通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条及其制备方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的病毒，通过破坏人体免疫细胞，导致免疫系统失去抵抗力，而导致各种疾病。长期以来艾滋病(AIDS)/艾滋病病毒(HIV)病例报告、哨点监测、行为监测等监测方法，为发现HIV/AIDS疫情，掌握HIV/AIDS流行趋势、高危行为的变化情况,以及评价干预措施的效果提供了大量的依据。但通过上述监测方法难以判定HIV感染者是新近感染还是长期感染，无法获得直接准确的新近感染的数据，不能敏感地反应疫情的真正变化趋势和干预措施的效果，而为数不多的队列研究和统计模型估计的发病率远不能适应艾滋病流行形势分析和防治效果评价的需求。

随着抗病毒治疗的广泛推广,越来越多的HIV感染者和艾滋病病人的生存时间也逐渐延长,从而累计的长期感染者数量越来越多,HIV感染率不能敏感而直接地反映HIV流行的变化趋势。因此，评价艾滋病防治措施的效果,从而使得准确估计艾滋病新发感染率成为艾滋病防治工作的新重点。

近年来,随着实验室技术的发展,使得用血清学方法监测HIV-1新发感染成为可能。从1998年至今世界范围内先后出现四种较主流的实验室新发感染检测方法：低敏酶联法、AxSYM亲和力指数法、BED-CEIA法和LAg-Avidity EIA法。

按照检测原理可将这四种检测方法分为两大类。低敏酶联法和BED-CEIA法根据新发感染者HIV抗体数量较少的特性,区分新发感染者和长期感染者。AxSYM亲和力指数法和LAg-Avidity EIA根据新发感染者HIV抗体亲和力较弱的特性,区分新发感染者和长期感染者。

低敏酶联法由于包被B亚型抗原,而造成其新发感染检测结果具有亚型依赖性，不适用于多亚型并存地区新发感染检测。AxSYM亲和力指数法需要对样本进行双孔检测、操作方法较复杂且需要配置专门的检测仪器,有研宄显示其误判较高。BED-CEIA法和AxSYM亲和力指数法几乎同时期出现,有研究者将这两种方法同时用于新发感染检测，结果显示BED-CEIA法误判情况明显减少，但操作较复杂。目前,BED-CEIA仍然是世界范围内使用最多的新发感染检测方法，随着广泛使用其检测问题也日益凸显,多项研宄表明其检测结果受CD4计数、抗病毒治疗影响,最终影响新发感染率估算的准确性。限制性抗原亲和力酶联法的误判率较低，具有较高的特异性并且我国已经实现自主研发生产。但是限制性抗原亲和力酶联法仍然是实验室检测方法，对实验技术人员、设备、实验室条件要求很高，很难做到人群大规模快速检测。

通过采集患者血样，运用免疫层析技术制备试纸条胶体金法，用于体外快速定性检测人血清、血浆和全血中的人类免疫缺陷病毒(HIV-1/HIV-2)抗体的检测方式目前已经运用非常广泛。但是这些方法主要是通过检测可疑者血液的HIV抗体的有无判断是否感染，无法区分新发感染者和长期感染者。

因此，针对现有技术不足，提供一种通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条及其制备方法以克服现有技术不足甚为必要。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条及其制备方法。

本发明的目的通过以下技术措施实现。

提供一种通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，包括底板、设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜的两端分别搭接所述样品垫和吸水纸，所述样品垫的靠近硝酸纤维素膜的一端喷涂有胶体金标记的鼠抗人IgG抗体而形成金标层；

所述硝酸纤维素膜上设有混合包被GP41重组抗原BE23和GP41重组抗原BE33的第一检测线,单独包被HIV重组抗原(英科新创(厦门)科技股份有限公司,货号：XM1008HIV-A)的第二检测线和羊抗鼠IgG抗体的质控线。

优选的，上述的快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，第二检测线的HIV重组抗原的包被浓度为2.5-3.5mg/ml。

优选的，上述的快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，第一检测线中的GP41重组抗原BE23的包被浓度为0.1-0.3mg/ml，第一检测线中的GP41重组抗原BE33的包被浓度为0.3-0.6mg/ml。

优选的，上述的快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，GP41重组抗原BE23、GP41重组抗原BE33两者以体积比为1：3混合包被。

优选的，上述的快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，质控线的羊抗鼠IgG的包被浓度为0.5-1.0mg/ml。

优选的，上述的快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，所述胶体金标记的鼠抗人IgG抗体的浓度为10-20μg/ml。

优选的，上述的快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，参照比色卡，在质控线、第二检测线都出现条带时参考第一检测线，当第一检测线条带亮度小于L3时显示近期感染的结果，当第一检测线条带大于等于L3显示为长期感染的结果。

本发明同时提供混合包被GP41重组抗原BE23和GP41重组抗原BE33的第一检测线在上述的快速区分HIV近期和长期感染状态检测试纸方面的用途。

本发明还提供上述的快速区分HIV近期和长期感染状态检测试纸的制备方法，通过如下步骤进行，

1)准备好样品垫；

2)将鼠抗人IgG与胶体金颗粒结合形成胶体金标记鼠抗人IgG抗体，均匀涂于金标垫上，42ml/张，45℃冻干，待用；

3)制备第一检测线、第二检测线和质控线，然后整体在25℃、湿度10

制备第一检测线的具体过程是：将GP41重组抗原BE23、GP41重组抗原BE33重组抗原用缓冲液分别稀释为0.1-0.3mg/ml、0.3-0.6mg/ml，混合后，将混合液用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成第一检测线；

制备第二检测线的具体过程是：将HIV-1重组抗原用包被缓冲液稀释至2.5-3.5mg/ml，用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成第二检测线；

制备质控线的具体过程是：将羊抗鼠抗体稀释至0.5-1.0mg/ml，用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成质控线；

4)将样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接在底板上获得完整试纸条。

优选的，样本稀释液为10mm PBS，PH 7.2±0.2。

本发明的通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，具有如下优点：

1)通过混合包被GP41重组抗原判定HIV-1新近感染或者长期感染状态，通可以大大降低单一GP41重组抗原包被的误判或者漏判。

2)本发明使用方便，操作简单不需要高端的实验设备和复杂的实验步骤，对操作人员的专业要求较低，降低操作人员由于在操作失误引起的结果误判和提高操作的重复性。此外，本发明操作步骤少，降低了操作人员接触HIV阳性样本频率，从而降低操作人员感染风险。

3)本发明检测时间短，相较于目前上市的实验室方法用时3小时以上，本发明检测时间缩短至30分钟以内，大大缩短了检测时间，提高检测效率。

4)本发明结果判读简单，只需要操作人员按照操作流程将参考线颜色与标准比色卡比对即可判断，不需要专业解读，适合基层卫生工作者，推广性好，可用于HIV-1新近期感染的大规模初筛。

说明书附图

利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。

图1是本发明一种通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条的模拟示意图。

图2是本发明实施例的新发感染、既往感染结果判定。

图3是本发明实施例的样本检测流程图。

在图1中，包括：

1、样品垫；2、金标层；3、硝酸纤维素膜；4、吸水纸；5、第一检测线；6、第二检测线；7、质控线；8、底板。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步说明。

实施例1。

一种通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，如图1所示，包括底板8、设置于底板8上的样品垫1、硝酸纤维素膜3和吸水纸4。硝酸纤维素膜3的两端分别搭接样品垫1和吸水纸4，样品垫1的靠近硝酸纤维素膜3的一端喷涂有胶体金标记的鼠抗人IgG抗体而形成金标层2。

硝酸纤维素膜3上设有单独包被一种HIV重组抗原的第二检测线6、混合包被GP41重组抗原BE23和GP41重组抗原BE33的第一检测线5和羊抗鼠IgG抗体的质控线7。

该快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，第一检测线中的GP41重组抗原BE23的包被浓度为0.1-0.3mg/ml，第一检测线中的GP41重组抗原BE33的包被浓度为0.3-0.6mg/ml。优选，GP41重组抗原BE23、GP41重组抗原BE33两者以体积比为1：3混合包被。

GP41重组抗原BE23的基因序列为：

GP41重组抗原BE33的基因序列为：

第二检测线单独包被的HIV重组抗原购买自英科新创(厦门)科技股份有限公司,货号：XM1008HIV-A。第二检测线中HIV重组抗原的包被浓度为2.5-3.5mg/ml。

质控线7的羊抗鼠IgG的包被浓度为0.5-1.0mg/ml。胶体金标记的鼠抗人IgG抗体的浓度为10-20μg/ml。

该试纸条，通过如下步骤进行，

1)准备好样品垫；

2)将鼠抗人IgG与胶体金颗粒结合形成胶体金标记鼠抗人IgG抗体，均匀涂于金标垫上，42ml/张，45℃冻干，待用；

3)制备第一检测线、第二检测线和质控线，然后整体在25℃、湿度10

制备第一检测线的具体过程是：将GP41重组抗原BE23、GP41重组抗原BE33重组抗原用缓冲液分别稀释为0.1-0.3mg/ml、0.3-0.6mg/ml，混合后，将混合液用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成第一检测线；

制备第二检测线的具体过程是：将HIV-1重组抗原用包被缓冲液稀释至2.5-3.5mg/ml，用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成第二检测线；

制备质控线的具体过程是：将羊抗鼠抗体稀释至0.5-1.0mg/ml，用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成质控线；

4)将样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接在底板上获得完整试纸条。

需要说明的是，制备第一检测线、第二检测线和质控线的顺序可以灵活调整。只要最终制备出三条线即可，三个线条的制备先后顺序可以灵活调整。

本发明的通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，通过混合包被GP41重组抗原判定HIV-1新近感染或者长期感染状态，可以大大降低单一GP41重组抗原包被的误判或者漏判。

该快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，参照比色卡，在质控线7、第二检测线6都出现条带时参考第一检测线5，当第一检测线5条带亮度小于L3时显示近期感染的结果，当第一检测线5条带大于等于L3显示为长期感染的结果。

该试纸条使用方便，操作简单不需要高端的实验设备和复杂的实验步骤，对操作人员的专业要求较低，降低操作人员由于在操作失误引起的结果误判和提高操作的重复性。此外，本发明操作步骤少，降低了操作人员接触HIV阳性样本频率，从而降低操作人员感染风险。检测时间短，相较于目前上市的实验室方法用时3小时以上，本发明检测时间缩短至30分钟以内，大大缩短了检测时间，提高检测效率。本发明结果判读简单，只需要操作人员按照操作流程将参考线颜色与标准比色卡比对即可判断，不需要专业解读，适合基层卫生工作者，推广性好，可用于HIV-1新近期感染的大规模初筛。

实施例2。

一种通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条，结构与实施例1相同，本实施例的试纸条，其制备过程是这样的：

1)准备好样品垫，样品垫1购自英科新创(厦门)科技股份有限公司；

2)将鼠抗人IgG与胶体金颗粒结合形成胶体金标记鼠抗人IgG抗体，均匀涂于金标垫上，42ml/张，45℃冻干，待用；

3)制备第二检测线、第一检测线和质控线，然后整体在25℃、湿度10

制备第二检测线的具体过程是：将HIV-1重组抗原用包被缓冲液稀释至工作浓度2.5-3.5mg/ml，用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成第二检测线；

制备第一检测线的具体过程是：将GP41重组抗原BE23和GP41重组抗原BE33重组抗原用缓冲液稀释至工作浓度(BE23：0.1-0.3mg/ml，BE33：0.3-0.6mg/ml)，用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成第一检测线；

制备质控线的具体过程是：将羊抗鼠抗体稀释至工作浓度，用喷膜机在硝酸纤维素膜划线形成质控线；

4)将样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接在底板上获得完整试纸条。

本实施例中，第一检测线混合包被BE23和BE33按体积比1：2混合。为了比对效果，按照上述方法再单独制备第一检测线单独包被GP41蛋白BE23的比对试纸条1，第一检测线单独包被GP41蛋白BE33的比对试纸条2。

采用所制备的本发明的试纸条以及试纸条1、试纸条2，对样本进行检测。

样品上样：移液器吸取10ul血清滴于样品垫上，再滴加2-3滴(约100-150ul)样本稀释液，样本稀释液为10mm PBS，PH 7.2±0.2，20-30分钟后读取试纸检测线颜色亮度。

结果判定：将检测线条带与标准比色卡比对，范围为L0-L10。首先看质控线，阳性说明操作无误；其次看第二参考线,颜色强度大于L0说明样本为HIV-1阳性，颜色强度为L0说明样本HIV阴性。当判定为HIV-1阳性后看第一参考线，颜色强度大于L0说明样本为HIV-1长期感染，颜色强度为L0说明样本HIV近期感染。试纸条结果判定模式图见附图3。

结果解读：实验选取近期感染样本N1-N5，长期感染P1-P5以及强阳，中阳，弱阳参考品进行检测。所有样品质控线、第二检测线颜色正常。第一检测线结果如表一，可以看出单独包被BE23和BE33会出现较多假长期，假近期结果，BE23 0.3mg/ml和BE33 0.45mg/ml按照1:2体积比混合包被，可以降低假近期假长期结果，提高准确性，因此选择混合包被方式的试纸条准确度高。

表一：BE23、BE33单独包被，BE23、BE33混合包被第一检测线检测参考品结果。

注：L0-L10为条带反应颜色对比标准比色卡亮度。数字越大，条带亮度越大，L0代表没有条带，L10代表条带颜色亮度最亮。P为明确感染HIV时间超过250天的长期感染血清；N为明确感染HIV时间小于90天的近期感染血清(感染时间由流行病学随访数据获得)。

实施例3。

实施例2的测试结果证明了包被的GP41混合蛋白会与HIV近期感染血清抗体产生较弱的反应导致微弱的显色，本实施例提供不同的试纸条。

1)本试验例第一检测线GP41融合蛋白采用BE23，BE33混合包被。其中BE230.3mg/ml和BE33 0.45mg/ml按照1:1,1:2,1:3,3:1,2:1,比例混合。

2)本试验例金颗粒的喷涂和试纸条组装方法同试验例1。

3)本试验例试纸条的制备方法同试验例1。

4)本试验例上样方法同试验例1。

5)本试验例检测结果判断方法同试验例1。

6)我们以已经上市的实验室区分HIV近远期感染试剂盒检测结果作为参考标准来摸索我们第一检测线GP41蛋白混合包被量。我们从中国CDC获得了98份HIV血清样本，并用我们制备的试纸条和LAg-Avidity EIA法试剂盒同时检测这批样本，以此确定试纸条第一检测线GP41蛋白的最佳混合包被量。不同包被量测试结果如同表2.

7)结果解读：当质控线颜色读数正常、第二检测线读数正常，第一检测线读数小于L3时认为被检测样本为新近感染；当质控线、第二检测线读数正常，第一检测线读数大于等于L3时认为是长期感染，反之，当第一检测线读数小于L3时认为是近期感染。第一检测线GP41蛋白不同比例混合包被检测结果和LAg-Avidity EIA方法检测结果对比发现当GP41蛋白BE23(0.3mg/ml)与BE33(0.45mg/ml)体积比为1:3时检测效果最佳，灵敏度、特异度、一致率分别为86.96％，88.46％，87.75％。当GP41蛋白BE23(0.3mg/ml)与BE33(0.45mg/ml)体积比为1:3时，第一检测线的颜色为便于普通人区分的L3，可以实现直观肉眼判断，便于在实际使用过程中，检测人员仅通过简单的视觉即可判断结果。

表二：BE23、BE33蛋白不同比列混合检测结果和LAg-Avidity EIA方法检测结果比较。

实施例4。

本实验例较进一步纳入新的样本进行检测，验证试纸条区分HIV-1近期感染，长期感染能力。

1)本试验例第一检测线GP41融合蛋白采用BE23，BE33混合包被。其中BE230.3mg/ml和BE33 0.45mg/ml按照1:3比例混合。

2)本试验例金颗粒的喷涂和试纸条组装方法同试验例2。

3)本试验例试纸条的制备方法同试验例2。

4)本试验例本实验检测操作同试验例2。

5)本试验例上样方法同试验例2。

6)本试验例检测结果判断方法同试验例2，具体判读过程见附图3。

7)本试验例我们拟扩大样本采用进口LAg-Avidity EIA法试剂盒试剂盒对本发明试纸条进行进一步验证。我们从广州市CDC获得了65份感染HIV的IDU人群血清样本，用我们制备的试纸条和进口LAg-Avidity EIA法试剂盒同时检测这批样本，以此检验我们试纸条的检测能力。测试结果如同表三.

8)本试验例结果解读：试纸条检测结果和进口LAg-Avidity EIA试剂盒检测结果相比一致性较好，灵敏度、特异度、符合率分别为84.6％、93.3％、82.00％。

表三、试纸条与进口EIA试剂盒一致性比较

实施例5。

本实验例较实验例四进一步纳入具有流行病学随访数据样本，验证试纸条区分HIV-1近期感染，长期感染能力。

1)本试验例第一检测线GP41融合蛋白采用BE23，BE33混合包被。其中BE230.3mg/ml和BE33 0.45mg/ml按照1:3比例混合。

2)本试验例金颗粒的喷涂和试纸条组装方法同试验例4。

3)本试验例试纸条的制备方法同试验例4。

4)本试验例本实验检测操作同试验例4。

5)本试验例上样方法同试验例4。

6)本试验例检测结果判断方法同试验例4。

7)我们从广州市CDC获得了36份已有详细感染时间随访资料的血清样本，用我们制备的试纸条和LAg-Avidity EIA法试剂盒同时检测这批样本，以此检验我们试纸条的检测能力。测试结果见表4，表5.

8)结果解读：试纸条检测结果和进口LAg-Avidity EIA试剂盒检测结果相比一致性较好，灵敏度、特异度、符合率分别为92.31％、91.30％、91.70％。

表四、试纸条和进口试剂盒检测9份系列血清

表五、试纸条和进口试剂盒检测9份系列血清一致性比较

实验结果确认，本发明的试纸条可以判定HIV-1新近感染或者长期感染状态，判读结果准确，误判或者漏判几率小。

本发明的试纸条使用方便，操作简单不需要高端的实验设备和复杂的实验步骤，对操作人员的专业要求较低，降低操作人员由于在操作失误引起的结果误判和提高操作的重复性。此外，本发明操作步骤少，降低了操作人员接触HIV阳性样本频率，从而降低操作人员感染风险。

本发明的试纸条检测时间短，相较于目前上市的实验室方法用时3小时以上，本发明检测时间缩短至30分钟以内，大大缩短了检测时间，提高检测效率。

本发明的试纸条结果判读简单，只需要操作人员按照操作流程将参考线颜色与标准比色卡比对即可判断，不需要专业解读，适合基层卫生工作者，推广性好，可用于HIV-1新近期感染的大规模初筛。

以上所述试验例的各技术特征可以进行任意组合，为使描述简洁，未对上述试验例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 南方医科大学

北京新创生物工程有限公司

<120> 通过血清HIV-1抗体检测快速区分HIV近期和长期感染状态的试纸条及其制备方法

<130> GZZRH0504-21-1-1177

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Met Gly Leu

100 105 110

Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys Phe

115 120 125

Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Ile Ile Cys Thr Thr Ala Ala

130 135 140

Pro Glu Phe Arg Gly Asp Lys Asp Gly Gly Leu Gln Ala Arg Ile Leu

145 150 155 160

Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Gln Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly

165 170 175

Cys Ser Gly Lys His Ile Cys Thr Thr Thr Lys Leu Arg Gly Asp Lys

180 185 190

Asp Gly Gly Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys

195 200 205

Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys

210 215 220

Thr Thr Thr Ala Pro

225

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln

1 5 10 15

Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln

20 25 30

Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala

35 40 45

Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly

65 70 75 80

Ile Lys Gln Leu Gln Thr Arg Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Lys

85 90 95

Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys

100 105 110

Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr

130 135 140

Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg

145 150 155 160

Tyr Leu Lys Asp Gln Lys Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys

165 170 175

Ile Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ser Thr Trp Ser Asn Gly

180 185 190

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Gln Gln His Leu Leu

195 200 205

Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala

210 215 220

Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys

225 230 235 240

Ser Gly Lys His Ile Cys Thr Thr Asn Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp

245 250 255

Ser Asn