一种稀土上转换复合纳米材料用于肿瘤治疗

技术领域

本发明涉及一种基于磷脂包覆的上转换纳米材料（UCNPs）负载光敏剂竹红菌乙素（HB），并在UCNPs表面PEG上通过O-Mn配位原位生长MnO

本发明涉及以上转换纳米材料负载光敏剂HB，且将MnO

背景技术

近年来，光动力疗法（PDT）在临床恶性肿瘤治疗中受到广泛的关注。PDT是利用特定波长的光照射富集在肿瘤部位的光敏剂（PS），将O

首先，选择合适的光敏剂有利于获得高效的PDT结果。然而传统的光敏剂穿透深度和PDT效率之间很难达到平衡。据报道，竹红菌素具有抗病毒、抗肿瘤等作用，在预防和治疗癌症等疾病方面显示出巨大的药用潜力。其中，光敏剂竹红菌乙素（HB）的光敏活性和光疗效果要更为突出，由于其具有光毒性强、代谢快、三线态氧和单线态氧的量子产率高、对正常组织损伤小等优点，是发挥PDT的理想PS。然而，生物相容性差和穿透深度差的可见光作为激发光限制了其在PDT的应用。巧合地是，稀土掺杂的上转换纳米粒子（UCNPs）可以将近红外光转换为紫外光或可见光，其介导的光动力疗法在增加光的组织穿透深度以对抗深部肿瘤方面显示出了巨大的效果，这使得PDT又向前迈出了关键性的一步。通过脂质体包覆后，HB的吸收峰产生较大红移，实现与UCNPs的发射光谱高度匹配，从而提高荧光量子转移效率，产生高效的PDT作用。该PDT过程采用近红外光激发UCNPs实现，由于近红外光在生物组织中的穿透深度较深，因此可以实现深部肿瘤治疗。

其次，由于肿瘤微环境（TME）的极度缺氧，对O

研究表明肿瘤细胞具有不同于正常细胞的独特代谢模式。一方面，由于在肿瘤发生过程中糖酵解代谢的上调，实体瘤会产生大量的乳酸，导致肿瘤微环境呈酸性，pH值显著降低。另一方面，恶性肿瘤细胞产生过多的H

受上述研究启发，本研究方法将MnO

发明内容

本发明的目的在于构建一个近红外远程光控的上转换光动力学治疗与肿瘤微环境可触发的化学动力学协同治疗平台，通过肿瘤微环境响应、PDT/CDT的协同治疗，提高治疗效率，实现对乏氧肿瘤的有效治疗。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种可作为肿瘤微环境响应型（TME）纳米治疗平台的上转换纳米复合材料，其特征在于：是一个集肿瘤微环境响应、光动力治疗、化学动力学治疗为一体的理想设计；这种多功能纳米平台采用两亲性共聚物DSPE-PEG

本发明所述的作为肿瘤治疗平台的上转换纳米复合材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）根据热分解法制备了NaYF

2）光敏剂HB的负载：棕色小瓶中各加入步骤1已合成的1 mL UCNPs@DSPE-PEG

3）UCNPs@DSPE-PEG

4）上转换纳米复合材料对肿瘤细胞的杀伤作用：通过近红外光谱实验表明980 nm激光对HeLa细胞无不良影响，孵育有UCNPs@DPB的癌细胞在980 nm激光照射下，在各浓度范围内均得到抑制，说明PDT起到了杀伤HeLa细胞的作用，相比较UCNPs@DPB，UCNPs@DPB-MnO

上述的上转换纳米复合材料（UCNPs@DPB-MnO

1）光敏剂HB负载量的确定及稳定性考察：使用UCNPs@DP对不同浓度的HB 进行负载，当浓度达200 μM后，颜色保持不变，基本达到饱和；进一步对其负载量进行考察，在DMF溶液中，当HB的浓度为 200 μM时，负载量达到饱和为15μg/mg；将复合物放置24 h，离心取上清液，并测试吸收光谱；复合物分散在去离子水、PBS、乙醇、氯仿、DMEM、RPMI-1640中离心后的上清液测定吸收光谱，仅有在乙醇中的发生了少量的泄漏，这是因为乙醇会破坏磷脂结构，而其他溶液中未发现HB的泄漏；使用二氯甲烷可以将负载在磷脂层中的HB完全萃取出来；该磷脂层性质稳定，能够很好地负载光敏剂用于肿瘤的光动力学治疗；

2）体外单线态氧的测试：采用化学探针1，3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）对上转换纳米复合材料在980 nm激光照射下产生的

3）上转换纳米复合材料介导类Fenton反应的测试：为了验证Mn

4）GSH对•OH的清除作用：25 mM NaHCO

本发明所述的上转换纳米复合材料，其特征在于：采用两亲性共聚物DSPE-PEG

具体地说，本发明设计构建了近红外远程光控的上转换光动力学治疗与肿瘤微环境可触发的化学动力学协同治疗平台，用于乏氧肿瘤的有效治疗。其策略是：首先采用两亲性共聚物DSPE-PEG

本发明所述的构建的近红外远程光控的上转换光动力学治疗与肿瘤微环境可触发的化学动力学协同治疗平台，用于乏氧肿瘤的有效治疗的方法，包括以下步骤：

1）根据高温裂解法制备了NaYF

2）光敏剂HB的负载：光敏剂HB的负载：棕色小瓶中各加入1 mL UCNPs@DSPE-PEG

3）MnO

4）复合材料介导类Fenton反应的测试：Mn

5）MTT检测细胞存活率：首先分别检测正常细胞和经CDT治疗后的肿瘤细胞的存活率作为对照组。其次对经PDT和CDT联合治疗后的肿瘤细胞的存活率检测，采用生长状况良好的HeLa细胞，以每孔100 μL含1.0×10

6）上转换复合纳米材料的光动/化学动力学治疗：BALB/C小鼠按照标准规程培养，在进行两周的观察后在其右后肢背部注入适量的4T1细胞。当肿瘤长到可用大小时，将小鼠随机分为5组进行光照实验，分别为saline、NIR、HB、UCNPs@DPB以及UCNPs@DPB+NIR，每组5只。通过原位注射的方法注射60μL样品溶液，对于需要光照的NIR及UCNPs@DPB+NIR组，用功率为2 W的980 nm激发器对肿瘤部位照射，照射时间为25min，每隔5min停止照射1min，光纤头到肿瘤部位的垂直距离为1.5 cm。治疗时间持续14天，记录小鼠的体重以及实体肿瘤的体积。

7）组织病理学分析

H&E染色：摘除小鼠的肿瘤及各主要脏器后用4%的多聚甲醛进行固定。之后将样品进行包埋，切片和染色。于倒置显微镜下观察并评价其组织病理学改变。

Tunel实验：取小鼠的肿瘤进行石蜡包埋、切片和染色处理，于荧光显微镜下观察并评价其组织病理学改变。

本发明成功构建了近红外远程光控的上转换光动力学治疗与肿瘤微环境可触发的化学动力学协同治疗平台。高效、稳定发光的UCNPs可以将980 nm NIR光转化为540 nm绿光，540 nm绿光激发光敏剂HB进行PDT过程。肿瘤微环境中内源性酸性H

本发明的优点：

（1）HB作为第二代有很大潜力的光敏剂，具备光毒性强、代谢快、单线态氧的量子产率高等优点，能够有效产生活性氧并杀死癌细胞。UCNPs可以将近红外光转换为可见光或紫外光，HB与UCNPs结合后，可在深部肿瘤中被近红外光间接激发，在增加光的组织穿透深度以对抗深部肿瘤方面显示出了明显的效果。克服了其他方法生物相容性差、穿透深度差等缺点、提高了专一性、降低了副作用；

（2）采用两亲性共聚物DSPE-PEG

（3）肿瘤微环境中内源性酸性H

（4）MnO

附图说明

图1为HB的浓度对应其荧光强度的标准曲线图，图中A是不同浓度的HB溶于DMF溶液中的荧光谱图；B是HB的浓度对应其荧光强度的标准曲线图。

图2为UCNPs的紫外可见吸收光谱图、上转换发射光谱图及UCNPs@DP负载HB前后的紫外可见吸收光谱图。

图3 为各实验对照图，图中：(A) HB的UV图；(B) UCNPs@DP的UV图；(C-G) 不同浓度的UCNPs@DPB的UV图；(H) DPBF和不同材料在980 nm激发光下其415 nm处吸光度随时间的变化曲线。

图4为UCNPs@DP-MnO

图5为不同浓度的GSH处理UCNPs@DP-MnO

图6为表征上转换纳米复合材料介导类Fenton反应的吸收谱图，图中：(A)分别用H

图7为HeLa细胞与不同浓度的材料孵育后在不同条件下的细胞存活率。

图8为HeLa细胞通过5种不同方式处理后用PI染色的荧光成像。

图9为基于上转换纳米复合材料的光动力/化学动力学治疗平台示意图，图中：a为上转换纳米复合材料合成图解；b为上转换纳米复合材料抗肿瘤机理图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实例1：

光敏剂HB的负载

1）热分解法制备NaYF

2）DSPE-PEG

3）光敏剂竹红菌乙素（HB）的负载：棕色小瓶中各加入1 mL 2.5 mg /mL 步骤2）获得的UCNPs@DP（UCNPs@DSPE-PEG

3）HB负载量的确定及稳定性考察：配制不同浓度HB的DMF溶液（5、10、20、30、40、50μM），在470 nm激发下可测得HB在550-800 nm处的发射光谱，确定在620nm处有最大吸光度，测定其在620 nm处的荧光强度，绘制荧光强度-浓度的标准曲线，如图1所示。将各个组装好HB的UCNPs（UCNPs@DPB）溶液离心，未组装的HB在上清液DMF中，吸取上清液，测定其在620nm处的荧光强度，根据标准曲线，计算上清液中游离HB的浓度。

HB负载在磷脂层稳定性的考察，将复合物放置24 h后，离心取上清液，并测试吸收光谱。如图2所示，复合物分散在去离子水、PBS、乙醇、氯仿、DMEM、RPMI-1640中离心后的上清液测定吸收光谱，仅有在乙醇中的发生了少量的泄漏，这是因为乙醇会破坏磷脂结构，而其他溶液中未发现HB的泄漏。因此，该磷脂层性质稳定，能够很好地负载光敏剂用于肿瘤的光动力学治疗。

4）体外单线态氧的测试：在相同的980 nm激发光功率密度（2 W/cm

实例2

UCNPs@DPB -MnO

1）UCNPs@DPB-MnO

2）上转换纳米复合材料自供氧能力的表征：因实体肿瘤中存在一个酸性且富含H

3）上转换纳米复合材料介导类Fenton反应的表征：实体肿瘤微环境具有明显的GSH、H

为了验证不同浓度谷胱甘肽（GSH）对复合物是否能发生氧化还原反应，实验测定了不同浓度GSH处理复合物后的吸收光谱和UCL发射光谱。如图5中的A所示，吸收值随GSH浓度增高而降低；同样，随着GSH浓度的增加，UCL也逐渐恢复，如图中的B所示。说明MnO

Mn

随着H

实例3

基于上转换复合材料的光动力/化学动力学治疗平台的构建

1）MTT检测PDT和CDT联用对肿瘤细胞治疗效果：为了研究PDT与CDT联用对肿瘤细胞的治疗效果，在980 nm激光照射下比较了UCNPs@DPB与UCNPs@DPB-MnO

2）上转换复合纳米材料的光动/化学动力学治疗：BALB/C小鼠按照标准规程培养，在进行两周的观察后在其右后肢背部注入适量的4T1细胞。当肿瘤长到可用大小时，将小鼠随机分为5组进行光照实验，分别为saline、NIR、HB、UCNPs@DPB以及UCNPs@DPB+NIR，每组5只。通过原位注射的方法注射60μL样品溶液，对于需要光照的NIR及UCNPs@DPB+NIR组，用功率为2 W的980 nm激发器对肿瘤部位照射，照射时间为25min，每隔5min停止照射1min，光纤头到肿瘤部位的垂直距离为1.5 cm。治疗时间持续记录小鼠的体重以及实体肿瘤的体积。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。