远志皂苷在制备补体调节剂、肠道菌群调节剂中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及远志皂苷在制备补体调节剂、肠道菌群调节剂中的应用。

背景技术

补体系统(Complement system)是机体免疫系统的一部分，在机体抵御和清除侵入的病原体以及炎症反应中发挥重要作用。在人及其它哺乳动物的补体系统中，包含有血浆补体成分、可溶性和膜型补体调节蛋白、补体受体等30余种糖蛋白，广泛参与固有免疫和适应性免疫的效应机制，通过溶细胞效应发挥重要的生理和病理，导致补体激活形成攻膜复合物。补体活化过程中产生的功能性裂解片段和攻膜复合物可介导产生多种生物学作用，如溶菌和细胞溶解作用，调理作用，免疫黏附及其对循环免疫复合物的清除作用，炎症介质和参与适用性免疫应答作用等。血液补体系统具有与广谱宿主防御机制相关的众多功能，包括抗微生物和抗病毒作用。衍生自补体成分激活的产物包括非自身识别分子C3b、C4b和C5b，以及影响多种细胞免疫应答的过敏毒素C3a、C4a和C5a，这些过敏毒素也发挥促炎剂的作用。

补体成分3(Complement component 3)，通常简称为C3，在补体系统的激活中起关键作用，对于该系统执行的所有重要功能都至关重要。C3已被确定为几个晶体结构，包含13个域。所有补体系统通路激活都发生在C3激活期间，尤其是通过经典途径和旁路途径。研究表明，C3蛋白占据人血清中补体系统蛋白的最大比例，且C3缺乏症患者容易受到细菌和微生物的感染。由于补体激活途径参与许多疾病和病症，因此补体途径的相关成分能够被作为治疗和干预疾病的靶点。

因此，本发明希望提供一种能够调节补体系统，尤其是抑制补体成分3(C3)表达的药物成分。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出远志皂苷具有调节补体系统和改善肠道菌群失调的作用，可用于制备补体系统调节剂或肠道菌群调节剂。

本发明提供了远志皂苷在制备补体调节剂中的应用。本发明指出，远志皂苷可调节多种补体基因表达，起到补体调节剂的作用。

优选的，所述补体为C3、C1qa、C1qb或C1qc。更优选的，所述补体为C3。

进一步研究表明，远志皂苷对于补体C3的调控效应最为显著，可有效降低C3基因的表达。

本发明还提供了一种补体调节剂，包括作为活性成分的远志皂苷。

优选的，所述补体调节剂还包括有药学上可接受的辅料。

更优选的，所述药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。

优选的，所述补体调节剂的制剂形式为片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、栓剂或口服液。

本发明还提供了远志皂苷在制备肠道菌群调节剂中的应用。本发明指出，远志皂苷具有改善肠道菌群失调的作用，可使得肠道内的有益菌显著增加和抑制有害菌的生长。

优选的，所述肠道菌群为放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门或疣微菌门。

本发明还提供了一种肠道菌群调节剂，包括作为活性成分的远志皂苷，还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。

优选的，所述肠道菌群调节剂的制剂形式为片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、栓剂或口服液。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明对远志皂苷的应用展开进一步发掘，开拓了远志皂苷在调节补体系统和改善肠道菌群中的作用，为制备、开发新型补体调节剂和肠道菌群调节剂提供了助力，具有很好的应用前景。

附图说明

图1表示基于UHPLC-TOF-MS/MS法对远志皂苷的分离鉴定结果；

图2表示远志皂苷的抗氧化测试结果；

图3表示远志皂苷对于短期治疗组中肠菌种类的组成情况；

图4表示远志皂苷对于长期治疗组中肠菌种类的组成情况；

图5表示远志皂苷对于短期治疗组和长期治疗组小鼠肠菌种类多样性指数分析结果；

图6表示远志皂苷对于短期治疗组和长期治疗组小鼠肠菌种类数量变化情况；

图7表示远志皂苷对长期治疗组的各肠菌门类变化情况；

图8表示经远志皂苷处理后放线菌门显著增加的属；

图9表示经远志皂苷处理后拟杆菌门显著增加的属；

图10表示经远志皂苷处理后厚壁菌门显著增加的属；

图11表示经远志皂苷处理后变形菌门显著下降的属；

图12表示经远志皂苷处理后疣微菌门的Akkermansia属的双向变化；

图13表示采用衰老相关基因高通量阵列对年轻组和老年对照组小鼠的血液样本的分析结果；

图14表示图13中相关基因的表达变化幅度；

图15表示采用衰老相关基因高通量阵列对远志皂苷治疗组和老年对照组小鼠的血液样本的分析结果；

图16表示图15中相关基因的表达变化幅度；

图17表示采用衰老相关基因高通量阵列对年轻组和老年对照组小鼠的脑样本的分析结果；

图18表示图17中相关基因的表达变化幅度；

图19表示采用衰老相关基因高通量阵列对远志皂苷治疗组和老年对照组小鼠的脑样本的分析结果；

图20表示图19中相关基因的表达变化幅度；

图21表示远志皂苷对小鼠脑组织中补体系统基因和蛋白表达变化；

图22表示远志皂苷对老年小鼠模型的神经保护作用；

图23表示远志皂苷对于延长线虫寿命的影响。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实验材料和方法

抗体：Anti-C3(#ab200999)，购于abcam公司；PSD 95(#3409)，Erk(#4695)，Phospho-Erk(#4695)，BDNF(#47808)和AKT(#9272)，购自Cell Signaling Technologies公司；Phospho-Akt(#sc-16646)，购于Santa Cruz公司。

试剂：RT2 Profiler PCR Array-PAMM-178Z-Mouse Aging试剂盒，小鼠粪便DNA提取试剂盒，无RNA酶水，购自Qiagen公司；血液和组织样本RNA提取纯化试剂盒，购于Favorgen生物技术公司；SYBR Green荧光染料，TRIzol试剂和cDNA逆转录试剂盒，购自于Thermo Fisher Scientific公司。HBSS缓冲液及PBS缓冲液，购于Invitrogen公司。

远志皂苷的提取方法

将远志的根茎浸泡在70-80％乙醇中过夜，冷凝回流提取2h，经过滤后，将提取液减压旋转蒸发，浓缩成稠浸膏；所得稠浸膏用30％甲醇溶解，离心取上清液上样，利用反向硅胶柱分离，流动相为50-100％甲醇水溶液，进行梯度洗脱，收集70％-80％甲醇洗脱部分，即为所提取的远志皂苷成分(RPS)。

采用UHPLC-DAD-QTOF-MS/MS联用方法对提取得到的远志皂苷进行检测，结果如图1所示，图1中A-C分别表示远志皂苷的离子色谱图TIC、提取离子色谱EIC以及高效液相紫外吸收图谱DAD。

动物分组和给药

选用C57BL/6雄性小鼠，30周龄，共32只。将上述小鼠随机分为4组(n＝8)，分组的详情如下：1)老年对照组，正常饮水；2)远志皂苷低，中，高3个剂量组，即0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.2mg/mL剂量组；每组实验动物日常饮用分别含有浓度为0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.2mg/mL远志皂苷的水溶液；直到小鼠喂养第78周小鼠开始出现死亡病例。并与8周龄年轻C57BL/6雄性小鼠(n＝8)作为对照组，麻醉后收集小鼠脏器，组织和血液，提取相应的蛋白，分离纯化RNA，-80℃保存备用。

血样总RNA纯化

将小鼠麻醉后，从小鼠眼底静脉丛收集全血样品EDTA-2Na抗凝管中。血液RNA提取过程参照Favor Prep血液/培养细胞总RNA提取纯化试剂盒完成。使用紫外分光光度计(NanoDrop2000，Thermo Fisher Scientific，MA，USA)测定RNA浓度和纯度。记录并于-80℃冰箱中保存备用。

组织总RNA提取

称取约100mg小鼠组织放于1.5mL EP管中，在冰上加入1mL预冷的PBS，洗涤一次，14000rpm离心，弃上清液。组织样品加入1mL Trizol裂解，并用匀浆器匀浆。按照组织样品RNA提取方法，加入100mL氯仿至Trizol裂解后的组织样品中，室温下孵育5分钟后，以14000rpm，4℃离心15分钟；小心吸取400μL上层水相，加入480μL异丙醇，通过涡旋振荡从水相中沉淀RNA，将混合物在冰上孵育20分钟，然后在4℃下以14000rpm离心10分钟，完全除去上清液，RNA沉淀在底部管。用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，涡旋混合样品，以10000rpm离心5分钟，重复上述洗涤步骤一次，并将所有剩余的乙醇风干5分钟。用50μL无RNase的水稀释RNA样品，并确定RNA浓度和纯度，RNA样品的A260/A280比率应不低于1.8，在-80℃保存备用。

实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)

实时定量PCR的反应体系为：650μL SYBR Green Master Mix，20μL cDNA(1μg RNA逆转录)模板，加入无RNA酶水定容至体积为1300μL，混匀上样，每个孔上样10μL。使用TheApplied BiosystemsViiA7 Real-Time PCR System进行PCR扩增反应，扩增条件如下：95℃，10分钟；95℃，15秒，40次循环；60℃，1分钟。应用2

细胞培养

离体培养的细胞系包括小鼠海马神经元细胞系(HT-22)，正常人肝细胞系(LO2)和肝癌细胞(HepG2)，均购于ATCC公司。HT-22和LO2细胞系用DMEM(Gibco)培养基培养。HepG2细胞系采用MEM培养基(Gibco)培养液。所用培养基均含10％胎牛血清，50U/ml青霉素和50μg/mL链霉素(Invitrogen)。细胞培养于温度为37℃，5％CO

实施例1：远志皂苷的抗氧化作用研究

活性氧(ROS)引起的氧化损伤是人类衰老和神经退行性疾病的常见危险因素之一。为了进一步阐明远志皂苷对机体的保护作用机制，我们采用双氧水400μM H

利用H

实施例2：远志皂苷对于改善肠道菌群失调的作用

实验采用16S扩增子测序技术对小鼠肠道菌群的系统发育进行分析。图3-图6显示出PCoA分布情况：短期治疗组(8周治疗组)小鼠肠道菌群种类组成变化不如长期治疗组(78周治疗组)显著。利用多样性指数(Observed，Chao1和Shannon)，短期和长期治疗组小鼠肠菌种类多样性变化不显著。如图3-图4的实验结果可知，短期治疗组的各肠菌门类变化较为平缓，而长期治疗组的变化较为明显；与对照组小鼠肠菌相比，经过远志皂苷长期治疗组小鼠肠菌中放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)的大量增加；而变形菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)则受到抑制。同时，进一步深入研究结果表明(图7-图12)，经过远志皂苷治疗的小鼠肠菌中，有益肠菌均显著增加，如放线菌门(phylum Actinobacteria)的Eggerthella，Bifidobacterium，Gordonibacter和Adlercreutzia属；拟杆菌门(phylum Bacteroidetes)的Gordonibacter和Adlercreutzia属；厚壁菌门(phylum Firmicutes)的Robinsoniella、Dehalobacterium、Eubacterium、Lactobacillus和Clostridium属；而具有潜在致病性的菌类经过远志皂苷治疗后显著下降，如变形菌门(phylum Proteobacteria)的Brucella、Citrobacter、Desulfovibrio和Koprimonas属，疣微菌门(phylum Verrucomicrobia)的Akkermansia属，以上结果表明远志皂苷具有对于改善肠道菌群失调的作用。

实施例3：远志皂苷对小鼠血液样本中衰老相关基因表达的影响

为验证远志皂苷的抗衰老作用，受试C57BL/6小鼠从30周龄开始，日常饮用分别含有远志皂苷的水溶液的水溶液，直到小鼠喂养第78周小鼠出现死亡病例时，麻醉后收集小鼠血液，提取纯化RNA，逆转录成cDNA。通过实时定量PCR阵列技术对与衰老有关的84个基因进行高通量筛选。如图13-图14显示：与老年对照组(108周龄)比较，血液样本中年轻组小鼠(8周龄)中有15个基因表达高于2倍以上，包括：Gsta1，Ltf，Cx3cl1，Gfap，C1qc，Calb1，Zfp9，Eml1，Cfhr1，Jakmip3，C1qb，Fcgbp，Cd163，C1qa，C1s1。部分基因表达低于老年对照组小鼠1.5倍以上，包括：Zfr，Clu，Snap23，B2m，Tollip，C3，Ccr1，S100a9。图15-16显示：经过远志皂苷长期治疗的小鼠某些基因表达较老年对照组小鼠上调1.5倍以上，包括：Gsta1，Cfhr1，Eml1，Fcgbp，C1qc，Calb1，Cx3cl1，Cd163，Chr1，Gfap，Jakmip3，Ltf，Zfp9，C1s1，C1qa，C1qb，C4a和Lmnb2；而C3，Fcgr1，Fcgr3基因较之下调1.5倍以上。

实施例4：对小鼠脑组织中衰老相关基因表达的影响

衰老最显著的特征是大脑功能的衰退，例如记忆力下降和认知障碍等。最常见的神经退行性疾病是由衰老引起的，脑部从分子到形态水平的发生变化。为了探索远志皂苷调控小鼠脑部衰老相关基因表达的作用，用实施例3中给药78周后收集小鼠脑组织，提取了RNA并合成cDNA。如图17-18显示：与老年对照组相比，年轻对照组小鼠中部分与衰老相关的基因表达降低1.5倍以上，包括：C1qc，C1qb，Fcer1g，Ltf，C1qa，Fcgr2b，C3ar1，Tlr2，Gfap，C4b和C3基因，尤其是补体成分C3基因的下降幅度达到4.57倍。图19-20显示：与老年对照组比较，经过远志皂苷(RPS)长期治疗后的小鼠，脑组织中补体系统基因C1qb，C1qa，C3，C1qc和C4b基因表达降低至少1.5倍。

综上所述，远志皂苷可通过调节补体系统基因表达恢复到与年轻对照组相当的水平，起到抗衰老的作用。

实施例5：小鼠脑组织中补体系统基因和蛋白表达进一步验证

免疫和炎症反应基因与衰老过程密切相关，影响器官或细胞水平的生理功能，尤其以补体系统在神经炎症中起着重要作用。基于以上衰老相关高通量筛选结果，我们选择与炎症反应相关的补体系统基因和蛋白，在小鼠脑组织中进行深入验证。

结果如图21中A所示，年轻对照组和远志皂苷长期治疗组小鼠脑组织中与补体系统相关基因C3、C1qa、C1qb、C1qc基因表达水平均低于老龄对照组。而图21中B则显示：在年轻对照组和远志皂苷治疗组中，脑组织中补体成分C3蛋白表达均显著低于老年对照组。

本研究中使用的引物序列如下所示：

C1qa-F：5’-GAAAGGCAATCCAGGCAATA-3’(SEQ ID No.1)，

C1qa-R：5’-CTGGTTGGTGAGGACCTTGT-3’(SEQ ID No.2)；

C1qb-F：5’-AGACACAGTGGGGTGAGGTC-3’(SEQ ID No.3)，

C1qb-R：5’-GGTCCCCTTTCTCTCCAAAC-3’(SEQ ID No.4)；

C1qc-F：5’-GTTCAACAGCAAGCAGGTCA-3’(SEQ ID No.5)，

C1qc-R：5’-CGGGAAACAGTAGGAAACCA-3’(SEQ ID No.6)；

C3-F：5’-AAGCATCAACACACCCAACA-3’(SEQ ID No.7)，

C3-R：5’-CTTGAGCTCCATTCGTGACA-3’(SEQ ID No.8)；

β-actin-F：5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’(SEQ ID No.9)，

β-actin-R：5’-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’(SEQ ID No.10)。

实施例6：远志皂苷对老年小鼠模型的神经保护作用

神经营养因子和炎症标志物在衰老和神经退行性疾病的病机中发挥重要作用。如阿尔茨海默病患者的血清脑源性神经营养因子(BDNF)水平高于健康对照组，因此推测BDNF表达的的增加可能对早期衰老脑炎症相关的神经退行性疾病起到保护作用。在神经元细胞中研究报导过诱导突触后的炎症性脑组织变化。同样，通过免疫印迹法检测到的老年小鼠小鼠脑组织中PSD 95的炎症反应变化，证实了老年小鼠大脑中星形细胞增多和突触后变化的发生(如图22中A所示)。老年小鼠脑组织中BDNF蛋白表达水平较年轻对照组明显升高，揭示BDNF的升高可能反映了一种衰老相关的神经退行性疾病的代偿机制，该机制与神经炎症有关。

图22中B-C的结果显示，衰老小鼠脑组织中与衰老进程相关的p-ERK和p-AKT蛋白表达显著高于年轻对照组小鼠和远志皂苷治疗组小鼠，且远志皂苷治疗老年组小鼠脑组织中的BDNF、PSD 95、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平与年轻对照组小鼠相当。以上结果表明，经远志皂苷的治疗，有效缓解了老年小鼠脑部与衰老相关蛋白的病理变化。

如图22中D所示，通过Y-迷宫实验对小鼠空间识别能力进行检测，结果表明远志皂苷治疗组空间识别能力较补体C3抑制剂组和空白对照组小鼠显著提高。综上所述，远志皂苷通过调节补体系统C3表达，从而达到神经保护的作用。

实施例7：远志皂苷对于延长线虫寿命的影响

本实施例通过线虫在体实验进一步验证远志皂苷的抗衰老作用。将野生型N2蠕虫从其L4龄幼虫期或早期成虫分别给予远志皂苷和C3抑制剂(Compstatin)干预，直至线虫死亡。图23中A结果表明，经过远志皂苷和C3抑制剂干预后，蠕虫存活时间较对照组分别延长14.9％和16.4％。线虫成虫第15天的咽泵结构是蠕虫衰老相关表型的重要指标，可分为三种类型，分别为I型”咽泵结构完整，“II型”咽泵结构部分可见，“III型”咽泵结构不可见(如图23中B所示)。如图23中C所示，经远志皂苷和compstatin治疗后，N2蠕虫中咽泵I型和II型的比例分别为84％，76％，经治疗的N2蠕虫咽泵I型和II型比例仅为55％，说明近一半未处理的N2蠕虫在成虫第15天时咽泵结构发生了退化，而远志皂苷和compstatin处理的大多数蠕虫咽泵结构仍保持相对完整，因此说明远志皂苷能够延缓线虫衰老相关表型的下降，延缓衰老。

图23中D显示，经远志皂苷和compstatin治疗后，分别在成虫第5、10、15天时检测蠕虫泵送速率，发现成虫的泵送速率在第10天和第15天显著增加，而未经处理的成虫泵送速率则逐渐下降。图23中E显示，随着年龄的增长，空白对照的蠕虫的运动功能下降，而药物处理组运动功能则显著改善。线虫的摄食能力和弯曲行为在衰老过程中产生下降，同时内源性肠道自身荧光物质脂褐素会在衰老过程中逐渐积累，图23中F-G的结果显示，远志皂苷和compstatin处理后的虫体内脂褐素的荧光强度在成虫第10天分别降低了54％和62％，表明远志皂苷和compstatin抑制了脂褐素在虫体内的积累，延缓线虫衰老。综上所述，远志皂苷可通过降低补体系统C3蛋白和基因表达水平，延长线虫的寿命，延缓衰老相关表型的下降。

SEQUENCE LISTING

<110> 澳门科技大学

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