纳米传感器及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年2月28日提交的美国临时申请序列No.62/811,543、于2019年2月28日提交的美国临时申请序列No.62/811,559、于2019年2月28日提交的美国临时申请No.62/811,579和于2019年2月27日提交的美国临时申请序列No.62/811,041的权益和优先权，这些申请的全部公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般而言涉及基于纳米结构的分析物检测和/或量化系统并且，更具体而言，涉及促进在大动态范围内以高灵敏度量化分析物的基于纳米结构的分析物检测和/或量化系统。

背景技术

多年来，分析物的检测和量化在许多疾病或失调的诊断和治疗以及新疗法和治疗模式的开发中一直至关重要。在分析物检测和量化系统的开发中已经取得了重大进展，包括基于固体或溶液的测定，诸如基于印迹的技术，诸如蛋白质印迹、酶联免疫测定(ELISA)、数字ELISA、基于微流体的ELISA技术，以及基于珠子的自动化测定。但是，挑战依然存在。

例如，虽然某些分析物充当某些疾病或失调的生物标志物，但它们的浓度可以在受试者之间或甚至在不同样本(例如，从同一受试者采集的组织或流体样本)之间显著变化。此外，用于测量某些体液中某些分析物的超低浓度的量化系统的存在特别阻碍了发现和验证生物标志物的努力。例如，商业测定(诸如，ELISA)的量化范围通常等于或高于100pg/mL。但是，在阿尔茨海默病中，已成为该疾病的经验证的生物标志物的诸如淀粉样蛋白β(Aβ)蛋白和Tau蛋白之类的各种蛋白质通常由于血脑屏障而以等于或低于1pg/mL的水平存在。结果，这些水平比标准ELISA的检测限制低一到两个数量级。虽然数字ELISA测定可以促进量化各种生物标志物的亚pg/mL水平，但这些测定通常针对低浓度测量进行了优化，并且没有大的动态范围。换句话说，数字ELISA通常可以测量从0.01-0.1pg/mL到10-100pg/mL的浓度，表示大约3-4个数量级的动态范围。

类似地，细胞因子释放综合征(CRS)，一种通过基于单克隆抗体的疗法和过继T细胞治疗(例如，CAR-T疗法)观察到的全身炎症反应，已成为主要问题。CRS可以呈现为需要微创支持性护理的轻微反应，直至可能导致接受治疗的受试者死亡的严重全身反应。鉴于生物标志物浓度范围广、样本体积小并且测定时间长，在这些疗法期间监视CRS反应可能具有挑战性。当前的分析方法无法满足这些需求，从而限制了CAR-T疗法的精度及对其副作用的有效管理。新兴研究已经识别出一组预测性生物标志物(包括C反应蛋白(CRP)和铁蛋白，以及各种细胞因子，诸如IFNγ、IL-6和TNFα)，其可以被用于管理给药方案并识别早期干预的需要。但是，CRP和铁蛋白的浓度可以从10ng/mL到10mg/mL(6个数量级)变化，而IL-6和IFNγ的浓度可以从1pg/mL到0.1μg/mL(7个数量级)变化。累积起来，这些分析物可以跨越浓度范围(1pg/mL–10mg/mL)，表示10个数量级(10个对数)的动态范围。目前，没有已知的检测和量化系统可以提供6个或更多数量级的动态范围，在快速单一测试中具有必要的检测下限和用于测量不同分析物的高多重性，并且可以区分低、中或高级响应。

因而，存在对促进在大动态范围内以必需的灵敏度对一种或多种分析物进行量化检测和量化系统的持续需要。

发明内容

本发明提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在和/或在大动态范围内以高灵敏度量化感兴趣样本中分析物的量的传感器、并入一个或多个此类传感器的盒(cartridge)、检测系统，以及使用这种传感器、盒和系统来量化样本中分析物的量的方法。

在一个方面，本发明提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的传感器。传感器包括第一区域和第二区域。第一区域包括能够结合(bond)分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列。第二区域包括能够结合分析物并产生指示在不同的第二浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的不同的纳米结构的第二系列，其中，传感器能够跨第一浓度范围和第二浓度范围两者量化样本中分析物的量。

在另一方面，本发明提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的传感器。传感器包括第一区域和第二区域。第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列，其中，第一系列的结合分析物的个体纳米结构在结合分析物后被光学检测，由此样本中分析物的浓度如果在第一浓度范围内则根据第一系列中的已结合一个或多个分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。第二区域包括能够结合分析物并产生指示在不同的第二浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的不同的纳米结构的第二系列，其中，样本中分析物的浓度如果在第二浓度范围内则通过根据分析物的浓度的第二区域中纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的检测来确定，其中，传感器能够跨第一浓度范围和第二浓度范围两者量化样本中分析物的量。

在前述方面中的每一个中，第一浓度范围具有比第二浓度范围的可检测值低的可检测值和/或第二浓度范围具有比第一浓度范围的可检测值高的可检测值。预期的是第一浓度范围可以与第二浓度范围重叠。

在另一方面，本发明提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的传感器。该传感器包括第一区域，该第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列，其中，第一系列的结合分析物的个体纳米结构在结合分析物后被光学检测，由此样本中分析物的浓度如果在第一浓度范围内则根据第一系列中已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。

在前述方面中的每一个中，传感器的第一区域包括以下中的一个或多个：(i)相邻纳米结构的中心到中心间距至少为1μm；(ii)每个纳米结构的最小横截面尺寸或直径至少为10nm；(iii)每个纳米结构的最大横截面尺寸或直径不超过200nm；或(iv)每个纳米结构的高度在50nm至1000nm的范围内。传感器可选地还包括以下中的一个或多个：(i)基准标志物或(ii)纳米结构制造控制特征。

在另一方面，本发明提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的传感器。该传感器包括第一区域，该第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列，其中，样本中分析物的浓度如果在第一浓度范围内则通过根据分析物的浓度的第一区域中纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的模拟检测来确定。第一区域还包括以下中的一个或多个：(i)相邻纳米结构的中心到中心间距至少为1μm；(ii)每个纳米结构的最小横截面尺寸或直径至少为100nm；(iii)每个纳米结构的最大横截面尺寸或直径不超过300nm；或(iv)每个纳米结构的高度在50nm至1000nm的范围内。传感器可选地还包括第二区域，该第二区域包括以下中的一个或多个：(i)基准标志物或(ii)纳米结构制造控制特征。

预期的是本发明的前述方面中任何一个的传感器可以包括以下特征中的一个或多个。例如，预期的是传感器还可以包括第三区域，该第三区域包括能够结合分析物并产生指示在第三浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的进一步不同的纳米结构的第三系列，其中，传感器能够跨第一浓度范围、第二浓度范围和/或第三浓度范围量化样本中分析物的量。还预期的是传感器还可以包括可操作以检测和/或量化附加浓度范围内的分析物的纳米结构的附加系列。

类似地，任何第二系列中的纳米结构可以包括大于第一系列中的纳米结构的以下中的一个或多个：(i)平均高度、(ii)平均体积、(iii)平均表面积、(iv)平均质量、以及(v)分析物结合位点的平均数量。

此外，每当传感器包括第三系列时，纳米结构的第三系列就可以包括大于任何第二系列中的纳米结构的以下中的一个或多个：(i)平均高度、(ii)平均体积、(iii)平均表面积、(iv)平均质量、以及(v)分析物结合位点的平均数量。

第一系列以及(在适用的情况下)第二系列和第三系列(以及其它附加系列)中的纳米结构用结合分析物的结合剂(例如，结合分析物的生物结合剂)来官能化。生物结合剂可以是例如抗体、适体、配体-受体对的成员、酶或核酸。在某些情形下，在第一系列中使用对分析物具有比在第二系列、第三系列或后续系列中的结合剂高的结合亲和力的结合剂可以是有利的。

传感器可以被设计为检测和/或量化样本中的任何感兴趣的分析物。例如，分析物可以是生物分子，例如蛋白质、肽、碳水化合物、糖蛋白、糖肽、脂质、脂蛋白、核酸或核蛋白。此外，给定传感器中的纳米结构或纳米结构的系列可以被配置为同时或顺序地结合、检测和/或量化多种不同的分析物。例如，传感器可以包括多种不同的结合剂，用于检测测试样本中对应的多种不同分析物，以促进在传感器上的同一阱中同时进行的多种分析物的多重分析。

应理解的是，任何前述传感器能够跨跨越至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个数量级(或3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个对数)的浓度范围(也称为动态范围)检测样本中分析物的浓度，从而避免了稀释或浓缩感兴趣样本中的分析物的需要。在某些实施例中，传感器能够跨跨越至少5、6、7、8或9个数量级(或5、6、7、8或9个对数)的范围检测样本中分析物的浓度。传感器可以被配置为在从小于1pg/mL至大于100ng/mL、从小于0.1pg/mL至大于1μg/mL、从小于0.01pg/mL至大于100μg/mL、从小于1fg/mL至大于0.1mg/mL、或从小于0.1fg/mL至大于1mg/mL的范围中测量给定分析物的浓度，其中，例如，样本在施加到传感器之前不需要被稀释。

传感器可以检测多种样本(例如，体液、组织提取物和/或细胞上清液)中的分析物。示例性体液包括例如血液、血清、血浆、尿液、脑脊液或间质液。

传感器可以被配置为经由纳米结构的至少一个系列的光学可检测特性(例如，色彩、光散射、折射或共振(例如，表面等离子体共振、电共振、电磁共振和磁共振))的改变来检测分析物的结合。

预期的是传感器可以以多种不同的方式配置。例如，纳米结构的第一系列、第二系列或第三系列中的至少一个系列可以包括纳米结构的阵列。可替代地，纳米结构的第一系列、第二系列和第三系列中的每一个系列可以包括纳米结构的阵列。预期的是传感器可以包括纳米结构的单个系列或纳米结构的多个系列，例如，可操作以检测不同浓度范围内的分析物的纳米结构的多个系列。当传感器包括纳米结构的多个系列时，纳米结构的不同系列可以(i)以相同方式操作(例如，通过数字检测，其中检测和/或量化单个纳米结构，或通过模拟检测，其中检测根据浓度的给定系列内纳米结构的光学性质的基本上均匀的改变)或(ii)以不同方式操作，例如通过数字检测和模拟检测的组合。此外，预期的是传感器可以包括通过数字检测和/或模拟检测操作的多个不同系列。例如，传感器可以包括操作以在相同浓度范围内通过数字检测来检测分析物的多个系列，和/或操作以在不同浓度范围内通过模拟检测来检测分析物的多个系列。

例如，在数字检测期间，在纳米结构的第一系列中，结合分析物的个体纳米结构在结合或者单个分析物分子或者少于预定数量的分析物分子后被检测，由此样本中分析物的浓度如果存在于第一浓度范围内则根据第一系列中的已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。例如，样本中分析物的浓度通过相对于例如或者(i)未结合分析物的个体纳米结构的剩余数量或者(ii)第一系列中纳米结构的总数对第一系列中的已结合分析物的个体纳米结构的数量进行数字计数来确定。

类似地，分析物的浓度如果在第二范围或第三范围内则可以通过相对于例如或者(i)适当系列中未结合分析物的个体纳米结构的剩余数量或者(ii)对应的第二系列和/或第三系列中的纳米结构总数对第二系列和/或第三系列中已结合分析物的单个纳米结构的数量进行数字计数来确定。换句话说，跨第一浓度范围、第二浓度范围和可选的第三(或更多)浓度范围的样本中分析物的浓度根据第一系列、第二系列和/或可选的第三(或更多)系列中的每一个系列中已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。预期的是传感器还还包括纳米结构的附加系列(例如，四个、五个、六个系列等)，这取决于给定测定所期望的动态范围和/或灵敏度。

可替代地或附加地，分析物的浓度如果在第二浓度范围或可选的第三浓度范围内则可以通过根据分析物的浓度的第二区域和/或第三区域中纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的模拟检测来确定。例如，光学可检测特性的改变可以是根据分析物的浓度的由第二区域中的第二系列和/或可选的第三区域中第三系列产生的色彩改变。换句话说，跨第二浓度范围和可选的(一个或多个)第三(或更多)浓度范围的样本中分析物的浓度通过第二区域和/或第三区域中的每一个区域中纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的模拟检测来确定。预期的是传感器还进一步包括纳米结构的附加系列(例如，四个、五个、六个系列等)，这取决于给定测定所期望的动态范围和/或灵敏度。

预期的是给定系列中的纳米结构可以是平面和/或曲面的纳米结构。纳米结构可以部署在平面支撑件和/或柔性基板上，其中纳米结构可以与平面支撑件和/或柔性基板是一体的。纳米结构可以由半导体材料(例如，硅)或金属制成。

预期的是传感器还可以包括基准标志物，例如，可通过光场显微镜检查和/或暗场显微镜检查进行光学检测的基准标志物。基准标志物可以由检测系统在检测场内用于校准传感器的位置。

在另一方面，本发明提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的盒，该盒包括限定包括前述传感器中的任何一个或多个传感器的至少一个阱的壳体。壳体可以限定多个阱，每个阱包括前述传感器中的任何一个或多个传感器。

在另一方面，本发明提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的系统。该系统包括(a)接纳室，用于接纳前述盒中的任何一个或多个的前述传感器中的任何一个或多个传感器；(b)能量源(例如，用于照明的光源)，用于探询至少纳米结构的第一系列和/或任何第二系列和/或任何第三系列；(c)检测器，用于检测至少纳米结构的第一系列和/或任何第二系列和/或任何第三系列的特性(例如，光学特性)的改变；以及可选地(d)计算机处理器，该计算机处理器实现计算机算法，该计算机算法识别在第一浓度范围和任何第二浓度范围之间的接合(interface)以及可选地在任何第二浓度范围和可选地任何第三浓度范围之间的接合。

在光学检测系统的情况下，当算法确定是否在数字和模拟检测之间转变浓度曲线时，预期的是该算法包括以下步骤：(a)在施加待测试的溶液后测量已经相对于第一系列中的纳米结构从一个状态改变(翻转)到另一个状态的纳米结构；(b)在施加待测试的溶液后测量第二系列中纳米结构的色彩空间改变；以及(c)如果第二系列的色彩空间改变大于预选阈值，那么使用步骤(b)中识别出的模拟测量，而如果第二系列的色彩空间改变小于预选阈值，那么使用步骤(a)中识别出的数字测量。

在另一方面，本发明提供了一种检测感兴趣样本(例如体液、组织提取物或细胞上清液)中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的方法。该方法包括：(a)将样本的至少一部分施加到前述传感器中的任何一个或多个；以及(b)检测纳米结构的第一系列和/或任何第二系列和/或任何第三系列的特性(例如，光学特性)的改变，从而检测样本中分析物的存在或量化样本中分析物的量。

预期的是该方法可以包括以下特征中的一个或多个。例如，该方法可以能够检测浓度范围至少为3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个对数的分析物，例如，浓度范围至少为5、6、7、8或9个对数。传感器可以能够从小于1fg/mL到大于1mg/mL的浓度范围中检测分析物。因此，样本在施加到传感器之前可以不需要稀释。

在另一方面，本发明提供了一种检测感兴趣样本(例如体液、组织提取物或细胞上清液)中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的方法。该方法包括将样本的一部分施加到包括第一区域和第二区域的传感器。第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列。第二区域包括能够结合分析物并产生指示在不同的第二浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的不同的纳米结构的第二系列。例如，使用电磁辐射来探询区域以检测来自纳米结构的第一系列和第二系列的可检测信号，该信号指示样本中分析物的存在和/或量。然后可以根据可检测信号确定分析物的存在和/或量，由此跨第一浓度范围和第二浓度范围两者检测样本中分析物的存在或量化样本中分析物的量。

在另一方面，本发明提供了一种检测感兴趣样本(例如体液、组织提取物或细胞上清液)中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的方法。该方法包括将样本的一部分施加到包括第一区域和第二区域的传感器。第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列，其中第一系列的结合分析物的个体纳米结构在结合分析物后被光学检测，由此样本中分析物的浓度如果在第一浓度范围内则根据第一系列中已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。第二区域包括能够结合分析物并产生指示在不同的第二浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的不同的纳米结构的第二系列，其中样本中分析物的浓度如果在第二浓度范围内则通过根据分析物的浓度的第二区域中纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的模拟检测来确定。例如，使用电磁辐射来探询区域以检测来自纳米结构的第一系列和第二系列的可检测信号，该信号指示样本中分析物的存在和/或量。然后可以根据可检测信号确定分析物的存在和/或量，从而跨第一浓度范围和第二浓度范围两者检测样本中分析物的存在或量化样本中分析物的量。

预期的是，在前述方法的每一种中，任何第二系列中的纳米结构包括大于第一系列中的纳米结构的以下中的一个或多个：(i)平均高度、(ii)平均体积、(iii)平均表面积、(iv)平均质量、以及(v)分析物结合位点的平均数量。

当连同附图考虑时，根据本发明的各种非限制性实施例的以下详细描述，本发明的其它优点和新颖特征将变得清楚。

附图说明

图1是示出与现有技术测定相比根据本发明的实施例的传感器的动态范围的示意图。

图2A是感兴趣的传感器中的纳米结构的系列的不同形式的示意图。图2B是描绘用于测量分析物的超低、低、中和高浓度的示例性传感器的系列的示意图。

图3A-图3C示出了本发明的示例性传感器在大动态范围内测量分析物的可操作性。图3A是描绘根据本发明的实施例的包含数字和模拟(色移)纳米结构阵列两者的传感器的示意图。图3B是描绘通过数字单分子量化(左手面板)和通过模拟量化(右手面板)的组合在6个对数动态范围内量化Tau蛋白的图示。图3C是描绘根据分析物浓度的数字传感器的可操作性的图像。

图4是示出由图3B中示例化的传感器生成的示例性数据的数字和模拟测量的曲线图。

图5是根据本发明的实施例的示例性基于硅晶片的传感器的图示，该传感器包含数字纳米结构的系列(25600个)和模拟纳米结构的三个系列(每系列1000个)。

图6是根据本发明的实施例的另一个示例性基于硅晶片的传感器的图示，该传感器包括数字纳米结构的多个系列和模拟纳米结构的三个系列。

图7是描绘根据本发明的实施例的示例性纳米结构的横截面视图的示意图。

图8是描绘根据本发明的实施例的由两种不同材料组成的示例性纳米结构的横截面视图的示意图。

图9A-图9D是一系列横截面示意图，图示了根据本发明的实施例通过光致抗蚀剂图案化、显影和蚀刻工艺来制造一系列示例性纳米结构。

图10A-图10G是一系列横截面示意图，图示了根据本发明的实施例的通过在基板上沉积层、在沉积的层上旋涂光致抗蚀剂、图案化和显影抗蚀剂、蒸发抗蚀剂上的金属、在溶液中去除抗蚀剂、蚀刻基板以及去除光致抗蚀剂来制造示例性纳米结构的系列。

图11A-图11F是一系列横截面示意图，图示了根据本发明的实施例的通过在基板上涂覆两层、图案化顶层抗蚀剂、显影抗蚀剂、蒸发图案化的抗蚀剂上的材料、剥离(lift-off)并旋转附加的低粘度材料以实现特定的表面条件来制造示例性纳米结构的系列。

图12A-图12F是一系列横截面示意图，图示根据本发明的实施例的通过在氧化物基板上图案化光致抗蚀剂、显影抗蚀剂、在抗蚀剂上沉积硅、剥离以及硅生长以在图案化的基板上生长附加结构来制造示例性纳米结构的系列。

图13A-图13D是一系列横截面示意图，图示了根据本发明的实施例的用模具对光致抗蚀剂进行图案化。

图14A是图示根据本发明的实施例的具有纳米结构的多个系列的硅晶片的示意图，并且图14B是图示根据本发明的实施例的纳米结构的单个系列的放大图像的示意图。

图15A和图15B是根据本发明的实施例的并入纳米结构的系列的纳米传感器组件(可消耗)的透视图。

图16A和图16B是包括晶片基板、垫圈和保持基座(图16A)的盒组件的示意图以及示出盒组件的部件的分解透视图(图16B)。

图17是根据本发明的实施例的单丛(plex)盒和1000丛盒的示意图。

图18是根据本发明的实施例的与传感器一起使用的检测系统的透视图。

图19是描绘根据本发明的实施例的用于对示例性传感器进行成像的示例性光学检测系统的示意图。

图20是描绘根据本发明的实施例的传感器探询的示意图。读出信号可以是光学的(例如，成像)、电的或机械的。

图21是示出包含数字纳米结构的示例性传感器的输出的数据分析的示意图。

图22是图示根据本发明的实施例的算法的流程图。

图23A和图23B是描绘根据本发明的实施例的被配置为同时检测和/或量化多种分析物的纳米结构的系列的示意图。

图24是描绘根据本发明的实施例的分析物与纳米结构之间的相互作用的示意图。

图25是描绘根据本发明的实施例的从左到右通过捕获1、2和5个分析物的纳米结构的结合能力的示意图。

图26是描绘根据本发明的实施例的非饱和测定的示意图，其中分析物的数量少于能够捕获分析物的纳米结构的数量。

图27是描绘根据本发明的实施例的在非饱和测定条件下阵列中的纳米结构的系列的示意图，其中分析物被阵列中的纳米结构的一部分结合。

图28是描绘示例性的无标记免疫测定的示意图。

图29是描绘示例性的基于标记的免疫测定的示意图。

图30是根据本发明的实施例的用于使用结合抗原的一对抗体(Ab1和Ab2)确定分析物(抗原)的存在和/或量的示例性的基于粒子的测定的示意图，其中结合经由通过被活化的纳米结构捕获的(Ab2)抗体在检测之前在溶液中发生。

图31是根据本发明的实施例的用于使用结合抗原的一对抗体(Ab1和Ab2)确定分析物(抗原)的存在和/或量的示例性的基于粒子的测定的示意图，其中结合经由通过被活化的纳米结构捕获的(Ab2)抗体在检测之前在溶液中发生。

图32是根据本发明的实施例的用于使用结合抗原的一对抗体(Ab1和Ab2)确定分析物(抗原)的存在和/或量的示例性的基于粒子的测定的示意图，其中结合经由通过被活化的纳米结构捕获的酶(HRP)在检测之前在溶液中发生。

图33是根据本发明的实施例的用于使用结合抗原的一对抗体(Ab1和Ab2)确定分析物(抗原)的存在和/或量的示例性的基于粒子的测定的示意图，其中结合经由通过用互补寡核苷酸官能化的纳米结构捕获的寡核苷酸在检测之前在溶液中发生。

图34A-图34C是描绘用在示例性多重测定中的试剂的示意图。

图35是以Tau蛋白的各种浓度在数字阵列内纳米结构的暗场图像的图示。

图36是图示图35的传感器中阳性率相对于Tau蛋白浓度的曲线图，其中传感器的数字阵列在大于1ng/mL的浓度变得饱和。

图37是以Tau蛋白的各种浓度由在传感器的模拟阵列中的纳米结构阵列产生的色调变化量(delta hue)的直方图。

图38是根据图35中所示传感器的模拟对应物的Tau浓度的平均色调变化量的曲线图，其中传感器未检测到低于1ng/mL的浓度改变。

图39是示出使用本发明的示例性传感器的IL-6的检测和量化的曲线图。

图40A、图40B和图40C是示出使用本发明示例性传感器检测血浆中的IL-6(图40A)、血浆中的TNF(图40B)和细胞培养基中的C反应蛋白(图40C)的曲线图。

具体实施方式

本发明部分地基于以下发现：有可能创建用于在大动态范围内以高灵敏度检测和/或量化感兴趣的样本中的分析物的量的传感器，并入这种传感器的盒、检测系统，以及使用这种传感器、盒和系统来检测和/或量化样本中的分析物的量的方法。

图1图示了可用本发明的传感器实现的动态范围10，该传感器可以检测样本中浓度范围在小于0.01pg/mL(10fg/mL)和1μg/mL或更大(至少8个对数)之间的分析物。一般而言，其它商业上可得的测定系统(例如，典型的手动ELISA、特殊的手动ELISA、基于微流体的ELISA测定、基于印迹的技术(例如，蛋白质印迹和斑点印迹技术)和基于珠子的自动化技术)可以测量感兴趣的样本中的分析物，但不能在可用本文公开的传感器实现的整个动态范围内测量分析物。因此，本发明的传感器的使用可以促进在迄今为止只能使用现有技术测定系统的组合来实现的浓度范围内的分析物浓度的测量。

I.传感器考虑事项

(A)传感器配置

预期的是传感器可以包括以各种配置的纳米结构。例如，如图2A中所示，传感器可以包括纳米结构20d的第一系列，例如，被配置用于数字量化的纳米结构的系列(图2A(i))；纳米结构20a的第二系列，例如，被配置用于模拟量化的纳米结构的系列(图2A(ii))；纳米结构20d的两个系列(图2A(iii))；纳米结构20a的两个系列(图2A(iv))；纳米结构的两个系列，一个是20d，一个是20a(图2A(v))；以及纳米结构的三个系列，一个是20d，两个是20a(图2A(vi))。预期的是传感器可以包括以不同配置的纳米结构的其它系列，这取决于待检测的分析物和期望的动态范围。

如本文所使用的，术语“纳米结构”应理解为指其至少一个尺寸的长度在至少1nm至小于1000nm的范围内的任何结构，例如纳米传感器。如本文所使用的，术语“数字量化”应理解为是指在结合一种或多种分析物后检测(例如，光学检测)纳米结构的系列中的个体纳米结构从一种状态翻转到另一种状态的量化过程。“数字系列”或“数字阵列”应理解为是指被配置为允许数字量化的相应纳米结构的系列或阵列。

如本文所使用的，术语“模拟量化”应理解为是指当纳米结构结合多种分析物时检测纳米结构的系列中的纳米结构的可检测特性(例如，光学可检测特性，例如色彩)的基本均匀改变的量化过程。在某些实施例中，跨待检测分析物的预校准浓度范围根据感兴趣样本中分析物浓度发生可检测特性的改变(例如，色彩改变)。术语“基本均匀”应理解为是指至少60％、70％、80％、90％或95％的纳米结构共享相同的可检测特性，例如色彩。“模拟系列”或“模拟阵列”应理解为是指被配置为允许模拟检测的纳米结构的相应系列或阵列。

在用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的一个示例性传感器中，传感器包括第一区域和第二区域。第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列。第二区域包括能够结合分析物并产生指示在不同的第二浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的不同的纳米结构的第二系列，其中传感器能够跨第一浓度范围和第二浓度范围两者量化样本中分析物的量。第一浓度范围可以具有比第二浓度范围的可检测值低的可检测值和/或第二浓度范围可以具有比第一浓度范围的可检测值高的可检测值。预期的是第一浓度范围可以与第二浓度范围重叠。

应理解的是，本文描述的传感器能够跨跨越至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个数量级(或3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个对数)的范围(也称为动态范围)检测样本中分析物的浓度。在某些实施例中，传感器能够跨跨越至少5、6、7、8或9个数量级(或5、6、7、8或9个对数)的浓度范围检测样本中分析物的浓度。传感器可以被配置为在从小于1pg/mL至大于100ng/mL、从小于0.1pg/mL至大于1μg/mL、从小于0.01pg/mL至大于100μg/mL、从小于1fg/mL至大于0.1mg/mL、或从小于1fg/mL至大于1mg/mL的范围中测量给定分析物的浓度，其中，例如，样本在施加到传感器之前不需要被稀释。

在一个示例性传感器中，第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列，其中第一系列的结合分析物的个体纳米结构在结合分析物后被检测(例如，光学检测)，由此样本中分析物的浓度如果在第一浓度范围内则根据第一系列中已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。第二区域包括能够结合分析物并产生指示在不同的第二浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的不同的纳米结构的第二系列，其中样本中分析物的浓度如果在第二浓度范围内则通过根据分析物浓度的第二区域中纳米结构的可检测特性(例如，光学可检测特性，诸如色彩)的基本均匀改变的模拟检测来确定，其中传感器能够跨第一浓度范围和第二浓度范围两者量化样本中分析物的量。

第一浓度范围具有比第二浓度范围的可检测值低的可检测值和/或第二浓度范围具有比第一浓度范围的可检测值高的可检测值。预期的是第一浓度范围可以与第二浓度范围重叠。

在上述传感器的每一个中，传感器的第一区域可选地包括以下中的一个或多个：(i)相邻纳米结构的中心到中心间距至少为1μm；

(ii)每个纳米结构的最小横截面尺寸或直径至少为10nm；(iii)每个纳米结构的最大横截面尺寸或直径不超过200nm；或(iv)每个纳米结构的高度在50nm至1000nm的范围内。传感器可选地还包括(i)基准标志物或(ii)纳米结构制造控制特征中的一个或多个。

预期的是传感器中的任何一个可以包括以下特征中的一个或多个。例如，预期的是传感器还可以包括第三区域，该第三区域包括能够结合分析物并产生指示在第三浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的进一步不同的纳米结构的第三系列，其中传感器能够跨第一浓度范围、第二浓度范围和/或第三浓度范围量化样本中分析物的量。

类似地，任何第二系列中的纳米结构可以包括大于第一系列中的纳米结构的以下中的一个或多个：(i)平均高度、(ii)平均体积、(iii)平均表面积、(iv)平均质量、以及(v)分析物结合位点的平均数量。

此外，每当传感器包括第三系列时，第三系列的纳米结构就可以包括大于任何第二系列中的纳米结构的以下中的一个或多个：(i)平均高度、(ii)平均体积、(iii)平均表面积、(iv)平均质量、以及(v)分析物结合位点的平均数量。

第一系列以及(在适用的情况下)第二系列和第三系列中的纳米结构用结合分析物的结合剂(例如，结合分析物的结合剂，例如生物结合剂)来官能化。生物结合剂可以是例如抗体、适体、配体-受体对的成员、酶或核酸。在某些情形下，在第一系列中使用对分析物具有比在第二系列、第三系列或后续系列中的结合剂高的结合亲和力的结合剂可能是有利的。

传感器可以被设计为检测和/或量化样本中的任何感兴趣的分析物。例如，分析物可以是生物分子，例如蛋白质、肽、碳水化合物、糖蛋白、糖肽、脂质、脂蛋白、核酸或核蛋白。此外，给定传感器中的纳米结构或纳米结构的系列可以被配置为同时或顺序地结合、检测和/或量化多种不同的分析物。例如，传感器可以包括多种不同的结合剂，用于检测测试样本中的对应的多种不同分析物。

传感器可以被配置为经由光学特性、电特性或机械特性的改变来检测分析物的结合。例如，传感器可以被配置为经由纳米结构的至少一个系列的光学可检测特性(例如，色彩、光散射、折射或共振(例如，表面等离子体共振、电共振、电磁共振和磁共振))的改变来检测分析物的结合。

预期的是传感器可以以多种不同的方式配置。例如纳米结构的第一系列、第二系列或第三系列中的至少一个系列可以包括纳米结构的阵列。可替代地，纳米结构的第一系列、第二系列和第三系列中的每一个系列可以包括纳米结构的阵列。预期的是传感器可以包括纳米结构的单个系列或纳米结构的多个系列，例如可操作以检测不同浓度范围内的分析物的纳米结构的多个系列。当传感器包括纳米结构的多个系列时，纳米结构的不同的系列可以(i)以相同方式操作(例如，通过数字检测，其中检测和/或量化单个纳米结构，或通过模拟检测，其中根据浓度检测给定系列内的纳米结构的光学性质的累积的改变)或(ii)以不同方式操作，例如通过数字检测和模拟检测的组合。此外，预期的是传感器可以包括通过数字检测和/或模拟检测操作的多个不同系列。例如，传感器可以包括操作为在相同浓度范围内通过数字检测来检测分析物的多个系列和/或操作为在不同浓度范围内通过模拟检测来检测分析物的多个系列。

例如，在数字检测期间，在纳米结构的第一系列中，在结合或者单个分析物分子或者少于预定数量的分析物分子后检测结合分析物的个体纳米结构，由此样本中分析物的浓度如果存在于第一浓度范围内则根据第一系列中的已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。例如，样本中分析物的浓度通过对第一系列中的已结合分析物的个体纳米结构的数量相对于或者(i)尚未结合分析物的个体纳米结构的剩余数量或者(ii)第一系列中纳米结构的总数进行数字计数来确定。

在这种方法中，大量纳米结构通常在传感器的区域中密集地图案化。当纳米结构的数量大于待检测的分析物的数量时，每个纳米结构通常最多捕获单个分析物，例如，基于质量传递(mass transfer)和泊松分布效应。每个纳米结构可以取决于是否结合分析物而具有两种状态之一(例如，表示为1或0)。因而，在暴露于具有分析物的样本之后具有状态1的纳米结构的数量可以等于分析物的数量。在某些实施例中，每个个体纳米结构可以仅具有有限数量的结合位点以捕获一种或几种(例如，少于10种)分析物，例如蛋白质。每个纳米结构具有对应的信号标度(scale)，从1到几个(<10)，因此对分子的数量进行计数可以等同于对每个纳米结构的离散信号进行计数。纳米结构的系列的不同信号电平形成纳米镶嵌(nanomosaic)图案，其可以被检测。

类似地，如图2A(iii)所示，分析物的浓度如果在第二范围内或在第三范围内则可以通过对第二系列和/或第三系列中的已结合分析物的个体纳米结构的数量相对于或者(i)适当系列中的尚未结合分析物的个体纳米结构的剩余数量或者(ii)对应的第二系列和/或第三系列中的纳米结构的总数进行数字计数来确定。换句话说，跨第一浓度范围、第二浓度范围和可选的第三(或更多)浓度范围的样本中分析物的浓度根据第一系列、第二系列和/或可选的第三(或更多)系列中的每一个系列中已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。

可替代地或附加地，如果分析物的浓度在第二浓度范围或可选的第三浓度范围内则可以通过根据分析物的浓度的在第二区域和/或第三区域中的纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的模拟检测来确定。例如，光学可检测特性的改变可以是由第二系列和/或可选的第三系列产生的根据分析物的浓度的基本均匀的色彩改变。换句话说，样本中的跨第二浓度范围和可选的(一个或多个)第三(或更多)浓度范围的分析物浓度通过第二区域和/或第三区域中的每一个区域中纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的模拟检测来确定。

纳米结构的每个单独系列(或区域)可以包括用于感兴趣分析物的多达10000个分子的结合位点。每个区域具有预先校准的连续信号标度(模拟标度)，其与由该区域捕获的蛋白质数量相关。每个区域的模拟标度与用于读出的物理信号的逐渐改变对应。不同的标度可以与例如来自检测器(例如，光学检测器)下方的每个区域的不同色彩对应。该区域限定纳米镶嵌，其具有根据分析物浓度的特性改变(例如，色彩改变)的连续体。例如，在光学检测的情况下，不同的标度可以与以下中的一个或多个相关：(i)显微镜下方的区域的光强度，其具有根据浓度的连续强度改变，或(ii)电子测量，例如，每个区域的电流或电压信号，其具有根据浓度的电流或电压信号的连续体。

预期的是给定系列中的纳米结构可以是平面和/或曲面的纳米结构。纳米结构可以被部署在平面支撑件和/或柔性基板上，其中纳米结构可以与平面支撑件和/或柔性基板形成一体。纳米结构可以由半导体材料(例如，硅)或金属制成。

预期的是传感器还可以包括基准标志物，例如，可通过光场显微镜检查和/或暗场显微镜检查进行光学检测的基准标志物。基准标志物可以由检测系统在检测场内用于校准传感器的位置。传感器还可以包含一个或多个纳米结构制造控件，其证明例如所制造的纳米结构示出根据纳米结构的直径的色彩改变。

在另一个示例性传感器中，如图2A(i)中所描绘的，该传感器包括第一区域，该第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列，其中第一系列的结合分析物的个体纳米结构在结合分析物后被光学检测，由此样本中分析物的浓度如果在第一浓度范围内则根据第一系列中已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。传感器的第一区域可选地包括以下中的一个或多个：(i)相邻纳米结构的中心到中心间距至少为1μm；(ii)每个纳米结构的最小横截面尺寸或直径至少为10nm；(iii)每个纳米结构的最大横截面尺寸或直径不超过200nm；或(iv)每个纳米结构的高度在50nm至1000nm的范围内。传感器可选地还包括第二区域，该第二区域包括(i)基准标志物或(ii)纳米结构制造控制特征中的一个或多个。

在另一个示例性传感器中，如图2A(ii)中所描绘的，该传感器包括第一区域，该第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列，其中样本中分析物的浓度如果在第一浓度范围内则通过根据分析物浓度的第一区域中纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的模拟检测来确定。第一区域还包括以下中的一个或多个：(i)相邻纳米结构的中心到中心间距至少为1μm；(ii)每个纳米结构的最小横截面尺寸或直径至少为100nm；(iii)每个纳米结构的最大横截面尺寸或直径不超过300nm；或(iv)每个纳米结构的高度在50nm至1000nm的范围内。传感器可选地还包括第二区域，该第二区域包括(i)基准标志物或(ii)纳米结构制造控制特征中的一个或多个。

所公开的传感器的感测区域是与生物分析物相互作用的物理点。在某些实施例中，感测区域被划分为不同的部分，其中每个部分针对特定的浓度范围。在非常低的浓度，可以使用单分子纳米结构的阵列。如果分析物被单分子传感器捕获，那么传感器产生数字的“是”信号，因此，分子的浓度可以与数字传感器的计数相关。在中低浓度范围，使用具有一定动态范围以产生模拟信号的较大纳米结构来测量分析物的浓度。读出信号可以是与纳米结构相关联的共振光谱或散射强度等。为了提高检测准确度，可以使用这些传感器的阵列来实现统计平均。

作为非限制性示例，传感器的感测区域可以被划分为多个区域。举例来说，图2B是具有四个传感器区域32、34、36、38的传感器30的示意图。每个区域包括纳米结构20的系列。在一个实施例中，超低浓度传感器区域32的纳米结构20d的系列限定了单分子灵敏度。结果，分析物的浓度与翻转以产生可检测信号(例如，“是”数字信号)的单分子纳米结构20d的数量相关。低、中和高浓度传感器区域34、36、38的纳米结构20a具有越来越大的大小，因此具有越低的灵敏度但越来越大的动态范围。区域32、34、36、38中的每一个区域针对特定动态范围进行优化。从每个区域获得的结果可以被聚合在一起，以提供由可由区域32、34、36、38实现的动态范围的聚合产生的动态范围。

图3A描绘了示例性传感器和使用这种传感器实现的感兴趣的分析物的量化的示意图。这个传感器30包括具有被配置用于数字量化的纳米结构20d的系列的第一区域50和具有被配置用于模拟量化的纳米结构20a的系列的第二区域60，其中色彩的移位指示不同的浓度。在这个示例中，数字量化70是针对范围为从pg/mL至ng/mL的分析物浓度执行的，并且模拟量化80是针对范围为从ng/mL至μg/mL的分析物浓度执行的。当分析物的浓度在pg/mL至ng/mL的范围内时，可以基于区域50中的系列中改变状态(例如，从一种状态翻转到另一种状态)的纳米结构的数量来测量分析物浓度。但是，随着分析物的浓度达到可检测范围的上限，区域50中的传感器变得饱和，并且传感器无法量化分析物的更高浓度。当至少60％、70％、80％、90％、95％或更多的结合位点已结合分析物时，会发生第一系列的饱和。结果，这个传感器30还包括纳米结构的多个系列，当样本中分析物的浓度落入可由纳米结构的给定系列检测到的分析物浓度的范围内时，这些纳米结构改变它们的光学特性(例如，被检测为色彩改变)。在这个实施例中，区域60中的纳米结构的系列被校准以在相邻或重叠的浓度范围内改变它们的光学特性(例如，色彩)。

在图3B中，传感器40包括用于数字检测/量化70的纳米结构的系列和用于模拟检测/量化80的纳米结构的系列。特别地，用于数字检测70的纳米结构的系列包括以阵列形式的纳米结构20d。随着分析物(例如，Tau蛋白)的浓度从1.2pg/mL增加到10ng/mL，从一种状态翻转为另一种状态的纳米结构的数量增加，如每个面板90下的比率所指示的。在10ng/mL或以上的分析物浓度，纳米结构的系列饱和，因为所有或基本上所有纳米结构(例如，至少60％、70％、80％、90％、95％的结合位点已结合分析物)已从一种状态翻转到另一种状态。右手侧方框说明了被配置用于模拟检测80的纳米结构20a的系列中光学特性的改变(例如，比色(colorimetric)改变)。例如，当分析物的浓度增加到10ng/mL时，纳米结构的系列的光学特性(例如，色调)不会移位。但是，当分析物的浓度大于10ng/mL时，纳米结构的系列的光学特性的改变变得可检测，例如，根据分析物浓度的色彩改变。更大的动态范围可以通过在传感器中包括被校准以检测和量化其它浓度范围内的分析物的纳米结构的附加系列(例如，数字阵列和/或模拟阵列)来实现。

图3C图示了根据本发明的实施例的由传感器100执行的数字量化。如图所示，传感器能够检测浓度为50fg/mL的分析物分子(Tau蛋白分子)，其中2046个数字纳米结构(20d)中的96个从一种光学特性翻转到可由检测器检测到的另一种光学特性。在这个特定实施例中，当所有或基本上所有纳米结构从一种光学状态翻转到另一种光学状态时，传感器100在大约50pg/mL的分子浓度变得饱和。

图4是描绘从由图3B的示例性传感器40获得的测量编译的数据的曲线图。在1pg/mL至1ng/mL的分析物浓度范围内，数字量化模式70提供高灵敏度和3个对数的动态范围。在1ng/mL至1μg/mL的分析物浓度范围内，模拟比色测量80将可检测浓度范围扩大了3个对数。在数字量化测量与模拟量化测量之间转变以形成跨越整个动态范围的连续曲线可以使用本文所述类型的算法而自动进行。在这个示例中，使用被配置用于数字量化的纳米结构的系列与被配置用于模拟量化的纳米结构的系列的组合，实现了6个对数的动态范围。已经发现的是，本发明的实施例的传感器可以使用小体积样本(例如，小于100μL、50μL、25μL、10μL或5μL)以高灵敏度(例如，50fg/mL)实现大动态范围(例如，6个对数或更多)。

纳米结构可以具有任何合适的形状和/或大小。在一些情况下，例如，纳米结构可以是纳米针、纳米线、纳米棒、纳米锥等。其它形状也是可能的，例如，纳米带、纳米丝、纳米管等。在某些实施例中，纳米结构垂直对准，但是其它角度或对准也是可能的。纳米结构(诸如纳米针、纳米点、纳米盘、纳米柱等)由于它们能够通过耦合到表面极化子(polariton)限制电磁能量而具有单分子水平的灵敏度。

传感器的物理形式可以是纳米结构(例如，纳米针、纳米线、纳米柱、纳米点等)的阵列或矩阵，通过自下而上和/或自上而下的方法在表面上制造。表面可以是平坦表面，诸如晶片的顶表面。可替代地，表面也可以是弯曲的或柔性的，或者是三维结构(诸如纤维或线等)的一部分。

传感器的功能形式可以包括纳米光学结构、纳米机械结构或纳米电学结构。因而，读出信号包括但不限于光信号、电信号和机械信号。因而，分析物的浓度可以通过纳米结构的光学、电学或纳米力学特性的改变来确定。光学特征包括例如表面等离子体共振、纳米光子共振、电共振、磁共振、散射、吸收、荧光、色彩改变等。电特征包括例如电阻、电容、电流、电压等。纳米力学特征包括，例如，振动共振、振动量值、机械质量等。

前述结构还可以被用于通过观察分析物的光学特性(例如表面等离子体共振、散射强度或吸收)的改变来检测分析物的高浓度。这些结构的灵敏度和检测范围与结构的大小密切相关。平面制造技术使得能够将不同大小和形状的纳米结构可扩展和灵活地集成在一个设备中。本发明的实施例涉及使用不同的纳米结构来实现用于确定生物样本中的分子和分析物的高灵敏度和高动态范围。

在某些实施例中，可以设计不同结构的表面特性，使得纳米结构的第一系列中的纳米结构可以具有比纳米结构的第二系列和/或第三系列高的用于结合分析物的结合亲和力。这可以使用对给定分析物具有不同结合亲和力的结合剂来实现。因此，在低浓度，分析物优先被单分子纳米结构捕获和检测。随着浓度的增加，第一系列的纳米结构饱和，并且来自纳米结构的其它系列的信号可以被用于扩展动态范围。

图5是包括纳米结构的多个系列的示例性传感器(例如，纳米镶嵌芯片)150的图示。在传感器150的左侧的列中，分开的区域表示制造控制结构155，其证明纳米结构随着纳米结构直径的增加而改变色彩。中间区域160表示多个分开的阵列(即，16个阵列)，每个阵列限定纳米结构的对应系列(共同包括25600个纳米结构，每个纳米结构限定单分子纳米结构)，其被配置用于数字量化以测量分析物的超低浓度水平。右手侧的区域包括纳米结构的三个系列(例如，纳米结构的第二系列、第三系列和第四系列)，其被描绘为区域165、170、175，用于模拟量化。区域165、170、175中的每一个被校准以测量三个分开的相邻或重叠的浓度范围内的分析物浓度。在某些实施例中，三个区域可以各自包括1000个纳米结构。

在替代实施例中，如图6中图形所示，另一个示例性传感器(例如，纳米镶嵌芯片)150包括纳米结构的许多系列(区域)。在中心处，基准标志物200被定位以帮助将传感器与光学检测系统对准。基准标志物可以是任何期望的设计。例如，如图6中所示，基准标志物200包括以不具有旋转对称性的方式布置的菱形图案和三个三角形图案，以提供位置和旋转朝向信息。因此，基准标志物可以被用于(i)定位传感器位置，以及(ii)对准纳米结构的水平和垂直平面。制造控制结构155被部署在基准周围。数字单分子纳米结构20d的阵列被部署在传感器的左侧和右侧区域上，而模拟分子纳米结构20a的阵列被部署在围绕基准和制造控制结构的中心行中。图6中所示的制造控制包括8个纳米结构块(例如，纳米针)，其直径范围从80nm至150nm。暗场成像下纳米结构(纳米针)的色彩随着直径的增加而改变。

以上表示本发明的某些实施例的各种非限制性示例。但是，其它实施例也是可能的。

在某些实施例中，纳米结构的长度从与基板附接的端部或点确定，该长度小于大约500nm、450nm、350nm、300nm、250nm、200nm、150nm、100nm、50nm、30nm、20nm、10nm、5nm、3nm或2nm。在某些实施例中，纳米结构的长度可以是至少大约2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm。

纳米结构可以具有任何合适的横截面形状，例如，正方形、圆形、三角形、椭圆形、多边形、星形、不规则形状等。纳米结构可以在其整个长度上维持相同的横截面形状，或者可以在纳米结构的不同部分中具有不同的横截面形状。此外，纳米结构可以具有任何合适的横截面直径。横截面直径可以是恒定的(例如，如在纳米针或纳米棒中)，或是变化的(例如，如在纳米锥中)。平均横截面直径可以是例如小于大约1000nm、750nm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、40nm、30nm、20nm或10nm。在某些实施例中，横截面直径可以是至少大约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、75nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、300nm、400nm、500nm、750nm或1000nm。在各种实施例中，组合也是可能的。例如，纳米结构的平均直径可以在50nm和300nm之间、在75nm和250nm之间或在100nm至200nm之间。

(B)制造考虑因素

纳米结构可以由任何合适的材料形成，并且可以与它被部署在其上的基板相同或不同。在某些实施例中，纳米结构可以由硅和/或其它合适的半导体材料(例如，锗)形成。此外，材料的非限制性示例包括金属(例如，镍或铜)、二氧化硅、玻璃等。在某些实施例中，纳米结构(其可以部署在基板上)可以由单一材料形成。

预期的是本发明的传感器可以通过多种不同的方法来制造，例如，使用半导体制造方法。如上面和下面更详细地讨论的，可以使用任何合适的方法来形成用于制造本文所述的传感器的纳米结构的系列。示例包括但不限于光刻技术，诸如电子束光刻、光刻、X射线光刻、极紫外光刻、离子投影光刻等。可替代地或附加地，纳米结构可以由一种或更多种易于用合适的蚀刻剂蚀刻的材料。

例如，在某些实施例中，纳米结构可以由一种或多种易于用合适的蚀刻剂蚀刻的材料形成。例如，纳米结构可以包括诸如二氧化硅或玻璃之类的材料，其可以使用HF(氢氟酸)或BOE(缓冲氧化物蚀刻)蚀刻。作为另一个示例，纳米结构可以包括金属，诸如铜、铁、镍和/或钢，其可以使用诸如HCl(盐酸)、HNO

(i)纳米结构制造

预期的是本发明的传感器可以以具有成本效益的方式以高吞吐量和产量通过导致高制造能力的常规半导体制造技术(例如CMOS技术)制造。使用此类方法，有可能制造包含纳米结构的一个或多个系列的传感器，例如，部署在基板上或与基板一体的纳米针、纳米点、纳米盘、纳米线和纳米柱。示例性纳米结构在图7和图8中示意性地描绘。作为非限制性示例，图7图示了可以用当前纳米制造技术(包括电子束光刻、光刻、纳米压印等)直接在基板上形成的若干纳米结构20。例如，纳米结构20可以是纳米柱、纳米盘、纳米针或纳米点。此外，图8描绘了由两种或更多种材料(例如，分别是第一材料300和第二材料305)制成的纳米结构20。每种材料的组成可以被用于控制纳米结构结合分析物的结合能力或实现特定的光学、电学或磁特性，如下面所讨论的。

纳米结构的制造可以或者以晶片规模或者以具有等效缩放(scaling)能力的芯片规模执行。在这种类型的方法中，首先为设计的纳米结构制作掩模。在某些实施例中，使用与设计结构相反的图案作为掩模上的图案。例如，使用例如旋涂或浸涂工艺将光致抗蚀剂涂覆到晶片上或芯片上。光致抗蚀剂然后可以通过对光致抗蚀剂的掩模暴露于电磁辐射。此后，暴露的光致抗蚀剂被显影。在某些实施例中，还可以借助于激光束或电子束直接写入光致抗蚀剂上的图案。然后可以通过物理气相沉积，包括热蒸发、电子束蒸发、溅射或化学沉积、或所需材料的原子层沉积，将光致抗蚀剂上的图案转移到基板上。

在某些实施例中，可以使用自上而下的蚀刻工艺，包括湿蚀刻、干蚀刻，诸如反应离子蚀刻、溅射蚀刻和/或气相蚀刻，将光致抗蚀剂上的图案转移到基板。图案化、沉积、蚀刻和官能化过程可以重复多个循环。在某些实施例中，可以使用半导体制造工艺来制造纳米针、纳米点、纳米柱和/或纳米线的阵列。在其它实施例中，可以使用模具冲压工艺来制造纳米针、纳米点、纳米柱和/或纳米线的阵列。

示例性制造方法在图9A-图9D中所示的横截面视图中描绘。参考图9A，更具体而言，电子束抗蚀剂或光致抗蚀剂层310被涂覆到半导体基板320(诸如硅基板)上。参考图9B，然后通过电子束曝光或电磁辐射曝光来图案化抗蚀剂层，以形成抗蚀剂层特征325，例如，通过使用Elionix或Raith电子束光刻系统。参考图9C，抗蚀剂在抗蚀剂显影剂中显影，以去除其部分并且仅留下抗蚀剂特征325。参考图9D，然后以图案化的抗蚀剂作为掩模执行蚀刻工艺。蚀刻工艺可以是例如湿蚀刻或干蚀刻。合适的湿蚀刻可以是例如乙二胺邻苯二酚(EDP)、氢氧化钾(KOH)或四甲基氢氧化铵(TMAH)的溶液。结果，形成硅纳米针330，其中抗蚀剂325部署在纳米针的顶表面上。纳米针的高度范围可以从2nm至1000nm。纳米针的直径范围可以从10nm至1000nm。可以使用常规湿蚀刻缓冲剂(未示出)去除抗蚀剂特征325。

可以使用化学气相沉积或原子层沉积或两者的混合来化学活化经蚀刻的结构的表面。这个活化过程也可以在湿溶液中执行。经化学活化的结构然后准备好例如通过化学吸附(例如，共价结合)或物理吸附结合生物材料、本文所述的结合剂。

合适的硅基板可以是例如圆形的12”硅晶片。为了符合生物分子筛选协会(SBS)推荐的微孔板(microplate)规格，圆形晶片被切割成矩形形状。切割步骤可以在如上所述的制造过程结束时执行。可替代地，可以在制造过程开始时执行切割到晶片深度的一半；然后，在完成所有制造步骤(包括旋涂、图案化、沉积和蚀刻)之后，可以轻松地将晶片裂解成SBS格式。

在图10A-图10G中所示的横截面图中描绘了另一种制造方法。参考图10A，使用化学气相沉积、原子层沉积或两者的组合在硅基板320的顶表面上形成二氧化硅层335。该层的厚度范围可以从2nm至100nm。包括例如聚甲基丙烯酸甲酯的抗蚀剂层310被旋涂到二氧化硅层335上。参考图10B和图10C，抗蚀剂层310通过电子束或电磁辐射被图案化，然后在抗蚀剂显影剂中显影以形成抗蚀剂特征325。参考图10D，铝层340利用例如Sharon热蒸发器或Denton电子束蒸发器通过例如热蒸发(或电子蒸发)沉积在图案化的抗蚀剂层特征325上。铝层340优选地为20nm至100nm厚。参考图10E，执行剥离工艺以去除抗蚀剂层特征325，从而在二氧化硅层335上留下铝掩模。参考图10F，执行蚀刻工艺，诸如使用STS ICP RIE系统或Oxford等离子RIE系统的反应离子蚀刻，以蚀刻氧化硅纳米针335。RIE蚀刻可进一步进入硅层320，从而产生两层SiO2-Si纳米结构。参考图10G，铝掩模340可以在铝蚀刻剂缓冲剂(例如，1-5％HNO

图11A-图11F中所示的横截面视图中描绘了又一种制造方法。参考图11A，二氧化硅层335在硅基板320的顶表面上生长。抗蚀剂层310被旋涂到二氧化硅层335上。参考图11B和图11C，抗蚀剂层310通过电子束或电磁辐射被图案化，然后在抗蚀剂显影剂中显影以形成抗蚀剂特征325。参考图11D，通过例如热蒸发(或电子蒸发)工艺在图案化抗蚀剂层310上沉积金属层，诸如铝层340。参考图11E，然后执行剥离工艺以去除抗蚀剂层310，从而留下部署在基板上的氧化物层上的铝纳米针。参考图11F，涂层345可以被旋涂以改变基板的表面特性。涂层可以是疏水材料(诸如TEFLON)，或者是聚乙二醇分子层。涂层的厚度小于铝纳米针的高度。

在图12A-图12F中所示的横截面图中描绘了另一种制造方法。参考图12A，抗蚀剂层310被旋涂在氧化物基板350上。氧化物层可以是热生长的氧化硅，或者通过化学气相沉积形成。在一些实施例中，基板350可以是载玻片。参考图12B和图12C，电磁辐射可以用于图案化抗蚀剂层310中的特征，然后将其在抗蚀剂显影剂中显影以形成抗蚀剂特征325。参考图12D，硅层355例如通过使用化学气相沉积沉积在图案化的抗蚀剂层310上。参考图12E，执行剥离工艺以去除图案化的抗蚀剂层310，这导致氧化物基板上的硅纳米点360结构。参考图12F，硅纳米针结构365可以使用硅纳米点360作为种子例如通过VLS(气-液-固)方法外延生长。

在图13A-图13D所示的横截面视图中描绘了另一种制造方法，其中可以通过使用模具来图案化光致抗蚀剂层。参考图13A，模具370由例如Si或石英制成。模具可以通过高分辨率图案化技术(诸如电子束光刻)制成。模具的特征大小与要复制的目标纳米结构的特征大小相似。参考图13B，抗蚀剂层310旋涂在硅基板320上。参考图13C，然后通过纳米压印或纳米冲压将模具370中的特征冲压到抗蚀剂中，然后通过例如UV或热交联。参考图13D，压印的光致抗蚀剂可以被用作后续蚀刻工艺的掩模以获得硅纳米结构。

参考图14A和图14B，通过复制上文描述的制造步骤，有可能产生在晶片320上制造的多个传感器375，以创建例如部署在每个晶片320上的10×10传感器阵列。如图14B中所示，每个传感器包括纳米结构(例如部署在硅基板上的纳米针330)的阵列。

应当注意的是，图10-图14中描绘的纳米结构具有至少一个在以下范围内的尺寸：1-999nm、1-750nm、1-500nm、1-400nm、1-300nm、1-200nm、1-100nm、10-999nm、10-750nm、10-500nm、10-400nm、10-300nm、10-200nm、10-100nm、20-999nm、20-750nm、20-500nm、20-400nm、20-300nm、20-200nm、20-100nm、30-999nm、30-750nm、30-500nm、30-400nm、30-300nm、30-200nm、30-100nm、40-999nm、40-750nm、40-500nm、40-400nm、40-300nm、40-200nm、40-100nm、50-999nm、50-750nm、50-500nm、50-400nm、50-300nm、50-200nm或50-100nm。纳米结构之间的节距(即，中心到中心的距离，例如在图14B中)通常为1-100μm，例如，至少1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm或90μm。其它尺寸可以被用于结构的节距。图14B中的纳米结构的阵列整体上也可以布置成阵列形式，如图14A中所示。例如，图14A中所示的两个纳米结构阵列之间的节距可以在小于100μm到大于几厘米的范围内。此外，预期的是纳米结构的节距和大小在芯片的不同部分或在纳米结构的每个系列内可以是不同的。在各种实施例中，这些当中的任一个的组合也是可能的。

此外，可以控制周期性结构中纳米结构之间的距离或节距，例如，使得纳米结构形成超表面。例如，节距可以被设置为小于入射光的波长。例如，节距可以小于700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、25nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm或2nm，和/或大于1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、25nm、50nm、100nm200nm、300nm、400nm、500nm、600nm或700nm。例如，在某些情形下，节距可以在400nm至500nm之间。纳米结构可以具有本文提供的任何尺寸。在某些情形下，纳米结构的平均横截面直径或最小或最大横截面尺寸小于入射光的波长。在某些情形下，个体纳米结构被配置为光学可分辨的，例如，节距可以小于100μm、小于10μm、小于5μm、和/或大于1μm、或大于5μm。

表1描述了本文所述的用于光学读出的纳米结构的示例性参数。

表1

表2描述了本文所述的用于机械读出的纳米结构的示例性参数。

表2

表3描述了本文描述的用于电读出的纳米结构的示例性参数。

表3

(ii)纳米结构官能化

第一系列以及(在适用的情况下)第二系列和第三系列中的纳米结构用结合分析物的结合剂(例如，结合分析物的结合剂，例如生物结合剂)官能化。生物结合剂可以是例如抗体、适体、配体-受体对的成员、酶或核酸。在某些情形下，例如，当第一系列被用于测量分析物的非常低的浓度时，在第一系列中使用对分析物具有比在第二系列、第三系列或后续系列中的结合剂高的结合亲和力的结合剂可能是有利的。

施加于给定纳米结构的结合剂的数量可以根据期望的测定而改变，例如所需的动态范围、待检测的分析物的数量等。例如，在某些情形下，纳米结构可以用1、5、10、20、25、50、75、100或更多个结合剂来官能化。这些值的范围可以是每个纳米结构1-1000、1-500、1-250、1-100、1-50、1-25、1-10或1-5个结合剂。

传感器可以被设计为检测和/或量化样本中的任何感兴趣的分析物。此外，给定传感器中的纳米结构或纳米结构的系列可以被配置为同时或顺序地结合、检测和/或量化多种不同的分析物。例如，传感器可以包括多种不同的结合剂，用于检测测试样本中对应的多种不同分析物。

可以在多个样本中检测和/或量化分析物。样本可以是以允许测量分析物的任何形式。换句话说，样本必须允许分析物提取或处理以允许检测分析物处理，诸如薄切片的制备。因而，样本可以是新鲜的，通过合适的低温技术保存，或通过非低温技术保存。在某些实施例中，样本是体液样本，诸如血液、血清、血浆、尿液、脑脊液或间质液样本。在某些实施例中，样本是例如从通过使用常规活检仪器和规程获得的活检样本获得的组织提取物。内窥镜活检、切除活检、切取活检、细针活检、钻孔活检、刮取活检和皮肤活检是本领域技术人员可以用于获得组织样本的公认医疗规程的示例。合适的用于后续分析的组织制备的技术是本领域技术人员众所周知的。在某些实施例中，样本是细胞样本或细胞上清液样本。

分析物包括生物分子，例如，蛋白质、肽、碳水化合物、糖蛋白、糖肽、脂质、脂蛋白、核酸或核蛋白。示例性分析物包括例如细胞、抗体、抗原、病毒粒子、病原菌、离子、孢子、酵母、霉菌、细胞代谢物、酶、酶抑制剂、受体配体、肽、蛋白质、脂肪酸、类固醇、激素、酶和核酸。其它可以检测的非生物分析物可以包括例如有机化合物、合成分子、金属、金属络合物、药物、神经毒剂和麻醉剂。

在某些实施例中，分析物是细胞因子，例如干扰素(例如，IFNα、IFNβ和IFNγ)、白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17和IL-20)、肿瘤坏死因子(例如，TNFα和TNFβ)，促红细胞生成素(EPO)、FLT-3配体、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、趋化因子(Rantes)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及上述任何物质的功能片段。

在某些实施例中，分析物是激素。激素的示例包括但不限于肾上腺素、褪黑素、去甲肾上腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、多巴胺、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素、胰淀素(或胰岛淀粉样多肽)、抗苗勒管激素(或苗勒管抑制因子或激素)、脂联素、促肾上腺皮质激素(或促皮质素)、血管紧张素原和血管紧张素、抗利尿激素(或加压素、精氨酸加压素)、心钠素(或心房肽)、脑利钠肽、降钙素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素释放激素、皮质抑素、脑啡肽、内皮素、促红细胞生成素、促卵泡激素、甘丙肽、抑胃肽、胃泌素、生长素释放肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳激素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子(或生长调节素)、瘦素、促脂素、黄体化激素、促黑素细胞激素、胃动素、食欲素、骨钙素、催产素、胰多肽、甲状旁腺素、垂体腺苷酸环化酶激活肽、催乳素、催乳素释放激素、松弛素、肾素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、促甲状腺激素(或促甲状腺素)、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、鸟苷、尿鸟苷、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、醛固酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、皮质醇、孕酮、骨化三醇(1,25-二羟基维生素D3)和骨化二醇(25-羟基维生素D3)。

纳米结构可以使用本领域已知的标准化学物质进行官能化。首先，纳米结构的表面可以被活化以使用标准化学物质(包括标准链接体化学物质)来结合结合剂。

结合剂可以含有或被工程设计为含有能够或者直接地或者经由化学链接体与纳米结构的表面反应的官能团(例如，通过存在于纳米结构的表面上或纳米结构的表面处的硅烷醇基团)。

在一种方法中，纳米结构的表面硅烷醇基团可以用具有反应性基团(例如，伯胺)的一种或多种活化剂(诸如烷氧基硅烷、氯硅烷或替代的硅烷模态)活化。具有反应性基团的示例性烷氧基硅烷可以包括例如氨基硅烷(例如，(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷(APTMS)、(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTES)、(3-氨基丙基)-二乙氧基-甲基硅烷(APDEMS)、3-(2-氨基乙氨基丙基)三甲氧基硅烷(AEAPTM))、缩水甘油氧基硅烷(例如，(3-缩水甘油氧基丙基)-二甲基-乙氧基硅烷(GPMES))或巯基硅烷(例如，(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)或(3-巯基丙基)-甲基-二甲氧基硅烷(MPDMS))。具有反应性基团的示例性氯硅烷包括3-(三氯甲硅烷基)甲基丙烯酸丙酯(TPM)和10-异氰酸癸基三氯硅烷。

此后，可以使用多种交联剂将结合剂上的官能团(例如赖氨酸残基上的侧链上的伯胺)附接到添加到纳米结构的表面的反应性基团。示例性交联剂可以包括例如同双功能交联剂(例如戊二醛、双马来酰亚胺己烷、双(2[琥珀酰亚胺氧羰基氧基]乙基)砜(BSOCOES)、[双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯](BS3)、(1，4-二-(3'-[2硫基吡啶]-丙酰氨基))丁烷)(DPDPB)，辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)，酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)，酒石酸磺基二琥珀酰亚胺酯(Sulfo DST)，二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯(DSP)，3,3'-二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)、双(β-[4-叠氮基水杨酰胺]-乙基)二硫化物碘化物(BASED)、同双功能NHS交联试剂(例如，双N-琥珀酰亚胺)-[五乙二醇]酯(双(NHS)PEO-5)和PEG或葡聚糖聚合物的同双功能异硫氰酸酯衍生物)和异双功能交联剂(例如，琥珀酰亚胺4-(N马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，琥珀酰亚胺基-4-(N马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)、N马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、琥珀酰亚胺4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-'(二甲氨基丙基)碳二亚胺(NHS/EDC)、(N-ε-马来酰亚胺-己酸)酰肼(sulfoEMCS)、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)、单氟环辛炔(MFCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)、马来酰亚胺和二苯并环辛炔酯(DBCO酯)和1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC))。

举例来说，本文描述的纳米结构可以经由烷氧基硅烷(例如，APTMS)活化以修饰(modify)表面硅烷醇基团的游离羟基基团以产生反应性基团(例如，伯胺)。在纳米结构上产生的反应性基团(例如，伯胺)然后可以与交联剂(例如，戊二醛)反应，该交联剂与例如在蛋白质(例如，感兴趣的抗体)中的赖氨酸的侧链中存在的游离胺基团形成共价键。

预期的是本领域已知的其它活化和缀合(conjugation)化学物质可以被用于将一种或多种结合剂共价耦合到本文描述的纳米结构的表面。

预期的是可以用结合感兴趣的分析物的结合剂将给定的纳米结构或纳米结构的系列官能化。如本文所使用的，术语“结合剂”是指与感兴趣的分析物特异性结合的试剂。与结合剂关联使用的术语“优先结合”或“特异性结合”是指，相比于该结合剂与除了目标分析物以外的分子结合和/或关联，该结合剂与特定目标分析物结合和/或关联(i)更稳定，(ii)更快，(iii)具有更强亲和力，(iv)具有更长的持续时间，或(v)(i)-(iv)中的任何两个或更多个的组合。例如，特异性或优先结合目标分析物的结合剂是结合目标分析物的结合域，例如，与结合不同分析物相比，具有更强的亲和力、亲合性(avidity)，更容易和/或具有更长的持续时间。结合剂可以对分析物有大约100nM、50nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM或0.01nM或更强的亲和力，如由表面等离子体共振确定的。例如，结合剂可以对分析物具有在从大约0.01nM至大约100nM、从大约0.1nM至大约100nM或从大约1nM至大约100nM的范围内的亲和力。应理解的是，优先结合到第一目标分析物的结合剂可以优先结合或可以不优先结合到第二目标分析物。照此，“优先结合”不一定要求(虽然它可以包括)排他结合。

示例性结合剂包括与目标分析物结合的酶(例如，结合底物和抑制剂)、抗体(例如，结合抗原)、抗原(例如，结合靶抗体)、受体(例如，结合配体)、配体(例如，结合受体)、核酸单链聚合物(例如，结合核酸分子以形成例如DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA双链)和合成分子。天然的、合成的、半合成的和转基因的大分子可以被用作结合剂。结合剂包括生物结合剂，例如抗体、适体、受体、酶或核酸。

如本文所使用的，除非另有说明，术语“抗体”应理解为是指完整的抗体(例如，完整的单克隆抗体)或抗体的抗原结合片段(例如，单克隆抗体的抗原结合片段)，包括已被修饰、工程改造或化学缀合的完整抗体或抗原结合片段。已被修饰或工程改造的抗体的示例包括嵌合抗体、人源化抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗原结合片段的示例包括Fab、Fab’、(Fab’)

在某些实施例中，抗体以约300pM、250pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、150pM、140pM、130pM、120pM、120pM、110pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM或10pM或更低的K

用于产生抗体以及其它蛋白质结合剂的方法在本领域中是已知的。例如，蛋白质结合剂可以从天然来源纯化或使用重组DNA技术生产。例如，对例如蛋白质结合剂进行编码的DNA分子可以被化学合成或通过重组DNA方法合成。所得的对期望的基于蛋白质的结合剂进行编码的核酸可以被并入(连接)到表达载体中，其可以通过常规转染或转化技术被引入宿主细胞。转化的宿主细胞可以在允许宿主细胞表达对感兴趣的蛋白质进行编码的基因的条件下生长。具体表达和纯化条件将根据所采用的表达系统而改变。例如，如果基因是要在大肠杆菌中表达，那么首先通过将工程改造的基因定位在合适的细菌启动子(例如，Trp或Tac)和原核信号序列的下游而被克隆到表达载体中。所表达的分泌的蛋白质积聚在折射体或包涵体中，并且可以在通过法压或超声处理使细胞破碎后被采集。然后溶解折射体，并通过本领域已知的方法重新折叠和裂解蛋白质。如果工程改造的基因要在真核宿主细胞(例如，CHO细胞)中表达，那么首先被插入包含合适的真核启动子、分泌信号、poly A序列和终止密码子的表达载体中。可以使用常规技术将基因构建体引入真核宿主细胞。此后，在允许基于蛋白质的结合剂的表达的条件下培养宿主细胞。在表达后，可以使用本领域已知的技术采集和纯化或分离多肽，包括例如亲和标签，诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，或组氨酸标签。

示例性的基于核酸的结合剂包括适体和镜像异构适体(spiegelmer)。适体是基于核酸的序列，其对特定目标分子具有强结合活性。镜像异构适体在结合亲和力和功能方面与适体相似，但具有防止酶降解的结构，这是通过使用抗核酸酶的L-寡核苷酸而不是天然产生的对核酸酶敏感的D-寡核苷酸来实现的。

适体是特异性核酸序列，其以高亲和力和特异性结合到目标分子，并通过通常称为配体进化选择性进化(SELEX)的方法进行鉴定，例如在美国专利No.5,475,096和No.5,270,163中所描述的。每个SELEX识别出的核酸配体都是给定目标化合物或分子的特异性配体。SELEX过程基于如下观察：核酸具有足够的能力来形成各种二维和三维结构，并且具有在其单体内可用的足够的化学多功能性，以对于几乎任何化合物(无论是单体还是聚合物)充当配体(形成特异性结合对)。任何大小或组成的分子都可以作为目标。

应用于高亲和力结合应用的SELEX方法涉及从候选寡核苷酸的混合物中的选择以及结合、分离和扩增的逐步迭代，使用相同的通用选择方案，以实现结合亲和力和选择性的几乎任何期望的准则。从核酸混合物(优选地包括随机序列片段)开始，SELEX方法包括以下步骤：在有利于结合的条件下使混合物与目标接触，将未结合的核酸与特异性结合目标分子的那些核酸分离，解离核酸-目标复合物，扩增从核酸-目标复合物解离的核酸以产生富含配体的核酸混合物，然后通过按期望数量的循环重复结合、分离、解离和扩增的步骤以产生对目标分子具有高度特异性的高亲和力核酸配体。因此，这个方法允许针对特定功能性(例如与给定目标分子结合)筛选核酸分子的大随机池。

SELEX方法还涵盖识别含有赋予配体改进的特性(诸如，改进的体内稳定性和蛋白酶抗性)的经修饰的核苷酸的高亲和力核酸配体。此类修饰的示例包括核糖和/或磷酸和/或碱基位置处的化学取代。SELEX过程识别出的含有经修饰的核苷酸的核酸配体在美国专利No.5,660,985和No.5,580,737中描述，其包括含有在2'位置用例如2'-氨基、2'-氟和/或2'-O-甲基部分修饰的一个或多个核苷酸的高度特异性的核酸配体。

代替使用可能要求附加修饰以变得对核酸酶活性更具抗性的适体，预期的是由L-核糖或L-2'脱氧核糖单元组成的镜像异构适体、镜像适体(参见美国专利No.8,841,431、No.8,691,784、No.8367,629、No.8,193,159和No.8,314,223)可以用于本发明的实践。与天然D-寡核苷酸适体相比，镜像异构适体中的手性转化导致血浆稳定性提高。L-核酸是天然产生的D-核酸的对映体，由于核酸酶的广泛存在，它们在水溶液中和在生物样本中不是很稳定。天然产生的核酸酶(特别是来自动物细胞的核酸酶)不能降解L-核酸。

使用体外选择，可以选择结合到目标分子(例如，D-肽)的合成对映体的寡核苷酸。得到的适体然后在L构型中重新合成，以创建镜像异构适体(来自镜像的德语“spiegel”)，它以与原始适体到镜像目标相同的亲和力和特异性结合生理目标。这种方法已用于合成结合例如铁调素(参见美国专利No.8,841,431)、MCP-1(参见美国专利No.8,691,784、No.8367,629和No.8,193,159)和SDF-1(参见美国专利No.8,314,223)的镜像异构体。

(III)盒

本文描述的传感器一旦制成就可以被包括在或以其它方式组装到盒中以供在检测系统内使用。本发明还提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的盒。该盒包括限定至少一个阱的壳体，该阱包括前述传感器中的任何一个或多个。壳体可以限定多个阱，每个阱包括前述传感器中的任何一个或多个。阱可以由基板限定(例如，与基板一体)，或者可以由部署在基板上的垫圈中形成的孔限定。

参考图15A、图15B、图16A和图16B，本文描述的传感器可以并入到盒组件(可消耗组件)400。盒组件可以包括壳体或基座410、其上部署有纳米结构的系列的晶片基板420、以及垫圈430。垫圈430在被放置在晶片基板420上时可以限定阱，其中每个阱的基座可以包括一个或多个传感器。晶片基板与壳体或基座410相互配合(interfit)，该壳体或基座410被构造为保持基板并且能够容易地插入到检测系统中。壳体或基座可以由多种不同的材料制成，例如，诸如铝之类的金属以及塑料或橡胶。壳体或基座可以具有特征(诸如成角度的角部)，以促进将其放置到传感器系统中和/或确认朝向。

垫圈430可以例如由硅树脂或塑料制成，其大小和形状被设置为放置在晶片基板上，其中开口440的尺寸被设计为与晶片基板形成阱，从而包含部署在晶片基板上或晶片基板内的传感器。限定阱的开口440的尺寸可以被设计为容纳待分析的样本的至少一部分，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或50μL。通常，阱包括由垫圈430限定的壁和由晶片基板420限定的底部，其中传感器部署在阱中的基板上。阱的直径的范围可以从600μm至90mm(例如，从1mm至80mm)并且可以具有1mm的厚度。在一些实施例中，阱可以在制造过程期间与基板一体地形成。

图17示出了根据本发明的实施例的单丛可消耗盒400和1000丛可消耗盒400'的透视图。在这些实施例中，用于单丛盒的传感器被配置为检测和/或量化单个分析物，而1000丛盒被配置为同时检测和/或量化多达1000种不同的分析物。而且，垫圈430中的阱440的尺寸和放置被调整为适应要包括在单个阱中的传感器的数量。应理解的是，本文描述的技术是可扩展的，并且可以以多种形状和大小制造盒。在某些实施例中，盒被构造为满足微孔板的生物分子筛选协会(SBS)尺寸标准，例如标准96阱微孔板。因而，晶片基板和基座都可以是矩形形状，基座的长度为128mm并且宽度为86mm，这促进与各种液体处置系统的接合以及在各种液体处理平台上的便携性。

III.系统考虑事项

本发明还提供了一种用于检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的系统。该系统包括：(a)接纳室，用于接纳前述盒中的任何一个或多个的前述传感器中的任何一个或多个；

(b)光源，用于照明至少纳米结构的第一系列和/或任何第二系列和/或任何第三系列；以及(c)检测器，用于检测至少纳米结构的第一系列和/或任何第二系列和/或任何第三系列的光学特性的改变；以及可选地(d)计算机处理器，其实现计算机算法，该计算机算法识别在第一浓度范围和可选地任何第二浓度范围之间的接合以及可选地在任何第二浓度范围和任何第三浓度范围之间的接合。

参考图18和图19，示例性传感器系统500被配置为促进感兴趣样本中分析物的检测或感兴趣样本中分析物的量的量化。传感器系统500可以包括具有触摸屏界面520和例如数据端口530的系统壳体510。壳体中的加载/卸载门540被设计大小为并且被配置为使得能够将盒400引入传感器系统的接纳室550中，该接纳室550包含例如X-Y台560，用于保持并相对于光学检测系统570定位盒。光源580被配置为通过相机/检测器590传输光。相机被配置为在使用期间定位在盒上方，并且检测部署在盒中的基板420上的至少纳米结构的第一系列、第二系列和/或第三系列的光学特性的改变。光源580被配置为照明纳米结构，例如部署在盒的晶片基板上的纳米结构。该系统可以包括计算机600，该计算机600包括用于实现用于识别第一浓度范围和/或第二浓度范围和/或第三浓度范围之间的接合以及用于量化样本中的分析物的算法的计算机处理器。传感器系统还可以包括用于控制系统的控制平台610。因而，该系统包括三个主要子组件：控制系统、成像系统和盒处置系统。这些子组件可以使用商业上可得的部件以最小化供应链的复杂性并减少组装时间。

成像系统包括光学检测系统570，其中光源580被配置为引导光通过照明器组件620和物镜630以撞击到部署在传感器的基板上的多个纳米结构上。在与传感器相互作用之后，反射光穿过物镜630并被检测器590捕获。阑(stop)640被部署在物镜630上方。阑是暗场光阑，它控制照明，包括照明如何到达基板以及图像如何传输到检测器。显微镜系统的机械管长度被指示为L1，并且范围可以从10mm至300mm。物镜的工作距离被指定为L2，并且范围可以从大约2mm至大约5mm。在某些实施例中，L1大于L2。

如图20中所示，测量可以是光学测量。例如，光源580可以被用于照射具有纳米结构20和部署在其上的分析物650的基板320，并且一个或多个检测器590被定位为检测撞击基板的光。从基板偏转的光可以在与光源相同的方向、相反的方向、正交的方向或与光源成一定角度。通过使用光学检测系统获得的图像中存在的数据可以被处理以提供样本中存在的分析物的浓度。

图21示出了与传感器和相关系统的各种实施例相关的信息学的一种方法。平均而言，给定区域中的所有纳米结构具有基本相同的构造并且在统计上具有基本相似的量或数量的分析物结合位点。因而，对于样本中分析物的给定浓度，那个区域中的每个纳米结构可以预期为结合相同数量的分子。为了使传感器具有宽动态范围，可以提供具有各种配置的纳米结构的多个数字和模拟区域。

由于样本中分析物的浓度的范围为从传感器的数字区域中的最低可检测浓度到最高可检测浓度，因此该系统被配置为检测纳米结构的量或数量，证明与分析物的结合对应的单独的色彩改变高于阈值(例如，通过从一种状态翻转到另一种状态)。表现出可检测的色彩改变或已经翻转的离散纳米结构的百分比越高，结合的分析物的数量就越高，因而，样本中分析物的浓度就越高。如图21中所描绘的，这种翻转行为可以以各种格式在视觉上呈现，包括示出数据聚类的散点图、示出数据分布的直方图等。还可以提供每个区域的比较图像，示出在暴露于样本之前以及暴露之后的特定区域的传感器。可以提供更清晰地描绘翻转确定的结果的第三注释图像。还有利地呈现数值数据，指示翻转且有效的纳米结构的绝对数量，以及翻转与有效的纳米结构的相关联比率值。特别地，“翻转的针”表示已超过阈值并被计数为阳性的传感器的数量。“总有效针”表示被计数为总群体的一部分的传感器数量。行为超出预期参数的传感器被丢弃并且不包括在后续分析中。只有剩余的传感器才被认为是“有效的”。翻转率是计算出的翻转针除以总有效针的值。还可以描绘拒绝率，即，从前图像中丢弃的针的百分比。这被用作传感器质量/健康情况的测量。拒绝率值约为10％或更高的传感器被认为质量差，并且一般无法提供可靠的数据。

但是，在一些更高的阈值浓度，所有的数字区域纳米结构已结合分析物。传感器的数字区域实际上已经变得饱和。所有纳米结构都翻转了，并且没有明显的局部色彩改变。在这一点，注意力移到一般具有更大的纳米结构和更多的结合位点的模拟区域。

给定纳米结构的色彩改变的程度可以与结合的分子的总质量与该纳米结构的总质量的比率相关。可以只能结合少于100个分子的较小模拟区域纳米结构最初可以证明冷色调(例如，在蓝色/绿色范围内)。可以能够结合几百个分子的较大模拟区域纳米结构最初可以证明较暖的色调(例如，在黄色/橙色范围内)。在模拟区域中在更高的可检测浓度，随着更多的分析物结合到给定的纳米结构，可检测的色调移至更暖。因而，未暴露的蓝色纳米结构在样本中针对特定分析物浓度的结合后表现出更呈绿色的色调。在样本中在更高的分析物浓度，色调会移至更呈黄色。类似地，在更大纳米结构和更多结合位点被配置为检测更高浓度的模拟区域中，初始未暴露的黄色纳米结构在样本中针对特定分析物浓度的结合后呈现出更橙色的色调。在样本中在更高的分析物浓度，色调会移为更呈红色。

虽然仅用单个模拟纳米结构可检测到色移，但有利地采用类似大小的纳米结构的系列或阵列的区域。通过提供类似大小的纳米结构的大的分布，平均读出可以被提供为更可靠地检测模拟区域色移，以及相应地检测到的分析物浓度。

更具体而言，图22示出了一种用于在系统级聚合传感器的一个实施例的各种数字和模拟区域的检测到的输出以跨传感器的整个动态范围可靠地检测分析物浓度的方法的流程图。使用这种形式的混合信息引擎算法允许使用离散的数字和模拟区域以可靠地拒绝来自数字区域的不准确的较高浓度数据和来自模拟区域的不准确的较低浓度数据。

在图22的步骤1中，干净传感器的各种数字和模拟区域被光学成像作为传感器的整体图像的一部分，以针对特定传感器提供每个区域及其相关联纳米结构的图像状态的可靠基线记录(例如，存在或不存在、初始色调等)。在步骤2中，传感器暴露于样本，样本中的任何分析物结合到纳米结构上的相关联位点，并且传感器随后常规地准备用于后续成像。在步骤3中，系统捕获传感器的曝光后图像，其将用于与步骤1的图像进行比较，以检测数字区域中的翻转和模拟区域中的任何色调改变。在步骤4中，算法识别传感器的不同检测区域(即，一个或多个数字区域和一个或多个模拟区域)及其相对于传感器的基准标志物的布局。这允许系统将前图像和后图像关联和对准以识别每个图像中的对应纳米结构。步骤5和6需要在每个对应区域中逐个纳米结构的基础上对前图像和后图像数据进行单独的、离散的分析。对于数字区域，步骤7A通过确认局部图像中在阈值以上的足够大的移位以识别每个已结合分析物的纳米结构来量化和计数已结合分析物的纳米结构的数量。对于模拟区域，步骤7B检测局部和跨模拟区域的色调改变，证明局部图像在前图像色彩之上足够大的移位，以认定纳米结构在局部和整体上已结合分析物。在步骤8中，假设模拟区域中的色彩改变超过预定阈值，那么模拟区域被认定为已检测到其可检测范围内的分析物浓度。与色彩改变对应的分析物的实际浓度是通过将检测到的色彩改变与存储在系统存储器中的用已知浓度的对照样本开发的标准曲线进行比较来确定的。但是，如果模拟区域中的色彩改变未能超过预定阈值，那么分析物的浓度被认定为低于该模拟区域能够可靠检测的浓度。如果更低浓度配置的模拟区域是可用的，那么可以执行类似的分析。否则，系统依赖于传感器的数字区域中翻转的纳米结构的数字计数。与翻转的纳米结构的量或数量对应的分析物的实际浓度是通过将翻转的数字纳米结构的数量与存储在系统存储器中的用已知浓度的对照样本开发的标准曲线进行比较来确定的。

在另一个实施例中，用于确定数字量化测量与模拟之间的转变的示例性算法包括以下步骤：(a)在施加待测试的溶液后测量相对于第一系列中的纳米结构从一种状态改变(翻转)到另一种状态的纳米结构；(b)在施加待测试的溶液后测量第二系列中纳米结构的色彩空间改变；以及(c)如果第二系列的色彩空间改变大于预选阈值，那么使用步骤(b)中识别出的模拟测量，如果第二系列的色彩空间改变小于预选阈值，那么使用步骤(a)中识别出的数字测量。

预期的是基于纳米结构和结合剂以及其它试剂的选择，有可能同时检测和/或量化多种分析物。例如，如图23A中所示，传感器可以包括基板420，该基板420上部署有纳米结构700的第一系列和纳米结构710的第二系列，它们可以结合两种分离且不同的分析物。预期的是基板可以取决于待检测的分析物的数量而包含纳米结构的多个系列。类似地，如图23B中所示，传感器可以包括基板，该基板上部署有结合两种分离且不同的分析物的两种不同纳米结构700、710的系列。预期的是纳米结构的系列可以包含结合到附加分析物的纳米结构。

IV.测定

本发明还提供了一种检测感兴趣样本中分析物的存在或量化感兴趣样本中分析物的量的方法。该方法包括：(a)将样本的至少一部分施加到前述传感器中的任何一个或多个；以及(b)检测纳米结构的第一系列和/或任何第二系列和/或任何第三系列的光学特性的改变，从而检测样本中分析物的存在或量化样本中分析物的量。

传感器可以检测多种样本(例如体液、组织提取物和/或细胞上清液)的分析物。示例性体液包括例如血液、血清、血浆、尿液、脑脊液或间质液。

该方法包括将至少一部分样本与本文所述的结构、传感器、盒或系统组合，并检测分析物与结构、传感器、盒或系统的结合的存在和/或量化其量。例如，在分析物与本文所述的纳米结构或纳米结构的系列结合之后，分析物的结合可以通过纳米结构或纳米结构的系列的光学可检测特性的改变来检测。在某些实施例中，光学可检测特性是色彩、光散射、折射或共振(例如，表面等离子体共振、电共振、电磁共振和磁共振)。在某些实施例中，电磁辐射可以施加到纳米结构或纳米结构的系列，并且所施加的电磁辐射可以随着纳米结构或纳米结构的系列与被怀疑含有分析物的样本相互作用而改变。例如，分析物的存在可以导致强度、色彩或荧光的改变。

在另一个实施例中，该方法包括将样本的一部分施加到包括第一区域和第二区域的传感器。第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列。第二区域包括能够结合分析物并产生指示在不同的第二浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的不同的纳米结构的第二系列。例如，使用电磁辐射来探询区域以检测来自纳米结构的第一系列和第二系列的可检测信号，该信号指示样本中分析物的存在和/或量。然后可以从可检测信号确定分析物的存在和/或量，从而跨第一浓度范围和第二浓度范围检测样本中分析物的存在或量化样本中分析物的量。

在另一个实施例中，该方法包括将样本的一部分施加到包括第一区域和第二区域的传感器。第一区域包括能够结合分析物并产生指示在第一浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的纳米结构的第一系列，其中第一系列的结合分析物的个体纳米结构在结合分析物后被光学检测，由此样本中分析物的浓度如果在第一浓度范围内则根据第一系列中的已结合分析物分子的个体纳米结构的数量来确定。第二区域包括能够结合分析物并产生指示在不同的第二浓度范围内的样本中分析物的浓度的可检测信号的不同的纳米结构的第二系列，其中样本中分析物的浓度如果在第二浓度范围内则通过根据分析物浓度的第二区域中纳米结构的光学可检测特性的基本均匀改变的模拟检测来确定。例如，使用电磁辐射来探询区域以检测来自纳米结构的第一系列和第二系列的可检测信号，该信号指示样本中分析物的存在和/或量。然后可以从可检测信号确定分析物的存在和/或量，从而跨第一浓度范围和第二浓度范围检测样本中分析物的存在或量化样本中分析物的量。

在示例性测定中，纳米结构或纳米结构的系列用结合感兴趣的分析物的结合剂(例如，抗体)官能化。在官能化之后，如果分析物存在于样本中，那么在允许结合剂形成结合剂-分析物复合物的条件下将包括目标分析物的样本(例如，流体样本)添加到纳米结构或纳米结构的系列中。分析物与抗体的结合导致纳米结构或纳米结构的系列的光学可检测特性的改变。预期的是对于某些测定，例如，无标记测定，结合剂-分析物复合物的形成单独导致纳米结构或纳米结构的系列的光学可检测性质的改变。对于其它测定，例如，基于标记的测定，与分析物形成复合物的第二结合剂还可以包括在复合物中直接或间接导致或增加纳米结构或纳米结构的系列的光学可检测特性的改变的标记。预期的是纳米结构可以检测分析物的存在和/或量，而不必使粒子或珠子附接到纳米结构或以其它方式与纳米结构相关联。

在示例性夹心免疫测定中，纳米结构或纳米结构的系列用结合感兴趣的分析物的第一结合剂(例如，第一抗体)官能化。在官能化之后，如果分析物存在于样本中，那么在允许第一结合剂形成第一结合剂-分析物复合物的条件下将要分析目标分析物的存在和/或量的样本(例如，流体样本)添加到纳米结构或纳米结构的系列中。然后，在允许第二结合剂形成第二结合剂-分析物复合物的条件下，将结合感兴趣的分析物的第二结合剂(例如，第二抗体)添加到纳米结构或纳米结构的系列。分析物与第一结合剂和第二结合剂的结合产生以“夹心”构造的复合物。夹心复合物的形成可以导致纳米结构或纳米结构的系列的光学可检测特性的改变。但是，预期的是对于某些测定，例如，无标记测定，夹心复合物的形成单独导致纳米结构或纳米结构的系列的光学可检测特性的改变。对于其它测定，例如，基于标记的测定，夹心复合物中的第二结合剂可以包括直接或间接导致或增加纳米结构或纳米结构的系列的光学可检测特性改变的标记。

图24描绘了示例性测定，由此分析物650与固定在纳米结构20上的结合剂750相互作用。纳米结构的捕获能力由纳米结构和可用的捕获剂之间的尺寸关系确定。图25描绘了示例性测定，其中纳米结构20与结合的分析物650之间的比率为1:1(左面板)，纳米结构与结合的分析物之间的比率为1:2(中间面板)，以及纳米结构与结合的分析物之间的比率为1:5(右面板)。图26描绘了示例性测定，其中纳米结构20的数量多于分析物650，在这种情况下，每个纳米结构可能捕获至多一种分析物。纳米结构20可以用纳米制造技术在基板上直接制造，如上面所讨论的。图27描绘了部署在硅基板320上的纳米制造的纳米结构20，其中分析物650结合到纳米结构的一部分。分析物与纳米结构之间的结合发生在固体界面上。可以测量纳米结构以确定其表面上结合分析物的数量。图24-图27描绘了无标记免疫测定的示例，其中使用单个结合剂(例如，抗体或适体)来结合目标分析物。这种方法可以被用于测量或以其它方式量化结合亲和力、结合动力学(附着和脱离(on and off)速率)等。

图28描绘了示例性的无标记免疫测定，其中多个第一抗体(Ab1)固定在纳米结构20的流体暴露表面上。此后，包括待检测和/或量化的分析物(0)的样本或者单独地或者与结合分析物的第二抗体(Ab1)联合地与纳米结构接触，优选地经由不同的第二表位。第二抗体(Ab2)可以在分析物之后添加。两种抗体(Ab1和Ab2)和分析物(0)(如果存在)形成固定在纳米结构20的表面上的复合物。复合物与纳米结构的结合可以造成纳米结构的特性的改变，这种改变可以用检测系统检测。图29描绘了示例性的基于标记的免疫测定，其基本上如上文与图28关联描述的执行，不同之处在于，在这个实施例中，第二抗体被标记。复合物与纳米结构20的结合可以经由标记760或者直接地(例如，经由金标记)或者间接地(例如，经由产生进一步产物的酶)检测以造成可以用检测系统检测的纳米结构的特性的改变。

在替代测定中，将要分析目标分析物的存在和/或量的样本(例如，流体样本)用以下进行培养：(i)如果分析物存在于样本中，在允许第一结合剂形成第一结合剂-分析物复合物的条件下，第一结合剂(例如，抗体)，以及(ii)在允许第二结合剂形成第二结合剂-分析物复合物的条件下，结合感兴趣的分析物的第二结合剂(例如，第二抗体)。分析物与第一结合剂和第二结合剂的结合产生以“夹心”构造的复合物，其在溶液中游离存在。然后，取决于测定，在使得复合物或其组分由纳米结构或纳米结构的系列结合以产生纳米结构或纳米结构的系列的特性(例如，光学可检测特性)的改变的条件下，复合或未复合的第一结合剂、第二结合剂和/或分析物被添加到纳米结构或纳米结构的系列。在某些实施例中，抗体中的一种或两种抗体用生物素标记，并且如果任何纳米结构或纳米结构的系列已经用例如亲和素或生物素官能化，那么夹心复合物可以变为固定在表面上。

通常，当结合剂是抗体时，然后在每个测定步骤之间，可以用温和的洗涤剂溶液清洗已结合分析物的纳米结构。典型的方案还包括一个或多个封闭步骤，这涉及使用非特异性结合蛋白，诸如牛血清蛋白或酪蛋白来封闭或减少蛋白质试剂与纳米结构的不期望的非特异性结合。

用在基于标记的测定中的示例性标记包括放射性标记、荧光标记、视觉标记、酶标记或其它在诊断或预后测定中有用的常规可检测标记，例如粒子，诸如乳胶或金粒子，或诸如乳胶或金溶胶粒子。示例性酶标记包括例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和葡萄糖氧化酶(GO)。当标记是酶时，测定包括添加合适的酶底物，其产生导致纳米结构或纳米结构的系列的光学可检测特性的改变的信号。底物可以是例如显色底物或荧光底物。HRP的示例性底物包括OPD(邻苯二胺二盐酸盐；与HRP反应后变为琥珀色)、TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺；与HRP反应后变为蓝色)、ABTS(2,2'-联氮-双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐；与HRP反应后变为绿色)，2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)；3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)；3,3'二氨基联苯胺(DAB)；StayYellow(AbCam TM产品)；以及4-氯-1-萘酚(4-CN，或CN)。碱性磷酸酶的示例性底物包括PNPP(对硝基苯基磷酸二钠盐；与碱性磷酸酶反应后变为黄色)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)和对硝基蓝氯化四氮唑(NBT)；Stay Green(AbCam TM产品)；以及4-氯-2-甲基苯并重氮(也称为FastRed)。β-Gal的示例性底物包括邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-BD-吡喃半乳糖苷(X-Gal)。GO的示例性底物包括2,2',5-5'-四-对硝基苯基-3,3'-(3,3'-二甲氧基-4,4'-亚联苯基)-二氯化四唑(t-NBT)。优选的酶具有快速且稳定的周转率。

当期望时，标记和结合剂可以通过链接物(例如，可裂解(cleavable)链接物，例如光可裂解链接物、酶可裂解链接物)链接，例如共价关联。光可裂解链接物是可以通过暴露于电磁辐射(例如，可见光、UV光或红外光)而裂解的链接物。光可裂解链接物所必需的光的波长取决于所使用的光可裂解链接物的结构。示例性光可裂解链接物包括但不限于含有邻硝基苄基部分、对硝基苄基部分、间硝基苄基部分、硝基二氢吲哚部分、溴羟基香豆素部分、溴羟基喹啉部分、羟基苯酰基部分、二甲氧基苯偶姻部分，或其任何组合的化学分子。示例性酶可裂解链接物包括但不限于DNA、RNA、肽链接物、β-葡糖苷酸链接物或其任何组合。

图30图示了示例性分析物量化测定，其包括用生物素标记的第一抗体(Ab1)和用HRP标记的第二抗体(Ab2)。在这个阶段，两种抗体都没有固定在纳米结构上。例如，每个抗体在分析物上经由单独表位结合到目标分析物。第一抗体、第二抗体和分析物的培养导致夹心复合物的形成(参见步骤1)。然后，夹心复合物由结合到与Ab1缀合的生物素的亲和素或链霉亲和素涂覆的表面(例如，链霉亲和素涂覆的珠子)捕获(参见步骤2)。预期的是，与以其他方式通过用预先固定(例如，涂覆)在固体表面上的抗体直接捕获分析物而将捕获的相比，这种捕获策略捕获更多的分析物。在清洗步骤之后，在期望的情况下，Ab2通过改变溶液条件(例如，通过改变pH、盐浓度或温度)而从链霉亲和素表面洗脱(参见步骤3)，然后施加于活化(但未官能化)的纳米结构或活化的纳米结构的系列(参见步骤4)，因此洗脱的Ab2分子由活化的纳米结构捕获。HRP底物(例如，TMB)然后被施加于纳米结构或纳米结构的系列，其然后被催化转化为在纳米结构或纳米结构的系列上形成的产物(例如，沉淀物)，这产生可检测的信号(参见步骤5)，该可检测的信号然后可以由系统检测(参见步骤6)。

图31图示了另一种示例性分析物量化测定，包括用生物素标记的第一抗体(Ab1)和用HRP标记的第二抗体(Ab2)。Ab1经由光可裂解链接物共价链接到生物素。每个抗体结合到目标分析物。第一抗体、第二抗体和分析物的培养导致夹心复合物的形成(参见步骤1)。然后夹心复合物由与Ab1上的生物素结合的亲和素或链霉亲和素涂覆的表面(例如，链霉亲和素涂覆的珠子)捕获(参见步骤2)。在富集和清洗之后，在期望的情况下，光可裂解链接物被裂解，从而从链霉亲和素表面去除夹心复合物(参见步骤3)，复合物被施加于活化的纳米结构或活化的纳米结构的系列(参见步骤4)，由此Ab2或含有复合物的Ab2由(一个或多个)活化的纳米结构捕获。HRP底物(例如，TMB)然后被施加于纳米结构或纳米结构的系列，其然后被催化转化为在纳米结构或纳米结构的系列上形成的产物(例如，沉淀物)，这产生可检测的信号(参见步骤5)，该可检测的信号然后可以由系统检测(参见步骤6)。

图32图示了另一种示例性的分析物量化测定，其包括用生物素标记的第一抗体(Ab1)和用生物素标记的第二抗体(Ab2)。每个抗体结合到目标分析物。第一抗体、第二抗体和分析物的培养导致夹心复合物的形成(参见步骤1)。然后，夹心复合物由与Ab1或Ab2上的生物素结合的亲和素或链霉亲和素涂覆的表面(例如，链霉亲和素涂覆的珠子)捕获(参见步骤2)。然后，添加经由光可裂解链接物与链霉亲和素共价链接的HRP(步骤3)，其结合到Ab1或Ab2上的游离生物素。在富集和清洗之后，在合适的情况下，光可裂解链接物被裂解以释放HRP，其然后被施加到活化的纳米结构或活化的纳米结构的系列上并由活化的纳米结构或活化的纳米结构的系列捕获(参见步骤4)。添加HRP底物在纳米结构或纳米结构的系列的表面上产生产物(例如，沉淀物)，这产生可检测的信号(参见步骤5)，该可检测的信号然后可以由系统检测(参见步骤6)。

图33图示了另一种示例性的分析物量化测定，其包括用生物素标记(例如，共价耦合到生物素)的第一抗体和用寡核苷酸标记(例如，共价耦合到生物素)的第二抗体。寡核苷酸通过位于寡核苷酸一端的可裂解链接物链接到抗体，并且另一端可选地含有可检测的标记(例如，荧光团或酶)。可裂解链接物可以是插入寡核苷酸一端的尿嘧啶或多个尿嘧啶。寡核苷酸可以作为步骤1中目标分析物的条形码。这可以用结合到不同分析物的抗体执行，以促进多重反应。每种抗体结合到目标分析物，如果在样本中存在。第一抗体、第二抗体和分析物的培养导致夹心复合物的形成(参见步骤1)。并行地，纳米结构或纳米结构的系列可以用与寡核苷酸互补的寡核苷酸官能化，该寡核苷酸充当每个待检测的分析物的条形码(参见步骤1')。夹心复合物然后由与第一抗体上的生物素结合的链霉亲和素涂覆的表面(例如，链霉亲和素涂覆的珠子)捕获(参见步骤2)。在富集和清洗之后，在合适的情况下，每个复合物中的寡核苷酸可以通过可裂解链接物的裂解而被释放(参见步骤3)，其被施加到附接于纳米结构或纳米结构的系列的互补寡核苷酸上并被由附接于纳米结构或纳米结构的系列的互补寡核苷酸捕获(参见步骤4)，其然后由系统检测(步骤5)。分析物的身份和/或浓度可以从由部署在纳米结构的表面上的互补寡核苷酸捕获的条形码寡核苷酸确定。

图34图示了用于示例性多重检测测定的试剂。例如，多个单独的珠子用结合到对应的多个目标分析物的对应的多个捕获抗体Ab1、Ab2、Ab3等涂覆(图34A)。对应的多种检测抗体经由可裂解(例如，光可裂解)链接物用寡核苷酸(分析物的条形码)标记(参见图34B)，然后与粒子组合。图34C表示具有2×5纳米结构阵列的传感器，其中不同区域包含与对应条形码寡核苷酸互补的捕获寡核苷酸。珠子与样本组合并混合。在允许形成夹心复合物之后，清洗珠子并且通过可裂解链接物的裂解释放寡核苷酸。释放的条形码寡核苷酸(带有或不带有标记)然后被施加到具有捕获寡核苷酸的区域(参见图34D)的传感器，其在适当情况下被捕获和检测。抗体涂覆的珠子的数量、寡核苷酸标记的抗体的数量和寡核苷酸印记的区域的数量可以根据要执行的期望测定进行缩放。

贯穿本描述，当组合物(例如，传感器、盒或系统)被描述为具有、包括或包含特定部件时，或者当过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，预期的是，附加地，存在基本上由所列举的部件组成或由所列举的部件组成的本发明的组合物，并且存在基本上由所列举的处理步骤组成或由所列举的处理步骤组成根据本发明的过程和方法。

在本申请中，当元件或部件被称为包括在和/或选自所列举的元件或部件的列表时，应当理解的是，该元件或部件可以是所列举的元件或部件中的任何一个，或者元件或部件可以选自由所列举的元件或部件中的两个或更多个组成的组。

另外，应当理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本文描述的组合物(例如，传感器、盒或系统)或方法的要素和/或特征可以以多种方式组合，无论在本文是明确的还是隐含的。例如，当提及特定特征时，该特征可以用在本发明的组合物的各种实施例中和/或本发明的方法中，除非从上下文另有理解。换句话说，在本申请中，已经以使得能够编写和绘制清晰简洁的申请的方式描述和描绘了实施例，但是意图并且将认识到的是实施例可以在不脱离本教导和(一个或多个)发明的情况下以各种方式组合或分离。例如，将认识到的是，本文描述和描绘的所有特征可以可适用于本文描述和描绘的(一个或多个)发明的所有方面。

应当理解的是，除非从上下文和使用中另有理解，否则表述“至少一个”单独包括该表述之后的所列举的对象中的每一个以及所列举的对象中的两个或更多个的各种组合。除非根据上下文另有理解，否则与三个或更多个列举的对象相关的表述“和/或”应当被理解为具有相同的含义。

除非另有明确说明或从上下文中理解，否则术语“包括”、“具有”或“包含”(包括其语法等价物)的使用应当一般地理解为开放式和非限制性的，例如，不排除附加的未列举的元件或步骤。

当术语“大约”在量化值之前使用时，本发明还包括特定量化值本身，除非另有特别说明。如本文所使用的，除非另有说明或推断，否则术语“大约”是指与标称值的±10％改变。

应当理解的是，只要本发明保持可操作，步骤的次序或执行某些动作的次序是无关紧要的。而且，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

本文使用的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”或“包括”)仅旨在更好地说明本发明，并不构成对本发明范围的限制，除非这样要求。说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。

以下示例仅仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围或内容。

示例1–用于结合Tau蛋白的示例性传感器的创建和测试

这个示例描述传感器的创建，该传感器对于在大约6个对数浓度的动态范围内量化样本中的Tau蛋白是有用的。

清洁并脱水硅晶片。使用化学气相沉积在硅晶片上沉积SiO

为了用抗体官能化纳米结构，在摇摆平台上将纳米结构浸入乙醇中的5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTMS)中达30分钟。使用附加的乙醇彻底冲洗芯片以洗掉芯片上过多的ATPMS。芯片在热板上固化达6小时。使用光显微镜捕获纳米结构的暗场光学图像，并将这些图像指定为前图像。

为了活化经APTMS修饰的传感器表面，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中加入5％戊二醛达一小时。在用去离子水冲洗之后，将PBS中的5μg/mL Tau抗体涂覆到传感器表面达两小时。然后在PBS中施加3％牛血清蛋白和1％酪蛋白达一小时以阻止与表面的非特异性结合。然后将不同浓度的重组Tau蛋白施加于传感器达两小时。将1μg/mL的生物素化的Tau抗体施加于传感器达1小时，以与重组Tau蛋白形成夹心。然后，0.5μg/mL链霉亲和素-HRP被添加并允许与Tau抗体上的生物素基团结合达30分钟。四甲基联苯胺(TMB)被用于在夹心上形成不溶性质量。质量的改变引起与Tau蛋白结合的纳米结构的色彩改变。

在冲洗芯片之后，拍摄纳米结构的暗场图像，将其指定为后图像。所得传感器的图像(和数据输出)在图3B、图35和图37中示出。

数字部分中纳米结构的后图像的系列在图35中以不同Tau浓度示出。阳性率由从一种状态翻转到另一种状态的纳米结构的百分比限定。随着浓度增加，阳性率也增加(参见图36)。当浓度达到大约1ng/mL时，大多数纳米结构都经历了色彩翻转，因此，增加分析物浓度不再改变阳性率(如图36中所示)。

在前图像与后图像之间比较模拟部分中纳米结构的色调值。色调变化量的直方图在图37中示出。当分析物的浓度低(例如，小于1ng/mL)时，色调变化量接近于零。在这些浓度范围内，来自图36的阳性翻转用作分析物浓度的指示器。随着图36中浓度增加到1ng/mL以上，色调变化量开始增加，如图38中所示。因此，通过组合数字和模拟分析，可以在从1pg/mL至1μg/mL(大约6个数量级)的大动态范围内测量Tau蛋白浓度。在这个测定中，检测到低至1pg/mL的Tau蛋白。

示例2–用于结合IL-6的示例性传感器的创建和测试

这个示例描述结合IL-6的纳米结构的创建和测试。

基本上如示例1中所述创建传感器。但是，纳米结构是用IL-6抗体而不是Tau抗体官能化的。用HRP标记的第二IL-6抗体(目标为与第一抗体不同的表位)形成夹心。反应基本上如示例1中所述执行并且结果在图39中示出。

如图39中所示，数字和模拟检测方法的组合允许对7pg/mL至1μg/mL范围内的IL-6蛋白进行量化。

对于回收率分析，制备7pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、75pg/mL和125pg/mL的IL-6浓度并将其加入缓冲溶液中。图39中所示的标准曲线被用于量化检测到的IL-6分子。发现加标回收率至少为95％。

示例3–使用示例性传感器检测不同培养基中的IL-6、TNF和C反应蛋白(CRP)

这个示例证明示例性纳米结构可以被用于检测血浆中的IL-6和TNF，以及细胞培养基中的CRP。

除了针对给定的目标分析物选择捕获和检测抗体之外，基本上如示例1和示例2中所述创建和测试具有官能化纳米结构的传感器。结果在图40A、图40B和图40C中阐述，这些图示出纳米结构能够检测IL-6(血浆中)、TNF(血浆中)和CRP(细胞培养基中)，每条标准曲线具有根据分析物浓度的良好的线性性。

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