N-亚油酰酪氨酸在制备具有神经保护作用的药物中的用途

技术领域

本发明涉及N-亚油酰酪氨酸在制备具有神经保护作用的药物中的用途。

背景技术

氧化应激是指体内有害因子刺激下自由基的增加或人体抗氧化保护能力的减弱，从而导致氧化系统和抗氧化系统的失衡。活性氧(ROS)的过度积累会破坏生物分子，如核酸、蛋白质和脂质，从而导致心血管疾病、阿尔茨海默病和其他慢性退行性疾病的发生和发展。抗氧化剂可以通过中和自由基来减轻或抑制细胞损伤。

自噬是处理衰老，受损或变性的蛋白质和细胞器的过程。在自噬中，细胞质中的可降解内容物被包裹在亚细胞双层囊泡中，然后转运至溶酶体中以降解该废物。有研究表明自噬对神经变性具有保护作用，对氧化应激的重要性也已经得到认可，并且已经测试了数种自噬诱导剂对氧化应激的治疗潜力。有报道称，在退行性疾病中，自噬通量在氧化应激下受到抑制，因此，提出了诱导自噬可能是一种有前景的抗氧化方法。

花生四烯酸乙醇胺(AEA)作为大麻素1型(CB1)和2型(CB2)受体的配体，可通过抑制氧化应激和自由基形成发挥神经保护作用。此外，在心血管疾病中，大麻素和激活性大麻素受体可诱发自噬，但是，体内AEA的快速代谢失活限制了它的进一步应用，因此，急需开发新的更稳定的具有神经保护作用，治疗与神经相关疾病效果更好的化合物。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了N-亚油酰酪氨酸在制备具有抗氧化作用的药物中的用途；所述N-亚油酰酪氨酸结构式为：

进一步地，所述药物是治疗氧化应激升高、活性氧(ROS)过度积累导致的神经退行性疾病的药物。

进一步地，所述药物是治疗氧化应激升高、活性氧(ROS)过度积累导致的心血管疾病的药物。

进一步地，所述药物是治疗氧化应激升高、活性氧(ROS)过度积累导致的阿尔茨海默病的药物。

进一步地，所述药物是保护神经细胞免受氧化损伤的药物。

更进一步地，所述药物是抑制神经细胞中活性氧升高的药物。

更进一步地，所述药物是增强神经细胞中自噬相关蛋白表达的药物。

更进一步地，所述自噬相关蛋白为LC3-II，Beclin-1，ATG5和ATG13。

本发明还提供了一种具有抗氧化作用的药物，它是以N-亚油酰酪氨酸为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂为口服制剂或注射剂。

本发明N-亚油酰酪氨酸在制备具有抗氧化作用的药物中的用途，通过作用机制研究发现，N-亚油酰酪氨酸(NITyr)可通过自噬减轻PC12细胞中H

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 H

图2 NITyr对H

图3自噬抑制剂3MA对细胞活力和ROS水平的影响(A，3MA对细胞核数量和ROS水平影响，B,MTT法检测细胞活力统计结果；C,荧光法检测DCFH-DA相对荧光强度统计结果)

图4自噬相关蛋白免疫荧光图谱

图5受体拮抗剂AM251、AM630对细胞活力和ROS水平的影响(A,不同处理后的ROS荧光显微图谱，B，不同处理后的荧光强度，C，不同处理后的细胞核的荧光显微图谱，D，不同处理后的细胞活力

图6 CB1受体拮抗剂AM251对自噬相关蛋白影响(A自噬蛋白western blotting图谱，B自噬蛋白LC3-II半定量统计分析，C自噬蛋白Beclin-1半定量统计分析，D自噬蛋白ATG5半定量统计分析，E自噬蛋白ATG13半定量统计分析)

图7 CB1和CB2受体蛋白免疫荧光显微图谱

具体实施方式

实施例1

1、材料和方法

1.1 材料

NITyr按照Lin Cheng等.N-Linoleyltyrosine Protects against TransientCerebral Ischemia in Gerbil via CB2 Receptor Involvement in PI3K/AktSignaling Pathway[J].Biol.Pharm.Bull.2019(42),1867–1876中的方法制备。获得的试剂如下：LC3，Beclin-1，ATG5和CB1受体兔多克隆抗体(1：1000；美国Proteintech Group，Inc.)；CB2受体兔多克隆抗体(1：500；美国Cayman Chemical)；ATG13兔多克隆抗体(1：1000；中国成都Zen Bio)；辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠/抗兔IgG(H+L)(1：10000；美国Abways Technology)；Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔二抗IgG(H+L)(1：500；美国Abways Technology)；CB1受体拮抗剂AM251(美国SelleckChem)；CB2受体拮抗剂AM630(美国默克Sigma-Aldrich)；3-甲基腺嘌呤(3MA)(美国CSNpharm)；过氧化氢(H

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和实验分组

将PC12细胞培养在含有10％胎牛血清(中国北京TransGen Biotech公司)，5000U/mL青霉素和5mg/mL链霉素(中国北京TransGen Biotech公司)的DMEM培养基中，然后将细胞移至含5％CO

实验分组如下：对照组((control)，分别用50、100、250和500μmol/L H

1.2.2 细胞活力测定

将PC12细胞以5×10

1.2.3 DAPI和DCFH-DA染色

分别用DAPI(1：1000，中国Beyotime公司)和DCFH-DA(1：1000，中国MeilunBiotech公司)探针测定细胞内DNA损伤和ROS的产生。药物处理后，将PC12细胞在含有DAPI的无血清DMEM中于室温孵育10分钟，或在含有DCFH-DA的无血清DMEM中于37℃孵育20分钟，紧接着，将6孔板在磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗3次，每次5分钟。然后立即用荧光显微镜(日本奥林巴斯)进行分析。DCFH-DA的相对荧光强度通过荧光计(中国Thermo公司)进行分析。

1.2.4 免疫荧光

将PC12细胞接种在置于6孔板中的盖玻片上，药物处理后，根据免疫荧光实验方案对细胞进行处理。先将细胞在PBS中漂洗，再用4％多聚甲醛固定并用0.5％Triton-X-100通透，然后，再次漂洗细胞，并在室温下用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。随后，将细胞与用含Tween-20的Tris-HCL缓冲盐溶液(TBST)配制的1％BSA溶液稀释的相应一抗在4℃孵育过夜，之后将细胞用1x TBST洗涤3次，每次3分钟，并于室温下在Alexa Fluor 594标记的二抗中避光孵育1小时，接下来，用1μg/mL DAPI处理用于检测细胞核，最后，将细胞用1x TBST洗涤，并用BX63荧光显微镜(日本奥林巴斯)拍照观察。

1.2.5 蛋白质印迹

将状态良好的PC12细胞接种于6孔板中培养24小时，药物处理后，根据蛋白质免疫印迹方案处理细胞。将细胞用PBS洗涤三遍后，置于冰上，在制备好的裂解缓冲液(RIPA裂解缓冲液：蛋白酶抑制剂：EDTA＝100：1：1，中国Beyotime)中孵育30分钟。然后，将细胞在4℃以12000×g离心20分钟，并收集上清液，接下来，根据Easy II蛋白质定量试剂盒(BCA，中国北京TransGen Biotech)的说明检测并调整蛋白质浓度。将蛋白质在100℃变性6分钟，然后在制备好的梯度聚丙烯酰胺凝胶(Tris-HCl系统)上每泳道分离50μg蛋白质，以检测不同分子量的蛋白质，然后将其转移至PVDF膜(美国Merck Millipore Ltd)上。用5％BSA在37℃的恒温摇床上封闭膜1小时。然后，将膜置于相应的一抗中于4℃孵育过夜。将GAPDH兔多克隆抗体(1：10000，美国Proteintech Group，Inc.)作为内参蛋白。随后，将膜用TBST洗涤3次，每次5分钟，并在室温下与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育1小时。最后，将膜再次用1×TBST洗涤3次，每次5分钟，之后用化学发光HRP底物(Millipore Corporation，Billerica，美国)处理以检测蛋白条带，并使用ChemiDoc系统(美国Bio-Rad)拍照分析。

1.2.6 统计分析

使用SPSS统计软件对实验结果进行统计分析。所有数据均表示为平均值±标准偏差(SD)，并通过Student-Newman-Keuls检验、Duncan多范围检验和单因素方差分析评价，以进行组间比较。如果P<0.05，则差异显着。

2、结果

2.1 NITyr保护PC12细胞免受H

在H

2.2 NITyr抑制ROS介导的H

考虑到ROS对H

2.3 自噬抑制剂3MA减弱了NITyr对细胞活力和ROS水平的影响

如图3A所示，与H

2.4 NITyr对自噬相关蛋白的影响

如图4所示，与对照组相比，H

2.5 CB1受体拮抗剂AM251和CB2受体拮抗剂AM630对细胞活力和ROS水平的影响

如图5A和5C所示，与H

2.6 CB1受体拮抗剂AM251对自噬相关蛋白的影响。

在上述实验的基础上，将细胞用NITyr(1μmol/L)和AM251进行处理。如图6A～E所示，与H

2.7 NITyr对CB1和CB2受体表达的影响

如图7所示，红色荧光代表CB1和CB2受体的蛋白表达。与对照组相比，H

3、结论

AEA表现出良好的抗氧化活性，但是其半衰期短限制了它的临床应用。在以前的研究中，基于AEA的结构合成了饱和脂肪酰氨基酸NSTyr，且该化合物具有很强的抗氧化活性。但是，NSTyr需要比AEA高几个数量级的浓度才能显示出适度的活性。基于结构确定活性，比较了AEA和NSTyr的结构。AEA具有不饱和键，而NSTyr没有，因此，进一步改进了NSTyr，得到NITyr。并探讨了NITyr是否具有抗氧化作用及其机制。

由于大脑组织中对氧气的需求很高，因此中枢神经系统特别容易受到缺氧环境的影响，并且细胞膜易于受到氧自由基的攻击。目前，已经证实神经退行性疾病中氧化应激升高，而且越来越多的证据表明，细胞内过量的过氧化氢对细胞膜有毒并诱发氧化应激，因此，H

以上结果表明，H

自噬是一种高度保守的分解代谢过程，可清除产生细胞内ROS的受损细胞器，过量ROS的存在会刺激自噬的发生，从而恢复细胞内ROS的水平。自噬减少会增加受损细胞器和ROS的积累，而这些累积的受损的细胞器和ROS参与了各种疾病的发病机理，如神经退行性疾病。根据本发明的结果，NITyr在预防H

以上结果表明，NITyr通过诱导自噬保护细胞免受细胞毒性和过量ROS的产生。

实验中，PC12细胞用CB1受体的选择性拮抗剂(AM251)和CB2受体选择性拮抗剂(AM630)进行了预处理，而AM251预处理确实阻断了NITyr对H

上述结果证实，NITyr通过CB1受体诱导自噬以达到抗氧化作用。此外，在H

总体而言，NITyr首次被证明可通过自噬减轻PC12细胞中H

综上，本发明N-亚油酰酪氨酸在制备具有神经保护作用的药物中的用途，通过作用机制研究发现，N-亚油酰酪氨酸(NITyr)可通过自噬减轻PC12细胞中H