一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异 株变异的引物组合物和试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒是冠状病毒科、单股正链RNA病毒。与以往的病毒感染不同， 新型冠状病毒感染初期在患者体内大量复制，但并不会引起宿主明显的炎症反应， 因此患者根本无法意识到自己已被感染，然而此时的患者已经具有传染性，从而 导致周围的人也被感染，造成疫情大规模肆虐。目前新型冠状病毒疫苗的广泛使 用，对于疫情的成功防控发挥了重要的作用，然而目前的疫苗仍处于不断完善阶 段，即使接种了疫苗也不能保证不会再被新型冠状病毒感染，而且针对新型冠状 病毒的特效药缺乏。因此，对新型冠状病毒进行准确、快速的检测，及时切断传 染源仍然是目前疫情防控的最主要手段之一。

新型冠状病毒是一种RNA病毒，极易发生变异，目前已被发现的变异有几 千种之多。而刺突糖蛋白(S蛋白)是新型冠状病毒与宿主受体(ACE2)结合 的关键蛋白，其变异对于病毒的传播速度和免疫逃逸有重要的影响，当前发生于 S蛋白的重要变异有N501Y、D614G、P681H、E484K、K417N和P681R等。目 前新型冠状病毒的变异株主要分为三大类：关注的变异株(variant of concern, VOC)、感兴趣的变异株(variant of interest，VOI)或正调查的变异株(variant under investigation，VUI)、监控的变异株(variant undermonitoring，VUM)。据报道， 新型冠状病毒的VOC变异株传播速度显著增快，例如英国Alpha变异株(B.1.1.7) 传染性增加56％，南非Beta变异株(B.1.351)传染性也显著增加，巴西Gamma 变异株传染性增加1.4-2.2倍，印度Delta变异株(B.1.617.2)传染性提高100％， 秘鲁Lambda变异株(C.37)传染性和疫苗的抵抗力可能变强。其中目前传染速 度最快的VOC是Delta变异株(B.1.617.2，印度变异株)，Delta变异株感染具 有感染者病毒载量高、传播速度快(10天左右传播5代)、患者病情进展迅速、 核酸转阴时间长等新特点，因此，准确的检测出新型冠状病毒并对其进行准确分 型，及时了解新型冠状病毒的动态变化，对于新冠肺炎的诊断、疫情的防控和相 关政策的制定具有重要意义。世界卫生组织专家称：Delta变异株目前波及全球 90多个国家，正成为全球主要流行的变异毒株，有可能引起新一波疫情大流行。

最新的研究表明新型冠状病毒Delta变异株中S蛋白L452R和T478K突变 导致其传播速度显著增快，加大了疫情防控的难度，因此及时掌握该病毒的变异 状况至关重重要，但目前针对Delta变异株的特征性新突变(L452R和T478K) 缺乏高效、简单、快速的检测手段和试剂盒。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种快速检测SARS-CoV-2 Delta 变异株变异的引物组合物和试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引 物组合物，包括针对L452R的引物体系和针对T478K的引物体系；

上述针对L452R的引物体系包括序列为SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6或序 列为SEQID NO.8～SEQ ID NO.12的引物以及序列为SEQ ID NO.7的探针；

上述针对T478K的引物体系包括序列为SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.19或 序列为SEQ ID NO.15、17、21-23的引物或序列为SEQ ID NO.14-17、23-24的 引物或序列为SEQ IDNO.15、17、23、25-26的引物以及序列为SEQ ID NO.20 的探针。

本发明的第二方面是提供一种包括上述引物组合物的快速检测SARS-CoV-2Delta变异株变异的试剂盒。

进一步地，上述试剂盒还包括反应缓冲液、酶溶液、荧光染料和去离子水。

进一步地，上述荧光染料为SYBR Green。

进一步地，上述酶溶液的浓度为8U。

本发明的第三方面是提供采用上述试剂盒的快速检测SARS-CoV-2 Delta变 异株变异的方法，所采用的扩增体系的总体积为25μL，针对L452R或T478K变 异，包括：2×反应缓冲液12.5μL，各个引物的体积均为0.5μL，PNA:0.5μL，酶 溶液1μL，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL，去离子水将终体积补足至25μL。

进一步地，在上述扩增体系中，引物F3和B3的终浓度均为0.2μmol/L；引 物FIP和BIP的终浓度均为1.6μmol/L，引物LF、LB和PNA的终浓度均为0.8 μmol/L。

进一步地，上述方法所采用的LAMP反应程序为：58℃-68℃，70min；所 采用的仪器为PCR仪。

进一步地，上述方法对结果的判读标准为：若CT值<50，即判断为阳性。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的引物组合物灵敏度高、特异性强，相应的试剂盒在使用过程中 不受退火温度的限制，易于实现多靶标的同步检测，此外，无需复杂、昂贵的辅 助设备，在30-60min内即可准确检测出Delta变异株，便于及时的掌握病毒的变 异状况，具有良好的应用前景。

附图说明

图1显示了本发明一实施例中验证针对变异L452R(图A)、T478K(图B) 的检测试剂盒的灵敏度；其中，图中的扩增曲线从右向左，对应的模拟样本浓度 分别为：2×10

图2显示了本发明一实施例中验证针对变异L452R(图A)、T478K(图B) 的检测试剂盒的特异性。

具体实施方式

本发明提供了一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物和 试剂盒，特使是针对Delta变异株的特征性新突变(L452R和T478K)设计了特 异性LAMP引物，并采用PNA探针对扩增体系中的非特异性模板(野生型核酸) 进行封闭，以提高LAMP检测体系的特异性。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理 解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使 用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供一种针对SARS-CoV-2 Delta变异株的特征性新突变(L452R 和T478K)的LAMP引物组合物，主要包括针对L452R的引物体系和针对T478K 的引物体系。

其中，L452R对应的的野生型靶序列(共399bp)如下所示：

TAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAA TTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATT GCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTG GAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTAC

表1针对L452R变异的引物体系

T478K对应的的野生型靶序列(共401bp)如下所示：

TCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGAT GATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGG TTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAA CCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGC

表2针对T478K变异的引物体系

实施例2

本实施例提供含有上述引物组合物的快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变 异(L452R和T478K)的试剂盒，其还包括：反应缓冲液、酶溶液、SYBR Green 荧光染料和去离子水。

此外，采用该试剂盒的SARS-CoV-2Delta变异株变异(L452R和T478K) 的方法包括如下：

步骤一，获取待测样本并提取基因组DNA；

步骤二，配制扩增体系，该扩增体系的总体积为25μL，针对每一种变异， 包括：2×反应缓冲液(RM)12.5μL，引物F3:0.5μL(终浓度0.2μmol/L)，引物 B3：0.5μL(终浓度0.2μmol/L)，引物FIP：0.5μL(终浓度1.6μmol/L)，引物 BIP：0.5μL(终浓度1.6μmol/L)，引物LF：0.5μL(终浓度0.8μmol/L)，引物 LB：0.5μL(终浓度0.8μmol/L)，PNA:0.5μL(终浓度0.8μmol/L)，酶溶液1μL (8U)，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL,去离子水将终体积补足至25μL；

步骤三，设置LAMP反应程序为58℃-68℃,70min(每个循环1min，扩增 70个循环)；采用PCR仪进行扩增；

步骤四，扩增结束后，对结果进行判读：CT值<50(或50min内出扩增曲 线)，即判断为阳性。

验证实施例

本实施例对实施例2提供的试剂盒(以表1和表2中的引物体系1为例)以 及对应的方法进行灵敏度和特异性验证，具体的步骤和结果如下：

1.灵敏度：制作梯度浓度的模拟样本，具体浓度为2×10

2.特异性：采用上述试剂盒和方法对临床常见的呼吸道病原甲型流感病毒 RNA、乙型流感病毒RNA、鼻病毒RNA、呼吸道合胞病毒RNA、肠道病毒RNA 和野生型新型冠状病毒模拟样本RNA进行扩增；由图2可知，仅阳性对照样本 出现了扩增曲线，其他样本均为出现任何扩增，表明所建立的L452R和T478K LAMP检测体系具有良好的特异性。

综上所述，本发明提供的快速检测SARS-CoV-2Delta变异株变异(L452R 和T478K)的试剂盒和方法灵敏度高、特异性强，适合大规模推广。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不 限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等 同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所 作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属华山医院北院

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