防治感染性炎症的靶向免疫抑制剂TCAbCD59

技术领域

本发明提供了一种靶向免疫抑制剂，属于多肽技术领域。

背景技术

流感病毒是导致人类疾病的一类重要病原，流感病毒和细菌共感染在流感大流行期间非常常见，最常见的细菌病原体是金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌和流感链球菌等。这些细菌存在于人类的鼻咽部，从那里可以传播到下呼吸道。病毒感染后可由无症状转为有侵袭性，在呼吸道感染期间人数多于带菌者，死亡病例中有相当大的比例伴有细菌性感染。共感染后发生的重症肺炎是导致流感流行期间高死亡率的一个重要原因。而与流感发生共感染的细菌中，金黄色葡萄球菌的病死率最高，并且近年来呈共感染比例升高的趋势。共感染导致的重症肺炎与补体异常激活有关。

补体系统是机体重要的防御体系，但若被不适当地激活也可引发免疫病理反应，对机体组织造成损伤。补体激活的途径有3个，即经典途径、旁路途径和甘露聚糖结合凝集途径。补体系统由参与宿主防御病原体的效应蛋白、调节因子和受体组成。参与补体经典激活途径的成分包括C1-C9。补体激活调节因子(regulators of complement activation，RCA)家族，包括补体第一型受体(complement receptor typeⅠ，CR1)、补体第二型受体(complement receptor typeⅡ，CR2)、衰变加速因子(Decay-acceler-ating factor，DAF，CD55)、膜辅蛋白(Membran cofactor protein，MCP，CD46)、C4结合蛋白(C4 bindingprotein，C4bp)及H因子6个成员，它们均可作用于补体前端反应，抑制经典及替代途径C3和C5转化酶的形成或加速其衰变。C3d分子和作为其受体的CR2在补体激活途径及体液免疫和细胞免疫激活进程中扮演了重要角色，其可以阻断或者竞争性抑制C3d分子与CR2的结合可以下调及抑制补体激活以阻断自身免疫性疾病病理进程。

在之前的共感染实验研究中发现，共感染小鼠病变肺组织中出现大量的补体C3d分子和补体攻膜复合物(C5b-9)的沉积。C3d沉积的程度与流感病毒增殖的程度呈正相关，且病毒分布的部位同样是C3d沉积较多的部位，提示流感病毒在补体激活过程中可能发挥了关键作用，补体抑制性调节因子，特别是CD55和CD59分子的表达水平明显下调。CD59是18-20kDa糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的膜糖蛋白，它最初分离自人红细胞表面，作为补体激活的抑制剂。已知CD59抑制补体激活后的膜攻击复合物(MAC)形成。MAC形成是补体级联的最终事件之一，在细胞膜上形成小孔，这最终导致细胞的破坏。CD59结合C5b-8，干扰C9分子的后续聚合和MAC形成。

补体靶向疗法在过去几年发展成为一个非常活跃的领域。大量临床前研究表明，靶向补体抑制剂比其非靶向同源物更有效，靶向药物可能具有更低的感染风险。例如，作为补体激活凝集素通路(LP)的调节分子——甘露糖结合凝集素相关蛋白-1(MAP-1)，分别与补体受体1(CD35)和衰变加速因子(CD55)两种膜锚定的调节分子结合，构成2种新型可溶性嵌合抑制剂MAP-1:CD35123和MAP-1:CD55124，通过中间分子使MAP-1与LP靶向结合，从而靶向发挥CD35和CD55的补体调节作用

单链抗体是用基因工程方法制备的小分子抗体，是由弹性连接肽(一般为12-15个氨基酸)将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接而成的重组抗体，其分子量只相当于原天然抗体的六分之一，但单链抗体含有全部的抗原结合位点，所以单链抗体最大程度地保留了抗体的抗原结合活性，是具有亲本抗体抗原结合活性的小片段，从而可以使其达到常规抗体难以达到的病灶组织；而且由于单链抗体不含有Fc段，因此不会跟无关细胞上的Fc受体结合，避免了Fc段所致的免疫复合物反应。因此，通过抗C3d抗体的靶向作用对补体激活发挥特异性抑制作用是一种新的治疗思路。

中国发明专利申请CN110922489A公开了一种抗C3d抗体的单链抗体与CD59的融合蛋白，该融合蛋白对补体介导的CHO细胞和红细胞裂解抑制具有非常高的抑制效率，可在类风湿关节炎小鼠模型的关节炎部位快速高度聚集，具有优异的抗黏附/抗炎靶向抑制效应；且对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状具有明显的改善。

但是，基于病理学的差异以及病灶分布特点的不同，对于现有技术存在的流感病毒与细菌共感染中重症肺炎的补体抑制治疗，目前还缺乏有效的技术手段，本发明的目的就是提供一种新的具有优异靶向性能的抗C3d单链抗体以及抗C3d单链抗体与补体抑制剂CD59的融合蛋白，使得抗C3d单链抗体能够将补体抑制剂CD59靶向至流感病毒与细菌共感染病灶从而产生优异的治疗效果。

发明内容

基于上述目的，本发明构建了一种人源抗补体C3d分子的单链抗体和补体抑制剂CD59的融合蛋白，其中C3d-ScFv为抗C3d分子的单链抗体，靶向结合区域。本发明利用人重组C3d蛋白和大容量全合成人源噬菌体单链抗体库，通过噬菌体展示技术经过3轮筛选，并经亲和力检测鉴定，得到了构建靶向补体抑制物中最佳的单链抗体B6，其编码片段约为750bp，相对分子量约为25KDa。本发明提供的人源抗补体C3d分子的单链抗体B6的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2的第23-33、48-55和88-96位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4的第30-35、50-66和99-107位氨基酸序列所示。

在一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一个更为优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区与重链可变区以氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的柔性多肽连接。

在特异性靶向C3d单链抗体的基础上，本发明构建了高亲和力较高，靶向补体抑制效果好的靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59。通过扩增表达，得到了与预期大小相符的靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59。在一个优选的技术方案中，所述单链抗体与CD59分子以SEQ IDNO.8所示的柔性多肽连接。

更为优选地，所述单链抗体位于融合蛋白的氨基端。

尤为优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。在本发明中，具有该氨基酸序列的融合蛋白被命名为“TCABCD59(Targeting Complement Antibody CD59)”。

本发明提供的靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59与C3d的结合力达到了纳摩尔级别，与C3d-ScFv相近，具有很高的亲和力。

C3d-ScFv-CD59在一定浓度范围内比对应单独的效应分子CD59具有更为明显的抑制效果，并且两者都是靶向识别了补体激活区域的C3d成分发挥补体抑制作用。

其次，本发明提供了一种编码上述融合蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.9所示。

最后，本发明提供了上述的融合蛋白在制备流感病毒和细菌共感染肺炎治疗药物中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述肺炎包括流感病毒和金黄色葡萄球菌共感染肺炎。

本发明提供的靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59可明显提高流感病毒/细菌共感染小鼠的生存率，并且相对于单独的效应分子CD59对重症肺炎损伤具有更为明显的靶向补体抑制治疗效果。C3d-ScFv-CD59在某个剂量附近对共感染小鼠的治疗达到一个较高的生存率，并且生存率的高低随着剂量的不同呈现一定的变化趋势。C3d-ScFv-CD59靶向集中在肺部炎症区域，并且相对于单独的效应分子CD59能够较高程度升高小鼠的生存率，缓解肺部病理损伤，降低肺指数，有效抑制补体激活。

本发明提供的靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59易于工业化生产，在制备流感病毒和细菌共感染疾病治疗药物中具有优异的应用前景。

附图说明

图1.真核表达载体p-ABλ质粒图谱；

图2.单链抗体表达产物Western blot鉴定图谱；

图3.forteBIOTM系统测试C3d单链抗体B6亲和力定结果图；

图4.C3d-ScFv-CD59的SDS-PAGE和Western Blot结果图；

图5.forteBIOTM系统测试C3d-ScFv-CD59亲和力定结果图；

图6.C3d-ScFv-CD59体外细胞溶血抑制曲线；

图7.C3d-ScFv-CD59与C3d的中和抑制曲线；

图8.共感染小鼠模型的PR8浓度梯度预估结果统计图；

图9.共感染小鼠模型的MRSA金葡菌剂量统计结果图；

图10.C3d-ScFv-CD59治疗各组的最终生存率比较；

图11.C3d-ScFv-CD59及CD59治疗共感染小鼠的生存率曲线图；

图12.C3d-ScFv-CD59及CD59治疗共感染小鼠的肺组织病理损观察图；

图13.C3d-ScFv-CD59及CD59治疗共感染小鼠的肺指数变化分析图；

图14.C3d-ScFv-CD59及CD59治疗共感染小鼠肺组织C3d免疫荧光观察图；

图15.C3d-ScFv-CD59及CD59治疗共感染小鼠肺组织组织化学评分H-score分析图；

图16.C3d-ScFv-CD59及CD59治疗共感染小鼠肺组织His标签免疫荧光(scale bar＝100μm)观察图；

图17.C3d-ScFv-CD59及CD59治疗共感染小鼠肺组织组织化学评分H-score分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。本发明具体实施方式中所使用的试剂除特别说明外，均为常规的市售试剂，所述及的每一个具体操作步骤除特别说明外，均为本领域的常规操作，本领域技术人员根据说明书的公开内容结合本领域常规技术手段和技术常识均能够操作实现本发明。

实施例1.人源噬菌体单链抗体C3d-ScFv的构建

1.1大容量全合成人源噬菌体单链抗体库的构建参见中国专利200910091261.8。

1.2人源抗人C3d单链抗体的筛选

共进行三轮的人源抗人C3d单链抗体的筛选

(1)抗原包被：将人重组C3d蛋白包被免疫管4℃包被过夜。

(2)封闭：以含2％(w/v)BSA的PBS封闭免疫管，同时用含2％(w/v)BSA的PBST(含0.1％Tween20)封闭噬菌体抗体库，37℃封闭1h。

(3)结合：将封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管，4℃静置结合过夜；

(4)洗涤：用PBST和PBS洗涤。

(5)洗脱：以1ml 0.2mol/l的甘氨酸-盐酸(pH 2.2)洗脱。

(6)感染：以对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue感染。

(7)计数与扩大培养：将感染菌液均匀涂布于2YT-CTG平板，37℃静置培养过夜，计算出产量。剩余菌液扩大培养。

(8)呈现：将菌落刮以2YT-CTG液体培养基培养至OD

(9)回收次级噬菌体上清：次日回收噬菌体上清，加入1/4体积的PEG-NaCl沉淀剂,充分混匀后冰上静置2h，沉淀噬菌体，4℃，6010×g离心40min，弃上清，沉淀重悬于5ml含有2％BSA的PBS缓冲溶液中，吸取少许测定扩增滴度，剩余用于下一轮筛选。

(10)噬菌体滴度测定：取5μl待测噬菌体上清，稀释到495μl培养基中，混匀后取5μl依次稀释，共3次；取50μl稀释到450μl培养基中，混匀后取50μl依次稀释，共3次；六个稀释度依次编号1～6，向4～6三个稀释度对应EP管中加入等体积的对数生长期XL1-Blue，混匀后室温静置感染30min，37℃、150r/min培养1h，各取200μl涂于2TY-CTG和2YT-TKG培养板，37℃培养过夜，菌落计数并估算滴度。

1.3人源抗人C3d单链抗体阳性噬菌体克隆的呈现与鉴定

(1)单克隆培养：挑取经筛选后的单克隆菌落，接种于含有2YT-CTG培养基的96孔深孔板中，37℃培养过夜至饱和。

(2)转接：取过夜培养菌转接到新的2YT-CT培养96基孔深孔板中培养至OD

(3)感染：按感染复数MOI＝50:1，100ul/孔加入辅助噬菌体M13K07，室温静置30min，然后转入37℃、150r/min培养1h。

(4)诱导表达(呈现)：加入等体积2YT-CTKI培养基(至Kana终浓度为50μg/ml，IPTG终浓度为0.15mmol/L)培养12h诱导噬菌体表达。

(5)上清收集：次日离心收集上清，即为噬菌体抗体上清。

(6)ELISA鉴定阳性克隆：酶标仪检测并计算“OD492nm-OD630nm”值。经ELISA鉴定，获得44个特异性结合补体蛋白C3d的阳性克隆，阳性率为46.3％。阳性克隆测序结果显示，44个阳性抗体中3个单链抗体基因富集明显，分别命名为A1、A3、B6。

1.4人源抗人C3d单链抗体表达载体的构建及表达纯化

(1)利用PCR法扩增获得的抗人C3d噬菌体阳性克隆的三个目的基因片段。PCR法扩增体系见表1。

表1.PCR法扩增体系

(2)三种基因扩增产物使用BsrGⅠ和BamHⅠ双酶切。酶切体系：20μl(Buffer：2μl，BsrGⅠ：1μl，BamHⅠ：1μl，片段：16μl)，37℃，2h。

(3)1％琼脂凝胶电泳检测，观察结果。

(4)利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化抗体基因片段，并与同样双酶切的真核表达载体p-ABλ(质粒图谱见图1)片段进行连接。

(5)将连接有抗体基因的载体转化到感受态细胞Top10中。

(6)次日，挑取单克隆，进行测序鉴定。

(7)表达纯化：吸取30μg质粒溶于1ml Opti-MEM，轻轻混匀，40μl的293fectin溶于960μl Opti-MEM，轻轻混匀，将质粒溶液与293fectin溶液混合均匀，瞬时转染到HEK293-F细胞中，37℃，5％CO2培养箱中培养3.5d，离心收集培养上清，使用AKTA层析系统与镍金属离子螯合的预装柱对带有His标签的上清进行纯化，分别用含20mmol/l咪唑洗去杂蛋白及500mmol/l咪唑洗脱目的蛋白，以12％SDS-PAGE凝胶电泳以及Western blot鉴定目的蛋白条带。用抗His的抗体进行Western blot实验，对纯化的蛋白进行鉴定，在25KDa处出现条带(图2)，表明纯化的蛋白带有His标签。

1.5人源抗人C3d单链抗体亲和力测定

使用forteBIOTM系统的生物膜层干涉技术(Bio-Layer Interferometry)鉴定单链抗体与C3d蛋白的亲和力。

经亲和力检测鉴定，A1，A3，B6三种单链抗体平衡解离常数分别为8.26×10

实施例2.C3d-ScFv-CD59靶向补体抑制物的构建与鉴定

利用PCR扩增技术扩增单链抗体基因片段、CD59基因片段；分别利用上游引物：B6F，下游引物：B6-CD59-R扩增单链抗体片段(引物序列见表2)；利用上游引物CD59-F，下游引物：CD59-his-R扩增CD59基因片段。PCR反应体系同实施例1。

表2.构建靶向补体抑制物的引物序列

利用PCR技术将单链抗体片段与CD59片段分别连接上游引物B6F，下游引物分别为CD59-his-R。PCR体系(同上)。靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59的表达纯化：方法同实施例1。

C3d单链抗体和CD59的编码基因序列长度分别为744bp和231bp；C3d-ScFv-CD59的编码基因序列长度为1002bp。经表达得到C3d-ScFv-CD59靶向补体抑制物，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，表达的靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59在相对分子量约为36KDa处呈现单一条带(图4之左)，电泳结果所展示的条带长度与理论值基本符合(图4),表达蛋白的纯度大于90％。

用抗His的抗体进行Western blot实验，对纯化的蛋白进行鉴定，C3d-ScFv-CD59靶向补体抑制物分别在36KDa处出现条带(图4之右)，表明纯化的蛋白带有His标签。

C3d-ScFv-CD59靶向补体抑制物与C3d的平衡解离常数为2.19×10

表3.靶向补体抑制物与人重组蛋白C3d的动力学分析指标

实施例3.血清总补体溶血活性(CH50)测定

3.1配制缓冲液

(1)贮存液：

Na

KH

NaCl 17.00g

(加蒸馏水至100毫升，4℃保存)

(2)应用液(缓冲液)：5毫升贮存液加95毫升蒸馏水，再加10％硫酸镁0.1毫升。当日配制。12小时内使用。

3.2操作步骤(改良Mayer法)：

1)致敏羊红细胞：2％绵羊红细胞加等量稀释后的溶血素(1∶2000)，混匀，置37℃水浴30min。

2)稀释血清：待测血清0.2ml，加缓冲液3.8ml，稀释度为1∶20。

3)配制溶血标准管：2％绵羊红细胞2ml加8ml蒸馏水，混匀，即为全溶血管。取全溶血管液2ml加缓冲液2ml，即为50％溶血管。

4)按表2.5所示，依次加各成分于试管中，混匀，置37℃水浴30min。第10管为非溶血对照。

表2.5血清总补体溶血活性(CH50)加样剂量

结果测定：取出试管，2000r/min离心10min，对照管应不溶血。肉眼比色，选与50％溶血标准管相近二管，再用酶标仪测(波长542nm)OD值，确定与标准管最接近者为终点管，然后按下公式计算CH50值：血清补体CH50(U/ml)＝(1/血清用量)×稀释度。

3.3测定结果：离心后上清液颜色与50％溶血管最相近者为2，3管，所测OD值表2.7所示。与标准管最接近者为第3管，故为终点管。血清补体CH50(U/ml)＝(1/0.2)×20＝100(U/ml)。加样配比按第三管的比例执行。

实施例4.C3d-ScFv-CD59体外细胞溶血抑制实验

按照实施例3血清总补体溶血活性(CH50)测定中所得到的第3管的体系配比，以96孔板中每孔总量200μl为准，按照以下配比加样：

致敏红细胞 80μl

豚鼠血清(1∶20) 16μl

蛋白+缓冲液 104μl

C3d-ScFv-CD59和CD59蛋白稀释液设置浓度梯度为(μmol/l)：24，12，6，3，1.5，并设置阴性(不加蛋白和血清)和阳性(不加蛋白)对照。两种蛋白各加三组孔。

(4)结果测定：按照先蛋白+缓冲液，然后致敏红细胞，最后血清的顺序加样；在37℃条件下孵育30min；之后3000转，10min对96孔板进行离心，每孔取上清液100μl用酶标仪测OD值(波长410nm)。结果通过公式a(抑制率)＝(T

在0-24umol/l的浓度范围内，当浓度相同时，靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59比单独的效应分子CD59抑制率要高。随着浓度的增加，C3d-ScFv-CD59抑制率的增长幅度较单独的效应分子CD59要高，二者之间的差异逐步加大(图6)。

实施例5.C3d-ScFv-CD59与C3d的中和抑制实验

C3d-ScFv-CD59设置3个浓度梯度(μmol/l)：10，5，2.5；C3d对应不同的融合蛋白浓度，设置8倍、4倍、2倍、1倍、0.5倍、0.25倍、0.125倍、0倍的浓度进行倍比加样；并设置阴性(不加蛋白和血清)和阳性(不加蛋白)对照。每个浓度各加三组孔。

结果测定：C3d与融合蛋白混合后于37℃条件下孵育40min,；按照先蛋白+缓冲液，然后致敏红细胞，最后血清的顺序加样；在37℃条件下孵育30min；之后3000转，10min对96孔板进行离心，每孔取上清液100μl用酶标仪测OD值(波长410nm)。

如图7所示，阳性对照和阴性对照分别表示的是本体系之内红细胞裂解的最大和最小OD值体现。在所选择的10μmol/l，5μmol/l，2.5μmol/l三个浓度中，C3d-ScFv-CD59中随着所加C3d分子浓度倍数的降低，OD值整体均呈明显下降趋势，说明C3d-ScFv-CD59抑制因补体激活导致的细胞裂解的效果与C3d浓度呈负相关。

实施例6.C3d-ScFv-CD59靶向治疗PR8/MRSA共感染重症肺炎小鼠模型

实验动物为C57BL/6N雌鼠，实验病毒株为PR8流感毒株，实验细菌株为MRSA金黄色葡萄球菌。

6.1 PR8/MRSA共感染重症肺炎小鼠模型构建

6.1.1 PR8亚致死剂量确定

1)按3.5μl/g体重(52.5μl/只)腹腔注射10％水合氯醛溶液，约2min后小鼠进入深度麻醉。为使其麻醉彻底，滴鼻前将小鼠放入加无水乙醚的麻醉瓶中10s左右，立即取出滴鼻。

2)抓取小鼠并使其鼻孔向上，缓慢滴鼻PBS或感染病毒(PR8 25μl/只)液。先低浓度再高浓度(100μl装的PR8流感毒株液(病毒含量TCID

3)感染完成后，使小鼠处于侧卧状态。

4)待小鼠自然苏醒后，观察其恢复状况。

5)每天监测小鼠体重和死亡率。

从实验结果来看，10

6.1.2 MRSA金葡菌剂量确定

1)按3.5μl/g体重(52.5μl/只)对PBS组和PR8 10

2)按3.5μl/g体重(52.5μl/只)对MRSA OD1组、MRSA OD2组、d-2(10

3)每天监测小鼠体重和死亡率。

从结果来看，d-2(10

共感染重症肺炎小鼠模型中MRSA金葡菌剂量确定为2.5×10

6.2 C57BL/6N小鼠按表5分组。

表5.靶向补体抑制物治疗共感染小鼠模型浓度梯度预估实验分组

6.3靶向补体抑制物治疗共感染小鼠模型实验步骤

共感染后第二天，即本实验总流程的第四天开始，进行尾静脉注射。将小鼠固定，暴露尾部。用酒精擦拭小鼠尾部。使用红外仪照射可使血管更清晰。用无菌棉球擦干鼠尾后，用1ml胰岛素注射器在小鼠尾部穿刺两侧血管，穿刺时针头与血管尽量保持平行。进针后回抽见血，说明进针成功，即可注射给药。小鼠尾静脉注射后，需用无菌棉球压迫注射点进行止血。分别对应各组的注射剂量按100μl/只进行注射，d-2组注射0.9％NaCl溶液。隔一天注射一次，一共三次。每天监测小鼠体重和死亡率。

6.4 C3d-ScFv-CD59靶向治疗PR8/MRSA共感染重症肺炎小鼠模型的生存率评价

从实验结果来看，C3d-ScFv-CD59各治疗组比对照组d-2/NS组平均体重略有提高，但大部分最终都在80％以下。

C3d-ScFv-CD59治疗各组与对照d-2/NS组相比，开始出现死亡病例的时间d-2/C3d-ScFv-CD59(60μg/只)组和d-2/C3d-ScFv-CD59(30μg/只)组延迟了1天，其他各治疗组未出现延迟；在最终的治疗效果上，d-2/C3d-ScFv-CD59(60μg/只)组最终的生存率相较d-2/NS组最高，提高了56％，d-2/C3d-ScFv-CD59(30ug/只)组，d-2/C3d-ScFv-CD59(15μg/只)组，d-2/C3d-ScFv-CD59(7.5μg/只)组，d-2/C3d-ScFv-CD59(3.75μg/只)组最终的生存率相较d-2/NS组分别提高了36％，29％，29％，23％(图10)。

通过分别用有效剂量的C3d-ScFv-CD59以及相同摩尔剂量的对应效应分子CD59对共感染小鼠进行治疗，结果如图11所示：d-2/C3d-ScFv-CD59组开始出现死亡病例时间比对照d-2/NS组延迟了1天，最终生存率相对提高了56％，而对应的单独效应分子d-2/CD59组开始出现死亡病例时间相对于对照d-2/NS组未延迟，最终生存率相对提高了23％。

6.5病理学评价

通过分别用有效剂量的C3d-ScFv-CD59以及相同摩尔剂量的对应效应分子CD59对共感染小鼠进行治疗，观察小鼠肺组织HE病理切片和肺组织大体标本，结果如图12所示：

d-2/C3d-ScFv-CD59组在共感染后第3d、第5d和第7d肺组织病理损伤较d-2/NS组减轻，d-2/CD59组介于两者之间。共感染后第3d时，d-2/NS组肺组织可见大量肺泡壁增厚，伴有大量淋巴细胞与中性粒细胞浸润，组织中可见较大量的肺水肿，肺泡腔内可见嗜酸性浆液样物质渗出，组织中多见坏死细胞碎片；d-2/C3d-ScFv-CD59组肺组织肺泡壁上可见淋巴细胞与中性粒细胞浸润，局部可见肺水肿，肺泡腔内可见嗜酸性浆液样物质渗出，少见坏死细胞碎片；d-2/CD59组肺组织组织中可见较大量的肺水肿，肺泡腔内可见嗜酸性浆液样物质渗出，多见肺泡壁增厚，伴有较大量的淋巴细胞与中性粒细胞浸润，局部支气管上皮细胞坏死，核碎裂或溶解(图12a，e，i)。第5d时，d-2/NS组肺组织可见大量肺泡壁增厚，伴有大量淋巴细胞与中性粒细胞浸润，组织中可见较多肺水肿，肺泡腔内可见嗜酸性浆液样物质渗出；d-2/C3d-ScFv-CD59组肺组织肺泡壁上可见淋巴细胞与中性粒细胞浸润，组织边缘可见肺水肿，肺泡腔内可见嗜酸性浆液样物质渗出；d-2/CD59组组织中可见较多肺水肿，肺泡腔内可见嗜酸性浆液样物质渗出，肺泡壁上可见少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润，局部可见少量实质细胞坏死，核碎裂(图12b，f，j)。第7d时，d-2/NS组肺组织可见大量肺泡壁增厚，伴有大量淋巴细胞、中性粒细胞与少量巨噬细胞浸润，组织中可见较大量的肺水肿，肺泡腔内可见嗜酸性浆液样物质渗出；d-2/C3d-ScFv-CD59组支气管上皮结构完整，上皮细胞形态结构正常、排列紧密，肺泡壁轻度增厚，伴有少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润；d-2/CD59组组织边缘多见肺水肿，肺泡腔内可见嗜酸性浆液样物质渗出，肺泡壁上可见较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润(图12c，g，k)。

在肺组织大体标本中，d-2/NS组肺组织大范围充血水肿甚至出血，d-2/C3d-ScFv-CD59组肺组织充血、水肿和出血程度相对减轻，d-2/CD59介于两者之间(图12d，h，l)。

6.6有效剂量条件下C3d-ScFv-CD59对共感染小鼠肺指数的影响

通过分别用有效剂量的C3d-ScFv-CD59以及相同摩尔剂量的对应效应分子CD59对共感染小鼠进行治疗，观察小鼠肺指数变化，结果如图13所示：

d-2/C3d-ScFv-CD59组小鼠肺指数在共感染后第3d、第5d和第7d分别较d-2/NS对照组下降20.43％、10.04％和29.03％；d-2/CD59组小鼠肺指数在共感染后第3d、第5d和第7d分别较d-2/NS对照组下降13.62％、0.42％和24.60％(图13)。总体上，d-2/C3d-ScFv-CD59组和d-2/CD59组共感染小鼠的肺指数分别下降了19.83％和12.88％，d-2/C3d-ScFv-CD59组低于d-2/CD59组。

6.7有效剂量条件下C3d-ScFv-CD59对共感染小鼠抑制补体异常激活的影响

C3d属于补体通路的终末产物，在补体激活的终末阶段会沉积在激活区域表面。通过分别用有效剂量的C3d-ScFv-CD59以及相同摩尔剂量的对应效应分子CD59对共感染小鼠进行治疗，观察小鼠补体激活终末产物C3d含量变化，来评价补体激活的抑制程度，结果如图14所示：

d-2/NS组在共感染后第3d即开始出现明显的C3d沉积，至第5d小鼠肺部C3d沉积更加显著，肺泡腔结构缩小，至第7d小鼠肺部C3d沉积进一步加剧，小鼠肺泡腔结构基本消失(图14g，h，i)；d-2/C3d-ScFv-CD59组在共感染后第3d出现少量至中量C3d的沉积，至第5d和第7d小鼠肺部C3d沉积较第3d增多但不明显(图14a，b，c)；d-2/CD59组介于两者之间，更接近d-2/NS组(图14d，e，f)。d-2/C3d-ScFv-CD59组C3d总体沉积量最少。

组织化学评分(H-score)是一种组织学评分方法，数据越大说明综合阳性强度越强。结果中，d-2/C3d-ScFv-CD59组C3d的组织化学评分在3d，5d，7d相对于d-2/NS组和d-2/CD59组最低，C3d阳性强度最弱；d-2/NS组在3d，5d中C3d的组织化学评分最高，在7d中组织化学评分介于d-2/C3d-ScFv-CD59组和d-2/CD59组之间，总体C3d阳性强度最强；d-2/CD59组C3d的组织化学评分在3d，5d介于d-2/C3d-ScFv-CD59组和d-2/NS组两者之间，在7d最高，总体C3d阳性强度介于两者之间(图15)。

6.8有效剂量条件下C3d-ScFv-CD59对共感染小鼠治疗的靶向效果

用于治疗共感染小鼠的C3d-ScFv-CD59和CD59带有His标签，而对照d-2/NS组未用带有His标签的蛋白进行治疗，可以通过用抗-His抗体的免疫荧光检测观察靶向补体抑制物C3d-ScFv-CD59是否比其他治疗组更集中于肺部来观测其靶向治疗趋势，结果如图16所示：

d-2/C3d-ScFv-CD59组在第3d、第5d、第7d均有明显的肺部His标签蛋白集中，尤其在肺泡周边炎症病变较严重区域较为明显(图16a，b，c)；d-2/NS未见有明显His标签蛋白集中(图16g，h，i)；d-2/CD59组肺部His标签蛋白集中趋势介于两者之间但不明显(图16d，e，f)。

d-2/C3d-ScFv-CD59组His标签蛋白的组织化学评分在3d，5d，7d相对于d-2/NS组和d-2/CD59组最高，His标签蛋白的阳性强度最强；d-2/NS组在3d，5d中His标签蛋白的组织化学评分最低，在7d His标签蛋白的组织化学评分介于d-2/C3d-ScFv-CD59组和d-2/CD59组之间，总体His标签蛋白的阳性强度最弱；d-2/CD59组His标签蛋白的组织化学评分在3d，5d中介于d-2/C3d-ScFv-CD59组和d-2/NS组两者之间，在7d组织化学评分最低，总体His标签蛋白的阳性强度介于两者之间(图17)。

序列表

<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心

<120> 防治感染性炎症的靶向免疫抑制剂TCAbCD59

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

agctacgaac tgacccagcc gccgagcgtg tcggtggcgc cgggtcagac cgcgcgtatc 60

acctgctcgg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtatcagca gaaaccgggt 120

caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc 180

tttagcggct cgaattcggg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac ccaggcggag 240

gatgaggcgg actattactg ctcgtcgcag gaggccagca ggagttcggt gtttggcggt 300

ggcaccaaac tgaccgtgct g 321

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Glu Ala Ser Arg Ser Ser

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 3

<211> 357

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gaagtgcaat tggtggaaag cggtggcggt ctggtgcagc cgggtggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcag cgagcggctt cacctttagc agctacgcga tgagctgggt gcgccaggca 120

ccgggtaaag gtctggaatg ggtgagcgcg attagcggta gcggcggcag cacctactat 180

gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatc tcgcgtgata actcgaaaaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc acgtggtgtg 300

tctgaggttc ctgttgatcc ctggggtcag ggcactctgg tgaccgtgtc gagcgcg 357

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Ser Glu Val Pro Val Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcagcggcg gctcgaccat aacttcgtat aatgtatact atacgaagtt atcgagctcg 60

ggcagc 66

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Ser Ser Gly Ser

20

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggaggtgggt cgggtggcgg cggatct 27

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 9

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agctacgaac tgacccagcc gccgagcgtg tcggtggcgc cgggtcagac cgcgcgtatc 60

acctgctcgg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtatcagca gaaaccgggt 120

caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc 180

tttagcggct cgaattcggg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac ccaggcggag 240

gatgaggcgg actattactg ctcgtcgcag gaggccagca ggagttcggt gtttggcggt 300

ggcaccaaac tgaccgtgct gggcagcggc ggctcgacca taacttcgta taatgtatac 360

tatacgaagt tatcgagctc gggcagcgaa gtgcaattgg tggaaagcgg tggcggtctg 420

gtgcagccgg gtggcagcct gcgtctgagc tgcgcagcga gcggcttcac ctttagcagc 480

tacgcgatga gctgggtgcg ccaggcaccg ggtaaaggtc tggaatgggt gagcgcgatt 540

agcggtagcg gcggcagcac ctactatgcg gatagcgtga aaggccgttt taccatctcg 600

cgtgataact cgaaaaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacc 660

gcggtgtatt attgcgcacg tggtgtgtct gaggttcctg ttgatccctg gggtcagggc 720

actctggtga ccgtgtcgag cgcgggaggt gggtcgggtg gcggcggatc tctgcagtgc 780

tacaactgtc ctaacccaac tgctgactgc aaaacagccg tcaattgttc atctgatttt 840

gatgcgtgtc tcattaccaa agctgggtta caagtgtata acaagtgttg gaagtttgag 900

cattgcaatt tcaacgacgt cacaacccgc ttgagggaaa atgagctaac gtactactgc 960

tgcaagaagg acctgtgtaa ctttaacgaa cagcttgaaa at 1002

<210> 10

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gln Glu Ala Ser Arg Ser Ser

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Gly Gly Ser

100 105 110

Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Ser Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

130 135 140

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

145 150 155 160

Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

180 185 190

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

195 200 205

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Val Ser Glu Val Pro Val Asp Pro Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr

260 265 270

Ala Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala

275 280 285

Gly Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe

290 295 300

Asn Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys

305 310 315 320

Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn

325 330