一种DENND1A-SGTA融合基因及其应用和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种急性淋巴细胞白血病融合基因及其应用和检测试剂盒。

背景技术

急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)是一种血液恶性肿瘤，占所有急性淋巴细胞白血病的80–85％，其特征是B淋巴母细胞在骨髓，外周血和淋巴器官中增殖及广泛浸润。在过去的数十年中，通过骨髓细胞学，免疫分型，分子残留(尤其是BCR-ABL融合基因的发现)等监测方法，B-ALL存活率已显著提高，然而成人和老年患者的5年总生存率(OS)仍然只有30％–40％。随着分子遗传诊断学的迅速发展，目前在B-ALL中已经有BCR-ABL1,E2A-PBX1,ETV6-RUNX1,MLL重排等几十种融合基因被报道，但仍然有很大比例的B-ALL患者缺乏分子标志，从而为临床诊断和治疗预后带来很大困难。因此与B-ALL相关的新融合基因的发现对于病情诊断、治疗方案制定、疗效评价、预后评估及病变复发的监测具有重要的临床意义。

DENND1A基因，又称DENN Domain Containing 1A，该基因的主要功能是可促进GDP转换为GTP，调节网格蛋白介导的突触小泡内吞并介导早期内体的退出。SGTA基因即smallglutamine rich tetratricopeptide repeat co-chaperone alpha，该基因在各种组织中普遍表达，其编码蛋白质可通过与BAG6的相互作用参与折叠错误的蛋白质分解代谢过程的调控。上述两个基因在该B-ALL患者里形成了一种新融合基因DENND1A-SGTA，并且是至今未见文献报道的分子标志物。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种急性淋巴细胞白血病融合基因DENND1A-SGTA。

本发明的第二个目的在于，提供融合基因DENND1A-SGTA在制备急性淋巴细胞白血病诊断或监测试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的在于，提供一种检测DENND1A-SGTA融合基因的试剂盒。

本发明第四个目的在于，提供一种非疾病诊断目的的检测DENND1A-SGTA融合基因的方法。

为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种DENND1A-SGTA融合基因，所述融合基因序列如SEQ ID NO.1所示。

为了实现上述第二个目的，本发明提供了融合基因DENND1A-SGTA在制备急性淋巴细胞白血病诊断或监测试剂盒中的应用。部分急性淋巴细胞白血病患者携带融合基因DENND1A-SGTA，其可以作为患者特异性的分子标志物，并应用于临床诊断、定期监测患者的微小残留病变。

为了实现上述第三个目的，本发明提供了一种检测融合基因DENND1A-SGTA的试剂盒，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR反应缓冲液、阳性对照和阴性对照；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为一个优选方案，所述Taqman探针的5’端标记有FAM基团，所述探针的3’端标记有TAMRA基团。当待测样品中不存在目标DNA分子时FAM的荧光被TAMRA淬灭，不发出荧光；当待测样品中存在目标DNA分子时，探针与目标DNA分子结合，随后靠Taq酶的5'→3’双链外切酶活性降解探针而释放荧光基团FAM，发出荧光。

作为一个优选方案，所述内参中包含内参上游引物，内参下游引物和内参探针；

所述内参上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

内参基因ABL的探针5’端可以标记有FAM基团，探针的3’端可以标记有TAMRA基团，FAM基团为报告基团，TAMRA为淬灭基团。

PCR反应缓冲液为本领域常用缓冲液，一般包括cDNA第一链合成试剂TIANScriptⅡRT Kit(TIANGEN公司)和实时荧光PCR混合液(Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit，Acurrate Biology公司，AG11704)，其主要成分包含DNA聚合酶、Mg

所述阳性对照包含有带有DENND1A-SGTA融合基因的质粒标准品和带有ABL基因的质粒。所述阴性对照包含去离子水和10例健康骨髓供者的cDNA。

为了实现上述第四个目的，本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测DENND1A-SGTA融合基因的方法，包括以下步骤：

(1)提取人血液样本中的总RNA，将RNA反转为cDNA作为待测样品；

(2)配置PCR反应液，再分别加入待测样品，阳性对照和阴性对照；

(3)实时荧光PCR仪上检测，反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35s，反应40个循环，荧光信号于60℃时采集；

其中所述PCR反应液包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR反应缓冲液、阳性对照和阴性对照，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

检测实验结果成立的条件为：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。

本发明发现并验证了部分急性淋巴细胞白血病携带融合基因DENND1A-SGTA，继之开发了一款实时荧光PCR和Taqman探针技术相结合的融合基因检测、定量试剂盒。实时荧光PCR其结果用Ct值表示，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点，是目前微量融合基因检测的首选方法，因此本试剂盒采用Taqman探针实时荧光PCR检测DENND1A-SGTA融合基因，对患者MRD进行监测。

本发明的优点在于，(1)应用生物信息学技术筛选鉴定到急性淋巴细胞白血病患者携带的融合基因DENND1A-SGTA，证明其是至今未见报道的新融合基因，并可以作为患者的分子标志物应用于临床诊断、选择合适的治疗方案、定期监测患者MRD。

(2)本发明涉及的DENND1A-SGTA融合基因检测试剂盒具有如下优势：①准确性高：同时使用探针和引物双重控制，特异性好、假阳性低。②特异性强：使用特异性探针识别融合基因序列。③全程监控：实时监测全程扩增信号。④安全简便：操作简单安全，自动化程度高而且防止污染。⑤快速：完成检测时间为120min。

(3)本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针，检测受测者体内DENND1A-SGTA融合基因和内参基因ABL的表达情况，能把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来的，对于患者诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发的监测中具有非常大的应用潜力。

附图说明

图1为DENND1A-SGTA融合基因结构图及PCR，sanger验证。

图2为DENND1A-SGTA融合基因的质粒标准品构建结果。

图3为使用本发明所述试剂盒检测DENND1A-SGTA的结果图例。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1.急性淋巴细胞白血病患者携带DENND1A-SGTA新融合基因

(1)应用生物信息学技术筛选出急性淋巴细胞白血病患者的融合基因以及文献中均未有过报道的DENND1A-SGTA新融合基因。

(2)DENND1A-SGTA新融合基因由DENND1A基因的第1-11外显子与SGTA的第12外显子拼接形成，具体的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

(3)分别应用PCR、并对PCR产物进行sanger测序，我们确认该例急性淋巴细胞白血病患者携带DENND1A-SGTA新融合基因，验证结果见图1。图1为DENND1A-SGTA融合基因结构图及PCR，sanger验证。A：9q33.3区域与19p13.3区域的translocation导致DENND1A-SGTA融合基因发生的图形化展示；B：融合基因在患者初发以及对照样本中的PCR验证；C：携带融合基因患者PCR验证产物的sanger测序结果图，确认了DENND1A外显子11与SGTA外显子12的融合。

(4)选取合适的质粒，并将一段包含融合breakpoint的序列克隆到质粒中，从中挑选出阳性克隆进行PCR扩增和sanger测序，验证转入到质粒中序列的正确性，从而得到标准品。图2为DENND1A-SGTA融合基因的质粒标准品构建结果。A：融合基因标准品质粒pGEM T-easy-DENND1A-SGTA图谱；B：标准品质粒sanger测序结果。

(5)设计了检测内参/目的基因用引物、探针，采用实时荧光PCR技术，检测内参基因ABL、DENND1A-SGTA融合基因的表达情况。试剂盒通过调整内参/目的基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

实施例2.试剂盒的制备

1、特异性的引物和探针的设计

根据基因序列(ABL1基因序列、DENND1A基因序列、SGTA基因序列均来自于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，ABL1基因Entrez Gene ID25，基因参考序列NM_005157.5；DENND1A基因Entrez Gene ID 57706，基因参考序列NM_001352964.2；SGTA基因Entrez Gene ID 6449，基因参考序列NM_003021.4)设计特异性探针和引物。

2、试剂盒组分配制

cDNA第一链合成试剂：TIANScriptⅡRT Kit(TIANGEN公司)，检测体系PCR反应液：Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit(Acurrate Biology，AG11704)，其主要成分包含DNA聚合酶、Mg

引物和探针：包括检测DENND1A-SGTA融合基因和内参ABL引物以及与引物相对应的探针，具体如下：

DENND1A-SGTA-F:CGCATCTGCTGGAC(SEQ ID NO.2)

DENND1A-SGTA-R:GGGCTGTAAGGGAGT(SEQ ID NO.3)

DENND1A-SGTA-Probe:FAM-ATTTAAGTTTAATGGAGCTGCTCCCGGTG-TAMRA(SEQ IDNO.4)

ABL1-F:CTAAAGGTGAAAAGCTCCG(SEQ ID NO.5)

ABL1-R:GACTGTTGACTGGCGTGAT(SEQ ID NO.6)

ABL1-Probe:FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(SEQ ID NO.7)。

阳性对照品：包含有带有DENND1A-SGTA融合基因的质粒标准品和带有ABL基因的质粒；阴性对照品：去离子水和10例健康骨髓供者的cDNA。

实施例3.本试剂盒检测ALL患者标本的操作流程

1、取送检的ALL患者抗凝血标本，抽提血液中的总RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μlRNase-free水溶解沉淀。

2、参考TIANGEN公司的TIANScriptⅡRT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。

3、试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，X＝23μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)，每人份23μl分装。

4、加样：加入检测体系PCR反应液中2μlcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

5、检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35s，反应40个循环，荧光信号于60℃时采集。

6、结果判断：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。

7、DENND1A-SGTA可以作为急性淋巴细胞白血病患者特异性的分子标志物：我们应用上述构建的检测试剂盒，对一例DENND1A-SGTA阳性患者临床治疗的5个时间节点样本进行了MRD监测。图3为使用本发明所述试剂盒检测DENND1A-SGTA的结果图例。A：DENND1A-SGTA阳性样本以及阴性对照；B：DENND1A-SGTA阳性患者随治疗，DENND1A-SGTA在mRNA水平的变化。Sample 1:初发；Sample 2:化疗后；Sample 3:移植后5个月；Sample4:复发；Sample5:回输后缓解。我们发现，(1)该患者在初发(Sample 1)时DENND1A-SGTA表达水平很高，随着临床给予诱导化疗和移植均有明显缓解(Sample 2和Sample 3)，DENND1A-SGTA表达量均明显降低；(2)很快患者复查流式再次显示原始细胞增多(Sample 4)，DENND1A-SGTA的表达量又出现升高，此时给予供者淋巴细胞输注，监测DENND1A-SGTA表达量再次降低(Sample5)，说明DENND1A-SGTA表达与疾病进展趋势一致，但仍需实时监测警惕复发风险。上述结果表明，DENND1A-SGTA可以作为患者新的分子标志物用来监测MRD，并且证明该试剂盒的准确可靠。

综上结果表明，本试剂盒可高通量、快速、准确地检测样本，同时具有良好的特异性和可重复性，可有效避免假阳性和假阴性结果。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医科大学附属第二医院

上海交通大学医学院附属新华医院

<120> 一种DENND1A-SGTA融合基因及其应用和检测试剂盒

<130> /

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1984

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgggctcca ggatcaagca gaatccagag accacatttg aagtatatgt tgaagtggcc 60

tatcccagga caggtggcac tctttcagat cctgaggtgc agaggcaatt cccggaggac 120

tacagtgacc aggaagttct acagactttg accaagtttt gtttcccctt ctatgtggac 180

agcctcacag ttagccaagt tggccagaac ttcacattcg tgctcactga cattgacagc 240

aaacagagat tcgggttctg ccgcttatct tcaggagcga agagctgctt ctgtatctta 300

agctatctcc cctggttcga ggtattttat aagctgctta acatcctggc agattacacg 360

acaaaaagac aggaaaatca gtggaatgag cttcttgaaa ctctgcacaa acttcccatc 420

cctgacccag gagtgtctgt ccatctcagc gtgcattctt attttactgt gcctgatacc 480

agagaacttc ccagcatacc tgagaataga aatctgacag aatattttgt ggctgtggat 540

gttaacaaca tgttgcatct gtacgccagt atgctgtacg aacgccggat actcatcatt 600

tgcagcaaac tcagcactct gactgcctgc atccacgggt ctgcggcgat gctctacccc 660

atgtactggc agcacgtgta catccccgtg ctgccgccgc atctgctgga ctactgctgt 720

gctcccatgc cctacctcat aggaatccat ttaagtttaa tggagctgct cccggtgtga 780

ccgcgtcctt ccctggccga cccgaaggaa gccttctggt tgtctgccac ttcctcctgt 840

tggactgcct gagagagggg aagagagaga cctcggacct gcatgtcaag atggattttc 900

cccttttatc tctgccctcc tccactccct ttttgtaact cccttacagc ccccagaccc 960

ttcttgaaac gagagccagc aagctgagca cagaccagca gcgacctccc ttccagcccc 1020

cagaaagctc ggtcacttga gtgttttcta gaatcctggg gtgctcccgg gccgctctca 1080

gagaagtggc aggtttcacg ttcagccgtg tggcggatcg tgtggcttcc aaagcctttt 1140

acagcccccg ccccccatcc cgtggtctgt ctgcaggaac tctcccgtct gtgagaagcc 1200

tctttccgag tcgacctccc ggccaccccg gccctgtgcc tgctcggaag agctcactgc 1260

cagctgcggc ctgggcaccg cgggccatgt gtgtttgcat gaggaactct ttagtggcag 1320

acacctaaga gacggctgcg gtcaccccac gcctccgcgg ctcaggagcc gtcctgggtg 1380

cataggacca gtttctgtga cttttctcca gttgggcatg ttgacagaca tgtttcccct 1440

cctcccaccc tcattttctg gtcctcgcga ctgagagcca ggggcgacat catgaccttc 1500

tgtcccggcc gccttagccc cgggcacagg gaaggcagct gggccgtttc tgtctgtgtc 1560

ccatcctgct gtccttctgt cctggatgtt tcatgggccc ggggcccccc agggaagctt 1620

acccctcctg tgctgggtgg aggccacggg acacctcagg tgccacccac cttggcccta 1680

aaacagccac caggaaagca gccggagagc cggacagcag gcagcctgtc tgggttcctg 1740

aggcctgggg gtggcagacg agcccacggc gccgtggtcc cagcagcagg gttgtcagtc 1800

ggagcatcct ggggctccct ggctcctggc cgtctgtgag gtaggcgcag taccgtgtat 1860

cgtaggtagc agtaggaacg ggggccgccg cggccctgca gccgctcatg gcggtgaggt 1920

gtgtgccaag cccacccggg gtgcagggcg tgacgtgtgg ggaataaata ggcgttgtga 1980

cctc 1984

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atttaagttt aatggagctg ctcccggtg 29

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctaaaggtga aaagctccg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gactgttgac tggcgtgat 19

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28