血糖值没有影响是指，给予药剂后的血糖值为大于55mg/dL且小于160mg/dL的范围内，更优选为大于77mg/dL且小于109mg/dL的范围内。然而，血糖值的正常值或其变动幅度根据给予的动物而不同，另外，即使是人，给予时的血糖值也未必限于正常值的范围，所以本公开中不改变脊椎动物的血糖值是指给予了本发明抗体的脊椎动物的血糖值优选为30%以内、更优选为20%以内、进一步优选为10%以内的变化。

本发明的抗体可通过将抗IGF-I受体的小鼠单克隆抗体IGF11-16(小鼠IGF11-16抗体、日本专利申请：特愿2017-106529)进行人源化而获取。这样的人源化抗体的获取方法的例子记载在后述的实施例1中，作为由此得到的人源化抗体，可列举：具有SEQ ID NO: 7的VH氨基酸序列、SEQ ID NO: 8、9、10、11或12的VL氨基酸序列的人源化抗体(R11-16B、R11-16C、R11-16D、R11-16E或R11-16F)。然而，本发明的抗体并不限于这些。

关于所得的抗IGF-I受体人源化抗体，还可得到具有编码其抗体的蛋白的氨基酸的核苷酸序列的核酸分子，也可使用这样的核酸分子以基因工程学方式制作抗体。对于该抗体的基因信息中的H链、L链、或它们的可变区，可参考CDR序列等的信息进行修饰等，以提高抗体的结合性或特异性。

作为制造本发明的抗体的方法，可分别培养导入了基因的哺乳细胞、昆虫细胞和大肠杆菌等，所述基因编码想要获取的抗体的蛋白的氨基酸，再通过常规方法从所得的培养上清中纯化抗体而获取。作为其具体方法，并不限于此，可例示如下所述的方法。

首先，使编码H链信号肽的核酸分子和编码H链恒定区的核酸分子与编码H链可变区的核酸分子结合来制作。使编码L链信号肽的核酸分子和编码L链恒定区的核酸分子与编码L链可变区的核酸分子结合来制作。

将这些H链基因和L链基因插入到适合在所选择的宿主细胞中表达的载体、例如克隆载体或表达用载体中。这里，H链基因和L链基因如果是两种基因进行表达的形式，则可插入到一个载体中，也可分别插入到不同的载体中。

接下来，插入有H链基因和L链基因的载体被导入到宿主细胞中。作为宿主细胞，例如可列举：哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、或植物细胞等真核细胞、或细菌细胞。作为向宿主细胞中导入基因的方法，可从下述方法中适当选择：磷酸钙或脂质转染法等化学方法、电穿孔法或粒子枪法等物理方法或基于病毒或噬菌体等感染的方法等。导入了H链基因和L链基因的宿主细胞可无需选择即用于培养，也可利用耐药性或营养需求性等性质选择性地浓缩导入了基因的重组体细胞、或者进一步用于培养由导入了基因的单一宿主细胞建立的克隆的重组体细胞。

导入了H链基因和L链基因的宿主细胞在适当的培养基和培养条件下进行培养。这里，在宿主细胞内表达的H链基因和L链基因的产物通常以抗体蛋白的形式分泌到培养基中，通过回收该培养基，可得到所产生的抗体蛋白。然而，利用基因与宿主的组合，在必要的情况下可选择破坏宿主细胞而回收细胞内蓄积的抗体蛋白，在原核细胞的情况下由还可选择从周质组分中回收抗体蛋白。作为由包含所回收的抗体蛋白的培养基等样品纯化抗体的方法，通常采用盐沉淀法、基于透析或超滤法等的浓缩或溶剂的交换、使用固定有蛋白A、蛋白G或抗原等的载体的亲和层析等，此外，还可适当采用离子交换层析、疏水层析、混合模式层析或尺寸排阻层析等方法进行纯化。用于这些步骤的各种方法均为本领域技术人员所已知。

这里，对于编码免疫球蛋白的重链和/或轻链的基因，进行基因修饰以导入所期望的性状、或者采用免疫球蛋白的重链和/或轻链的可变区或CDR区的结构信息，从而制作抗体嵌合蛋白、低分子抗体、支架抗体等，这可由本领域技术人员利用已知的技术来实施。另外，为了提高抗体的性能或避免副作用，而向抗体恒定区的结构中引入修饰、或者进行在糖链部分的修饰，这也可利用本领域技术人员所熟知的技术适当进行。

本发明的抗体可用作与IGF-I相关的状态或由对IGF-I受体的作用引起的疾病的治疗药或预防药。具体而言，作为与IGF-I相关的状态或使用IGF-I受体激动剂抗体进行治疗或预防的对象的疾病，可列举：肌肉萎缩性疾病(例如，废用性肌萎缩、肌肉减少症、恶病质等)、侏儒症(例如，Laron型侏儒症、生长激素抵抗性侏儒症等)、肝硬化、肝纤维化、糖尿病性肾病、慢性肾功能不全、衰老、子宫内胎儿发育迟缓(IUGR)、心血管保护、糖尿病、胰岛素抵抗性、代谢综合征、骨质疏松症、囊性纤维化、肌强直性营养不良、AIDS肌萎缩、HIV所伴随的脂肪重新分布综合征、克罗恩病、 Werner综合征、X-连锁性复合免疫缺陷、听力下降、神经性厌食症和早产儿视网膜病变、Turner综合征、Prader-Willi综合征、Silver-Russell综合征、特发性侏儒症、肥胖症、多发性硬化症、溃疡性大肠炎、低肌肉量、心肌缺血、低骨密度；作为使用IGF-I受体拮抗剂抗体进行治疗或预防的对象的疾病，可列举：成神经细胞瘤(神经母细胞瘤)、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、儿童癌症、肢端肥大症、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺肥大、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、颈部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、维尔姆斯氏瘤、与转移性类癌和血管活性肠肽分泌肿瘤相关的腹泻、血管活性肠肽瘤、Verner-Morrison综合征、Beckwith-Wiedemann综合征、肾癌、肾细胞癌、移行上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、白血病、急性成淋巴细胞白血病、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、非胶质母细胞瘤性脑肿瘤、脑脊膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤(髓母细胞瘤)、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、巨人症、干癣、动脉粥样硬化、血管平滑肌再狭窄、不适当的微小血管增殖、糖尿病性视网膜病变、格里夫氏症、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎和白塞病(Behcet’s disease)。特别是，本发明的抗体优选用作肌萎缩性疾病(例如，废用性肌萎缩、肌肉减少症、恶病质等)和/或侏儒症(例如，Laron型侏儒症、生长激素抵抗性侏儒症等)的治疗药或预防药。另外，本发明的抗体不会因其给予而引起血糖值的变化，在这方面优异。

含有本发明的抗体的药物可以以药物组合物的形式制成制剂，该药物组合物除了含有本发明的抗体以外还含有药学上可接受的载体和/或其他添加剂。使用了药学上可接受的载体和/或其他添加剂的制剂例如可按照University of the Sciences inPhiladelphia, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版”,Lippincott Williams & Wilkins, 2000中记载的方法进行实施。

作为这样的治疗药或预防药的一种形式，以在无菌的水性溶液或油性溶液中溶解、悬浮或乳化而调制的液体制剂或冷冻干燥制剂的形式进行供应。作为这样的溶剂或溶解液，作为水性溶液可列举注射用蒸馏水、生理盐水等，除此之外，在添加渗透压调节剂(例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)的情况下，有时也并用适当的助溶剂、例如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油50)等的情况。另外，作为溶剂或溶解液，有时还使用油性溶液，作为该油性溶液的例子，可列举：芝麻油、大豆油等，有时还并用苯甲酸苄酯、苄醇等作为助溶剂。在这样的制剂中，有时还适当使用缓冲剂(例如，磷酸盐类缓冲剂、乙酸盐类缓冲剂)、无痛化剂(镇痛剂) (例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如，抗坏血酸、异抗坏血酸和它们的盐等)、着色剂(例如，叶绿素铜、β-胡萝卜素、红色2号、蓝色1号等)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯、苯酚、苄索氯铵、苯扎氯铵等)、增稠剂(例如，羟丙基纤维素、羧甲基纤维素和它们的盐等)、稳定化剂(例如，人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇等)、矫臭剂(例如，薄荷醇、柑橘香料等)等添加剂。

作为其他形式，还可列举：用于粘膜应用的治疗药或预防药。在该制剂中，以对粘膜赋予吸附性、滞留性等为主要目的，有时还含有粘着剂、粘着增强剂、粘稠剂、粘稠化剂等(例如，粘蛋白、琼脂、明胶、果胶、角叉菜胶、海藻酸钠、刺槐豆胶、黄原胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、壳聚糖、普鲁兰多糖(Pullulan)、蜡质淀粉、硫糖铝、纤维素、及其衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷基酯共聚物、或其盐、聚甘油脂肪酸酯等)作为添加剂。然而，对生物体供给的治疗药或预防药的形式和溶剂或添加剂并不限于这些，本领域技术人员可适当选择。

含有本发明抗体的药物除了含有本发明的抗体以外，还可含有现有的其他药物(活性成分)。另外，可将含有本发明抗体的药物与现有的其他药物组合制成试剂盒的形式。作为与IGF-I受体激动剂抗体组合的活性成分，可列举：生长激素或其类似物、胰岛素或其类似物、IGF-II或其类似物、抗肌肉生长抑制素抗体、肌肉生长抑制素拮抗剂、抗激活素IIB型受体抗体、激活素IIB受体拮抗剂、可溶性激活素IIB型受体或其类似物、生长素释放肽或其类似物、卵泡抑素或其类似物、β2激动剂、和选择性雄激素受体调节剂。另外，作为与IGF-I受体拮抗剂抗体组合的活性成分，可列举：皮质类固醇、止吐药、盐酸昂丹司琼、盐酸格拉司琼、甲氧氯普胺(Metroclopramide)、多潘立酮、氟哌啶醇、赛克利嗪、劳拉西泮、丙氯拉嗪、地塞米松、左美丙嗪、托烷司琼、癌疫苗、GM-CSF抑制剂、GM-CSF DNA疫苗、基于细胞的疫苗、树状细胞疫苗、重组病毒疫苗、热休克蛋白(HSP)疫苗、同种肿瘤疫苗、自身肿瘤疫苗、镇痛药、布洛芬、萘普生、三水杨酸胆碱镁、盐酸羟考酮、抗血管生成药、抗血栓药、抗PD-1抗体、纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、抗PD-L1抗体、阿替利珠单抗(Atezolizumab)、抗CTLA4抗体、伊匹木单抗(Ipilimumab)、抗CD20抗体、利妥昔单抗(Rituximab)、抗HER2抗体、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、抗CCR4抗体、莫加莫珠单抗(Mogamulizumab)、抗VEGF抗体、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体片段、抗TWEAK抗体、抗TWEAK受体抗体、可溶性TWEAK受体片段、AMG 706、AMG 386、抗增殖药、法尼基蛋白转移酶抑制剂、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、Kit受体抑制剂、ret受体抑制剂、PDGFR抑制剂、生长激素分泌抑制剂、血管生成素抑制剂、肿瘤浸润巨噬细胞抑制剂、c-fms抑制剂、抗c-fms抗体、CSF-1抑制剂、抗CSF-1抗体、可溶性c-fms片段、培维索孟(Pegvisomant)、吉西他滨(Gemcitabine)、帕尼单抗(Panitumumab)、伊立替康(Irinotecan)和SN-38。作为所配合的除本发明抗体以外的药物的剂量，能够以用于通常治疗的剂量进行，也可根据状况进行增减。

本发明中的治疗药或预防药以改善症状为目的可进行胃肠外给予。在胃肠外给予的情况下，例如可制成经鼻剂，可选择液体制剂、悬浮剂、固体制剂等。另外，作为其他的胃肠外给予的形式，可制成注射剂，作为注射剂，可选择皮下注射剂、静脉注射剂、点滴注射剂、肌肉注射剂、脑室内注射剂或腹腔内注射剂等。另外，作为其他的用于胃肠外给予的制剂，还可列举：栓剂、舌下剂、经皮剂、除经鼻剂以外的经粘膜给予制剂等。而且，也能够以在支架或血管内栓塞剂中含有或涂布的方案进行血管内局部给予。

本发明中的治疗药或预防药的给予量根据患者的年龄、性别、体重、症状、治疗效果、给予方法、处理时间、或该药物组合物中所含的活性成分的种类等而不同，通常成人每人、每次可按0.1mg～1g的范围、优选0.5mg～300mg的范围给予主剂，每1周～4周给予1次、或者每1个月～2个月给予1次。然而，由于给予量和给予次数根据各种条件而变化，因此也有以少于上述给予量和次数的量和次数即足够的情况，另外，也有需要超过上述范围的给予量和给予次数的情况。

在用于使来自脊椎动物的细胞在体外维持、增殖和/或分化的细胞培养技术中大多使用IGF-I或其衍生物，以细胞培养用试剂的形式市售。IGF-I因稳定性的问题等，在长期培养中其效果有可能随着时间流逝而减弱，为了进行稳定的细胞培养，需要适当调节浓度等对策。另外，由于IGF-I诱导向细胞中摄取葡萄糖，所以有可能随着细胞内葡萄糖浓度的上升而诱导细胞的代谢或特性的变化、或者培养基中的葡萄糖浓度减少而使培养环境发生变化。本发明的抗体具有下述特征：与IGF-I相比稳定性高，与细胞接触后诱导细胞增殖的时间长，在低于IGF-I的浓度下显示细胞增殖诱导活性，并且，不诱导向细胞内的葡萄糖摄取。本发明的抗体除了在细胞培养中在其培养基中添加适量来使用以外，还可吸附或固定于进行培养的容器的固相上来使用，由此可削减使用量、或者对附着于固相上的细胞有效地进行细胞增殖诱导。需要说明的是，本公开中的来自脊椎动物的细胞如上所述。而且，作为使用了本发明抗体的培养的对象，还包括来自脊椎动物或其基因修饰动物的脏器或组织等。本发明的抗体可在用于使用了细胞的物质生产的培养、或使用细胞本身的细胞医疗/再生医疗中的培养工序中使用。

实施例

以下，列举实施例以更详细地说明本发明。但本发明并不受以下实施例的束缚，在不脱离本发明宗旨的范围内，能够以任意的方式实施。

作为利用Kohler等人(Nature, 256:495-497, 1975)的杂交瘤法进行制作而得到的抗IGF-I受体的小鼠单克隆抗体IGF11-16(小鼠IGF11-16抗体、日本专利申请：特愿2017-106529)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的互补性决定区(CDR)氨基酸的移植目的地的模板人抗体，从相对于小鼠IGF11-16抗体的VH、VL的构架区(FR)的氨基酸序列具有与它们的相似性高的氨基酸序列的人抗体的生殖细胞系列(Germline)中选择。

通过将小鼠IGF11-16抗体的VH和VL所需的氨基酸序列移植到上述的模板人抗体VH和VL的FR中，来制作人源化抗体。具体而言，关于VH，将上述的模板人抗体VH的CDR氨基酸序列和FR氨基酸的多处用小鼠IGF11-16抗体的VH中的对应的氨基酸序列取代，设计将小鼠IGF11-16抗体进行人源化而得的VH即R11-16VH的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)，再设计编码它们的氨基酸的DNA的核苷酸序列。

关于VL，将上述的模板人抗体VL的CDR氨基酸序列和FR氨基酸的多处取代成小鼠IGF11-16抗体的VL中的氨基酸序列，设计了将小鼠IGF11-16抗体进行人源化而得的VL即R11-16VL的氨基酸序列。

关于R11-16VL的第36位的氨基酸，在小鼠IGF11-16抗体中为半胱氨酸，但在普通的人抗体中，该位置较少存在半胱氨酸，形成本来不会产生的二硫键，认为其成为聚集的原因，因此设计第36位的氨基酸由半胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸构成的5种R11-16VL、即R11-16VL-C36、R11-16VL-C36Y、R11-16VL-C36A、R11-16VL-C36S、R11-16VL-C36F的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO: 11)，再设计编码它们的氨基酸的DNA的核苷酸序列。各人源化抗体的结构及其氨基酸见下述的表1。

[表1]

分别合成编码所设计的人源化抗体的重链可变区R11-16VH的DNA和编码将人IgG4亚类稳定化而得的突变体即人IgG4S228P突变体的DNA，插入到pCAGGS1系表达载体中进行连接，作为表达人源化抗体重链的质粒。

关于所设计的人源化抗体的轻链可变区R11-16VL，合成编码连接有κ链恒定区的人源化抗体轻链区的DNA，插入到pCAGGS1系表达载体中，作为表达人源化抗体轻链的质粒。

混合这些人源化抗体重链表达质粒和人源化抗体轻链表达质粒，并利用Expi293

为了研究IGF-I受体激动剂抗体对人(SEQ ID NO: 14、NP_000866)、豚鼠(SEQ IDNO: 16、XP_003475316)、食蟹猴(SEQ ID NO: 18、XP_005560575)和大鼠(SEQ ID NO: 20、NP_434694)的IGF-I受体的结合活性，使用使各种IGF-I受体表达而得的细胞来实施CellELISA。

利用脂质转染法向HEK293T细胞中导入插入有人(SEQ ID NO: 15)、豚鼠(SEQ IDNO: 17)、食蟹猴(SEQ ID NO: 19)和大鼠(SEQ ID NO: 21)的IGF-I受体基因的pEF1表达载体(Thermofisher)。将在脂质转染后培养了一夜以上的HEK293T细胞以4×10

在ELISA中，向各孔中添加100μL用1%BSA/1%FBS/PBS调制成2nM的各人源化抗体溶液，在37℃下反应约1小时。用洗涤液洗涤3次。向各孔中添加100μL用1%BSA/1%FBS/PBS调制成各浓度的抗人IgG抗体HRP缀合物溶液，在37℃下反应约1小时，用洗涤液洗涤3次。在各孔中添加100μL底物(TMB)，以引发反应。在约30分钟后，向各孔中添加100μL的1M硫酸，测定450nm和650nm的吸光度，算出吸光度450-650nm。以相对于未导入IGF-I受体基因的HEK293T细胞(对照细胞)的吸光度450-650nm的值为1，算出结合活性。结果见下述的表2。

[表2]

在使人、食蟹猴和豚鼠的IGF-I受体表达而得到的细胞中，与对照细胞(HEK293T)相比，各人源化抗体使结合活性上升至3倍以上。另一方面，对表达大鼠的IGF-I受体的细胞的结合活性与对照细胞同等。由此显示出：各人源化抗体与人、食蟹猴和豚鼠的IGF-I受体结合，但不与大鼠的IGF-I受体结合。

R11-16B与人、食蟹猴和豚鼠的IGF-I受体结合，但不与大鼠的IGF-I受体结合。另外，作为R11-16B的设计基础的小鼠抗体(日本专利申请：特愿2017-106529)即小鼠IGF11-16抗体与人IGF-I受体的CR结构域结合，但不与大鼠的IGF-I受体结合。由此推测到：R11-16B的表位是IGF-I受体的CR结构域的氨基酸序列中与人、食蟹猴和豚鼠共通但不同于大鼠的氨基酸序列。

为了确定R11-16B是与人IGF-I受体的CR结构域的哪个部位的氨基酸结合，通过ELISA测定了CR结构域对各种氨基酸取代体的结合性。使用使CR结构域中的推测与R11-16B结合的氨基酸序列突变而得的IGF-I受体表达的细胞来实施Cell ELISA。

CR结构域的各种氨基酸取代体使用以下的2种。另外，作为阳性对照，使用在pEF1表达载体(Thermofisher)中插入有DNA (SEQ ID NO: 22)的氨基酸取代体，该DNA编码在野生型的人IGF-I受体(SEQ ID NO: 14、NP_000866)的C末端结合有FLAG标记物(标签)(AspTyrLysAspAspAspAspLys)的氨基酸序列。以仅处置pEF1表达载体而得的细胞作为Mock。

(CR结构域的取代体1)

将人IGF-I受体(SEQ ID NO: 14、NP_000866)的氨基酸序列的第245位、第247位和第294位的天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸分别取代成天冬酰胺、苏氨酸和天冬氨酸。将DNA(SEQ ID NO: 23)插入到pEF1表达载体中，该DNA编码在该取代体1受体的氨基酸序列的C末端结合有FLAG标记物的氨基酸序列。

(CR结构域的取代体2)

将人IGF-I受体(SEQ ID NO: 14、NP_000866)的氨基酸序列的第315位和第316位的甘氨酸和丝氨酸分别取代成丝氨酸和苏氨酸。在pEF1表达载体中插入DNA (SEQ ID NO:24)，该DNA编码在该取代体2受体的氨基酸序列的C末端结合有FLAG标记物的氨基酸序列。

将293T细胞以6×10

在ELISA中，在各孔中添加50μL用封闭缓冲液调制成5nM的R11-16B，室温下反应约1小时。用洗涤液洗涤2次。在各孔中添加50μL用封闭缓冲液稀释至2500倍的抗人IgG抗体ALP缀合物溶液(2087-04、Southern Biotech)，在室温下反应约1小时。用洗涤液洗涤3次。在各孔中添加100μL底物(pNPP)，以引发反应。在约1小时后测定405nm和550nm的吸光度。以从R11-16B处置组中减去未处置组的值而得的差值作为结合活性，进行评价。结果见下述的表3。

[表3]

与Mock相比，R11-16B对人IGF-I受体的结合活性亢进了(提高了) 2倍以上。另外，对取代体1的结合活性与其对人IGF-I受体的结合活性同等。另一方面，对取代体2的结合活性与Mock同等，未确认到结合活性的亢进。由此显示出：在R11-16B对人IGF-I受体的结合活性中，IGF-I受体的第315位和第316位的氨基酸较为重要。

由以上的结果推测到：R11-16B对人IGF-I受体的结合位点是在第315位和第316位的Gly (甘氨酸)与Ser (丝氨酸)的附近。由通常基于抗体的识别序列数为8个残基(6～10个残基的平均值)的氨基酸、以及R11-16B的交叉反应性(对大鼠的IGF-I受体没有结合性、而对人和豚鼠的IGF-I受体具有结合性)认为：人IGF-I受体对R11-16B的结合位点的序列是ProSerGlyPheIleArgAsnGly

为了研究IGF-I受体激动剂抗体对人成肌细胞的增殖活性，在人成肌细胞中添加药剂，测定4天后的细胞内的ATP量。

使用在SkBM-2(Lonza、CC-3246)中包含1%BSA的培养基，将正常人骨骼肌成肌细胞(Human Skeletal Muscle Myoblast Cells、HSMM、Lonza)以0.1mL/孔(2×10

[表4]

0.0000005、0.000005、0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、5和50nM的R11-16B使人成肌细胞的增殖活性浓度依赖性地亢进。R11-16B、小鼠IGF11-16抗体和IGF-I的成肌细胞增殖活性的EC

[表5]

0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、5和50nM的R11-16B、R11-16C、R11-16D、R11-16E、R11-16F使人成肌细胞的增殖活性浓度依赖性地亢进。R11-16B、R11-16C、R11-16D、R11-16E和R11-16F的人成肌细胞增殖活性的EC

[表6]

与对照抗体(FLAG M2、Sigma-Aldrich)相比，IGF-I使细胞增殖活性亢进。

非专利文献35中记载的16-13抗体和26-3抗体(显示出具有在体外的细胞的DNA合成和葡萄糖摄取的亢进作用的激动剂抗体)与溶剂对照(包含叠氮化钠)相比没有确认到显著的细胞增殖活性，较R11-16B的活性弱。

为了确认IGF-I受体激动剂抗体在体内的药效，与持续给予IGF-I时的作用进行比较。

对豚鼠单次给予R11-16B，测定2周后的肌肉量。肌肉量增加作用是指与对照组相比使豚鼠的肌肉重量增加5%以上。向正常豚鼠的静脉内单次给予R11-16B (0.1和0.3mg/kg)。作为阳性对照，使用渗透压泵(Alzet)将人重组IGF-I (美卡舍明)埋入皮下，持续给予使达到0.3和1mg/kg/天。在给予药剂的2周后，将豚鼠在麻醉下放血致死，测定趾长伸肌的重量。结果见图2。

与仅处置溶剂的对照组(溶媒)相比，静脉内给予0.1和0.3mg/kg的R11-16B的组(R11-16B)剂量依赖性且显著地使肌肉量增加。

R11-16B的0.3mg/kg的单次给予组的肌肉增加量与以1mg/kg/天持续给予人重组IGF-I的组(IGF-I)为同等程度。由此显示出：R11-16B通过单次给予与IGF-I的持续给予具有同等的药效。临床中IGF-I (美卡舍明)的用法剂量为1天1次～2次。另一方面，在体内R11-16B通过每2周给予1次显示与IGF-I的持续给予同等的有效性，由此显示出：其持续性较IGF-I优异。

为了确认IGF-I受体激动剂抗体在体内有无降血糖作用，对豚鼠单次给予R11-16B，经时性地测定血糖值，与IGF-I的单次给予时的降血糖作用进行比较。降血糖作用是指使血糖值下降至50mg/dL以下、或者产生低血糖症状的作用。

研究了IGF-I的降血糖作用。使豚鼠禁食12小时，将人重组IGF-I (美卡舍明)以0.3、1、3和10mg/kg进行单次皮下给予。使豚鼠禁食至给予24小时后。对清醒状态的豚鼠于给予前(0小时)、给予1、2、4、8和24小时后进行采血，使用Glutest传感器(三和化学研究所)测定血糖值。结果见下述的表7。

[表7]

IGF-I自0.3mg/kg起使血糖值显著地降低，在1mg/kg以上则确认到低血糖症状，在3mg/kg以上则确认到死亡例。

研究了R11-16B、R11-16C、R11-16D、R11-16E和R11-16F对血糖值的影响。使豚鼠禁食12小时，将各人源化抗体以10mg/kg进行单次静脉内给予。使豚鼠禁食至给予24小时后。对清醒状态的豚鼠于给予前(0小时)、给予1、2、4、8和24小时后进行采血，使用Glutest传感器(三和化学研究所)测定血糖值。结果见下述的表8～表10。

[表8]

[表9]

[表10]

各人源化抗体与只给予了溶剂的溶剂对照组相比在血糖值上没有确认到显著差异，给予后的血糖值均为50mg/dL以上。由此可知：各人源化抗体不具有IGF-I那样的显著的降血糖作用，对血糖值没有影响，因此显示出作为克服IGF-I的副作用即低血糖的药剂的可能性。

使豚鼠禁食12小时，将人重组IGF-I以0.3、1、3和10mg/kg进行皮下给予。使豚鼠禁食至给予24小时后。对清醒状态的豚鼠于给予前(0小时)、给予1、2、4、8、10和24小时后进行采血，通过ELISA (DG100、R&D)测定血浆中的人IGF-I浓度。结果见图3。

血浆中的IGF-I浓度依赖于给予剂量而上升，给予24小时后的血浆中的IGF-I浓度下降至峰值时的约50%以下。0.3mg/kg给予组的给予24小时后的IGF-I浓度为测定下限以下。另外，10mg/kg给予组在给予4小时以后因低血糖而死亡，所以无法采集血浆。

使豚鼠禁食12小时，将人源化抗体R11-16B以1.5mg/kg和10mg/kg进行单次静脉内给予。使豚鼠禁食至给予24小时后，在24小时后重新喂食。对清醒状态的豚鼠于给予前(0小时)、给予2、4、8、24、48和72小时后进行采血，通过ELISA测定血浆中的人源化抗体浓度。结果见图4。

血浆中的人源化抗体浓度依赖于给予剂量而上升，即使在给予48小时以后血浆中的人源化抗体浓度与给予24小时后相比也维持约50%以上。显示出：人源化抗体的血中动力学的持续性较IGF-I优异。

产业实用性

本发明可提供抗体，该抗体特异性地与脊椎动物的IGF-I受体结合，经由IGF-I受体使肌肉量增加、而不降低血糖值，所以可用于与抗IGF-I受体人源化抗体相关的疾病的治疗、预防或诊断。