一种增强植物抗旱性蛋白VaPBP2-L及应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，特别涉及一种增强植物抗旱性蛋白VaPBP2-L及其编码基因与应用。

背景技术

随着近年来全球气候变暖不断加剧，干旱胁迫已成为造成作物减产的主要非生物胁迫之一，我国由于干旱造成的粮食损失占全部自然灾害的50％以上。因此，解决干旱问题是实现农业可持续发展的重要挑战。

传统作物抗旱育种周期长、投入大且受抗旱种质资源狭窄等因素的制约，导致当前抗旱育种进展缓慢。生物技术育种可以打破物种间限制，提供高效抗旱育种的新途径，因此，鉴定和筛选抗旱基因资源是获得抗旱转基因作物新品种的关键。目前，小豆(Vignaangularis L.)抗旱性方面的研究进展缓慢，其主要通过对小豆幼苗形态指标和生理生化测定，作为评价小豆抗旱性指标，用于鉴定和筛选抗旱小豆，如郝建军，通过以小豆为研究材料，在小豆生长过程测定其过氧化物酶、电导率等生理指标，作为抗旱指标筛选出抗旱品种。但现有在筛选小豆抗旱种质资源的同时，寻找新的抗旱基因，以及通过对抗旱基因的挖掘与分析，以将其作为有效的抗旱基因资源，用于其他作物的抗旱育种中方面的研究则较少。因此，如何在筛选和鉴定小豆的抗旱种子资源的同时，有效获取和鉴定其相关的抗性蛋白基因，为作物抗旱育种提供抗旱基因资源。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种增强植物抗旱性蛋白VaPBP2-L及其编码基因与应用，本发明通过小豆萌发种子为材料，分离出VaPBP2-L基因，将该基因构建病毒表达载体，转化到烟草后，可显著提高植株的耐旱能力；利用蛋白VaPBP2-L基因，构建各种植物表达载体，可广泛应用于转基因植物和作物抗旱新品种的培育。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种增强植物抗旱性的蛋白VaPBP2-L，该蛋白VaPBP2-L来源于小豆(Vignaangularis L.)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步说明，所述蛋白VaPBP2-L基因cDNA编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步说明，所述蛋白VaPBP2-L的PCR扩增的特异引物为：

VaPBP2-L-F1 5’-CGACGACAAGACCCTATGGCTCAGGTTCAGGTTCAG-3’；

VaPBP2-L-R1 5’-GAGGAGAAGAGCCCCTAGGAAGCATCTGCTGTGGCA-3’。

进一步说明，该蛋白VaPBP2-L的重组表达载体是通过在载体PVX-LIC的LIC1和LIC2位点间插入目的基因，获得白VaPBP2-L的重组表达载体。

一种增强植物抗旱性的蛋白VaPBP2-L在增强植物抗旱性能中的应用。

一种增强植物抗旱性的蛋白VaPBP2-L在调控烟草抗旱能力能力中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过鉴定小豆的抗旱种质资源，找到了极端耐旱的小豆种质，并以极端抗旱和极端敏感小豆种质作为材料，采用蛋白组测序方法分析干旱胁迫条件下抗旱种质与敏感种质的蛋白积累差异，从而鉴定得到抗旱性蛋白VaPBP2-L，并从抗旱小豆品种中克隆了编码VaPBP2-L的基因，通过在烟草中通过病毒表达载体超量表达，显著提高烟草的抗旱性，实现快速鉴定蛋白VaPBP2-L抗旱功能，证实了蛋白VaPBP2-L能够提高植物耐旱性，可以有效作为一种抗旱基因资源用于植物的抗旱育种，促进抗旱作物和植物新品种(系)的培育进程。

附图说明

图1为本发明实施例VaPBP2-L基因cDNA编码核苷酸序列的扩增结果。其中，M为D2000 Plus Marker，从上至下的条带大小依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp；

图2为本发明实施例导入重组质粒PVX-LIC-VaPBP2-L质粒的农杆菌PCR鉴定，1-7均为单克隆编号，H

图3为本发明实施例RT-PCR检测病毒表达载体超量表达VaPBP2-L烟草植株中VaPBP2-L的表达。M：DL2000 Plus marker；泳道1-4分别为未注射正常生长烟草，未注射干旱处理烟草，转化PVX-LIC空载体烟草，转化PVX-LIC-VaPBP2-L质粒烟草；

图4为本发明实施例超量表达VaPBP2-L烟草在干旱胁迫下的表型。图中，A中从左至右分别为干旱处理前(0d)未注射烟草、未注射烟草、转化PVX-LIC空载体烟草，转化PVX-LIC-VaPBP2-L质粒烟草。B中从左至右分别为未注射烟草正常生长15d、未注射烟草干旱处理15d、转化PVX-LIC空载体烟草干旱处理15d、转化PVX-LIC-VaPBP2-L质粒烟草干旱处理15d。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1-蛋白VaPBP2-L及其编码基因与重组表达载体的获取

(1)以9.0％甘露醇胁迫处理36h小豆种子为材料，提取总RNA，并反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，在引物VaPBP2-L-F1和引物VaPBP2-L-R1的引导下，用常规PCR法进行扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1511bp的DNA片段，如图1所示；

(2)采用LIC(非连接反应式克隆)反应，将基因片段连接到载体PVX-LIC(在载体PVX-LIC的T-DNA片段上含有致死基因ccdB，其两侧含LIC反应的识别序列，该载体为实验室自有，文献：Zhao J,Liu Q,Hu P,et al(2016)An efficient Potato virus X-basedmicroRNA silencing in Nicotiana benthamiana.Sci Rep 6:20573)，获得重组载体PVX-LIC-VaPBP2-L，经测序证实，该重组载体PVX-LIC-VaPBP2-L为在载体PVX-LIC的LIC1和LIC2位点间插入了目的基因，即，SEQ ID NO.2所示1511bp的DNA片段，如图2所示；将SEQ IDNO.2的核苷酸序列的编码基因命名为VaPBP2-L，该基因编码具有SEQ ID NO.1所示的由503个氨基酸组成的蛋白VaPBP2-L。

上述PCR扩增引物的序列如下：

VaPBP2-L-F1 5’-CGACGACAAGACCCTATGGCTCAGGTTCAGGTTCAG-3’

VaPBP2-L-R1 5’-GAGGAGAAGAGCCCCTAGGAAGCATCTGCTGTGGCA-3’

蛋白VaPBP2-L的氨基酸序列如下，由503个氨基酸组成：

1 MAQVQVQPQN AMPGPNGAAA AAGGNQFVTT SLYVGDLDPN VTDSQLYDLF SQLGQVVSVRVCRDLTSRRS LGYGYVNYSN

81 PQDAARALDV LNFTPLNNKP IRIMYSHRDP CIRKSGAGNI FIKNLDRAID HKALHDTFSTFGNILSCKVA TDSSGQSKGY

161 GFVQFDNEES AQKAIEKLNG MLLNDKQVYV GPFLRKQERE TAIDKAKFNN VFVKNLADSTSDDELKTIFG EFGTITSAVV

241 MRDGDGKSKC FGFVNFENAD DAARAVEALN GKKFDDKEWY VGKAQKKSER ENELKQRFEQSMKEAADKYQ GANLYVKNLD

321 DSISDDKLKE LFSPFGTITS CKVMRDPNGV SRGSGFVAFS TPEEASRALS EMNGKMVVSKPLYVTLAQRK EDRRARLQAQ

401 FAQMRPVGMP PSVGPRVPMY PPGGPGIGQQ IFYGQGPPAI IPSQAGFGYQ QQLVPGMRPGAAPVPNFFVP MVQQGQQGQR

481 PGGRRAVQQS QQPVPMMPQQ MLP

蛋白VaPBP2-L基因cDNA编码核苷酸序列如下，编码长度为1511bp：

1ATGGCTCAGG TTCAGGTTCA GCCTCAGAAT GCGATGCCCG GTCCCAACGG TGCTGCTGCTGCTGCTGGGG GAAACCAGTT

81 CGTTACGACA TCGCTTTACG TCGGAGATCT CGACCCCAAC GTCACGGACT CACAGCTTTATGACCTGTTC AGTCAATTGG

161 GCCAAGTTGT GTCTGTTAGG GTTTGCAGGG ACTTGACCAG CCGAAGATCG CTCGGTTACGGCTATGTCAA CTATAGCAAC

241 CCCCAAGATG CTGCCAGAGC ATTAGATGTT CTGAATTTCA CTCCTCTCAA CAACAAGCCCATCCGAATTA TGTATTCACA

321 TCGTGATCCC TGTATCCGGA AAAGTGGGGC AGGAAATATT TTTATCAAGA ATTTGGATAGGGCAATTGAC CACAAGGCAT

401 TACATGATAC CTTCTCTACA TTTGGGAATA TCCTTTCATG CAAGGTAGCA ACGGATTCATCTGGGCAATC AAAAGGATAT

481 GGTTTTGTTC AGTTTGATAA TGAGGAATCT GCCCAAAAAG CCATAGAGAA GCTGAATGGTATGCTGTTGA ATGATAAGCA

561 AGTGTATGTG GGACCCTTCC TTCGCAAGCA AGAGAGAGAG ACTGCTATTG ACAAGGCAAAATTCAATAAT GTTTTTGTAA

641 AGAATCTAGC AGATTCGACT AGTGATGATG AATTGAAGAC AATTTTTGGT GAATTTGGAACTATTACTAG TGCTGTAGTG

721 ATGAGGGATG GAGATGGGAA ATCAAAGTGC TTTGGGTTTG TGAATTTTGA GAATGCTGATGATGCTGCTA GGGCTGTTGA

801 GGCTCTCAAT GGCAAAAAAT TTGATGATAA GGAATGGTAC GTTGGAAAAG CTCAGAAGAAATCTGAAAGG GAGAATGAAT

881 TGAAACAACG ATTTGAGCAG AGCATGAAAG AAGCTGCTGA TAAATATCAA GGGGCAAACTTGTATGTCAA AAATTTGGAT

961 GATAGCATTA GTGATGATAA ACTTAAGGAG CTGTTCTCCC CTTTTGGTAC CATCACCTCTTGCAAGGTTA TGAGGGACCC

1041 AAATGGCGTT AGTCGTGGAT CTGGATTTGT TGCATTCTCA ACTCCTGAGGAGGCATCTAG AGCACTCTCT GAGATGAATG

1121 GGAAAATGGT GGTAAGTAAA CCTCTGTATG TGACTCTAGC CCAAAGGAAAGAAGATAGAA GAGCTAGACT GCAGGCTCAG

1201 TTTGCTCAAA TGCGACCTGT TGGAATGCCA CCATCTGTTG GTCCTCGTGTGCCAATGTAT CCTCCAGGTG GTCCAGGTAT

1281 TGGTCAACAA ATATTTTATG GCCAAGGCCC TCCTGCTATC ATTCCTTCCCAGGCCGGATT TGGTTACCAA CAACAACTTG

1361 TGCCTGGTAT GAGGCCAGGT GCAGCTCCTG TGCCAAATTT CTTTGTGCCAATGGTTCAGC AGGGACAACA GGGCCAGCGC

1441 CCTGGTGGAA GGCGTGCAGT CCAGCAGTCC CAGCAGCCAG TTCCAATGATGCCACAGCAG ATGCTTCCTA G

实施例2-重组根癌农杆菌的获取

将重组载体PVX-LIC-VaPBP2-L冻融法转化根癌农杆菌GV3101，获得含有重组载体PVX-LIC-VaPBP2-L的根癌农杆菌GV3101，将该重组农杆菌命名为GV3101/PV X-LIC-VaPBP2-L；(冻融法参考Amanda M Davis，Anthony Hall，Andrew J Millar，ChiarinaDarrah and Seth J Davis，Protocol:Streamlined sub-protocols for floral-diptransformation and selection of transformants in Arabidopsis thaliana，2009，公众可从长江大学获得)。

将空载体PVX-LIC冻融法转化根癌农杆菌GV3101，获得含有空载体PVX-LIC的根癌农杆菌GV3101，将该重组农杆菌命名为GV3101/PVX-LIC。

实施例3-瞬时表达转基因烟草的获得及鉴定

(1)转基因烟草的获得

利用实施例2获得的两种重组农杆菌GV3101/PVX-LIC-VaPBP2-L和GV3101/PVX-LIC，制备农杆菌悬菌液，悬菌液中培养液与菌体体积比为1:1。本生烟种子播种于培养基质(草炭：蛭石：珍珠岩为1:3:0.5体积比混合)中，在人工温室中培养。当烟草生长到4-5叶时，开始注射最顶端完全展开的新叶。用一次性注射器分别吸取1mL菌液，将注射器针头去掉，用手指抵住叶片下部，轻轻用力将注射器内菌液压送并渗透到叶片组织中，每棵烟草注射2片叶子，GV3101/PVX-LIC-VaPBP2-L和GV3101/PVX-LIC分别注射5株植物。

注射过的烟草植株覆盖塑料薄膜避光培养24h后移至温室中，25℃，16h光照/8h黑暗的光周期下培养。以未注射农杆菌的烟草作为野生型对照，相同生长条件培养，分别得到VaPBP2-L的阳性转基因植株，转空载体植株株和野生型植株。

(2)转基因烟草的分子检测

取步骤(1)获得的VaPBP2-L的阳性转基因植株，转空载体植株和野生型植株，分别提取总RNA，反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，用特异引物VaVPAC-F2 5’-CGCTCGGTTACGGCTATG-3’和下游引物VaVPAC-R2 5’-GCTTGCGAAGGAAGGGTC-3进行RT-PCR扩增，以烟草actin为内参，引物FC 5’-CCCTCCCACATGCTATTCT-3’，RC 5’-AGAGCCTCCAATCCAGACA-3’。结果如图3所示，结果表明，转空载体植株和野生型植株中不表达目的基因VaPBP2-L；而转基因VaPBP2-L植株中目的基因VaPBP2-L表达，表明获得了VaPBP2-L瞬时表达的转基因烟草株系。

(3)转基因烟草的抗旱表型鉴定

取步骤(1)获得的转基因VaPBP2-L的烟草株系、转空载体的烟草株系和野生型株系，在注射7d后进行干旱胁迫处理，15d(土壤含水量降至7.16％)时，可观察到未注射野生型植株和空载体对照植株(empty vector)严重萎蔫，而注射PVX-LIC-VaPBP2-L基因烟草抗旱性良好，注射PVX-LIC-VaPBP2-L基因烟草在干旱条件下抗旱能力明显强于野生型和空载体表达烟草，与未注射正常生长组烟草(未干旱处理)的烟草生长效果相接近，结果如图4所示。由此表明，VaPBP2-L基因能够显著提高烟草抗旱性，该基因可用于植物或作物抗旱育种。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种增强植物抗旱性蛋白VaPBP2-L及其编码基因与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 503

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Gln Val Gln Val Gln Pro Gln Asn Ala Met Pro Gly Pro Asn

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gln Phe Val Thr Thr Ser Leu

20 25 30

Tyr Val Gly Asp Leu Asp Pro Asn Val Thr Asp Ser Gln Leu Tyr Asp

35 40 45

Leu Phe Ser Gln Leu Gly Gln Val Val Ser Val Arg Val Cys Arg Asp

50 55 60

Leu Thr Ser Arg Arg Ser Leu Gly Tyr Gly Tyr Val Asn Tyr Ser Asn

65 70 75 80

Pro Gln Asp Ala Ala Arg Ala Leu Asp Val Leu Asn Phe Thr Pro Leu

85 90 95

Asn Asn Lys Pro Ile Arg Ile Met Tyr Ser His Arg Asp Pro Cys Ile

100 105 110

Arg Lys Ser Gly Ala Gly Asn Ile Phe Ile Lys Asn Leu Asp Arg Ala

115 120 125

Ile Asp His Lys Ala Leu His Asp Thr Phe Ser Thr Phe Gly Asn Ile

130 135 140

Leu Ser Cys Lys Val Ala Thr Asp Ser Ser Gly Gln Ser Lys Gly Tyr

145 150 155 160

Gly Phe Val Gln Phe Asp Asn Glu Glu Ser Ala Gln Lys Ala Ile Glu

165 170 175

Lys Leu Asn Gly Met Leu Leu Asn Asp Lys Gln Val Tyr Val Gly Pro

180 185 190

Phe Leu Arg Lys Gln Glu Arg Glu Thr Ala Ile Asp Lys Ala Lys Phe

195 200 205

Asn Asn Val Phe Val Lys Asn Leu Ala Asp Ser Thr Ser Asp Asp Glu

210 215 220

Leu Lys Thr Ile Phe Gly Glu Phe Gly Thr Ile Thr Ser Ala Val Val

225 230 235 240

Met Arg Asp Gly Asp Gly Lys Ser Lys Cys Phe Gly Phe Val Asn Phe

245 250 255

Glu Asn Ala Asp Asp Ala Ala Arg Ala Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys

260 265 270

Lys Phe Asp Asp Lys Glu Trp Tyr Val Gly Lys Ala Gln Lys Lys Ser

275 280 285

Glu Arg Glu Asn Glu Leu Lys Gln Arg Phe Glu Gln Ser Met Lys Glu

290 295 300

Ala Ala Asp Lys Tyr Gln Gly Ala Asn Leu Tyr Val Lys Asn Leu Asp

305 310 315 320

Asp Ser Ile Ser Asp Asp Lys Leu Lys Glu Leu Phe Ser Pro Phe Gly

325 330 335

Thr Ile Thr Ser Cys Lys Val Met Arg Asp Pro Asn Gly Val Ser Arg

340 345 350

Gly Ser Gly Phe Val Ala Phe Ser Thr Pro Glu Glu Ala Ser Arg Ala

355 360 365

Leu Ser Glu Met Asn Gly Lys Met Val Val Ser Lys Pro Leu Tyr Val

370 375 380

Thr Leu Ala Gln Arg Lys Glu Asp Arg Arg Ala Arg Leu Gln Ala Gln

385 390 395 400

Phe Ala Gln Met Arg Pro Val Gly Met Pro Pro Ser Val Gly Pro Arg

405 410 415

Val Pro Met Tyr Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly Gln Gln Ile Phe

420 425 430

Tyr Gly Gln Gly Pro Pro Ala Ile Ile Pro Ser Gln Ala Gly Phe Gly

435 440 445

Tyr Gln Gln Gln Leu Val Pro Gly Met Arg Pro Gly Ala Ala Pro Val

450 455 460

Pro Asn Phe Phe Val Pro Met Val Gln Gln Gly Gln Gln Gly Gln Arg

465 470 475 480

Pro Gly Gly Arg Arg Ala Val Gln Gln Ser Gln Gln Pro Val Pro Met

485 490 495

Met Pro Gln Gln Met Leu Pro

500

<210> 2

<211> 1511

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctcagg ttcaggttca gcctcagaat gcgatgcccg gtcccaacgg tgctgctgct 60

gctgctgggg gaaaccagtt cgttacgaca tcgctttacg tcggagatct cgaccccaac 120

gtcacggact cacagcttta tgacctgttc agtcaattgg gccaagttgt gtctgttagg 180

gtttgcaggg acttgaccag ccgaagatcg ctcggttacg gctatgtcaa ctatagcaac 240

ccccaagatg ctgccagagc attagatgtt ctgaatttca ctcctctcaa caacaagccc 300

atccgaatta tgtattcaca tcgtgatccc tgtatccgga aaagtggggc aggaaatatt 360

tttatcaaga atttggatag ggcaattgac cacaaggcat tacatgatac cttctctaca 420

tttgggaata tcctttcatg caaggtagca acggattcat ctgggcaatc aaaaggatat 480

ggttttgttc agtttgataa tgaggaatct gcccaaaaag ccatagagaa gctgaatggt 540

atgctgttga atgataagca agtgtatgtg ggacccttcc ttcgcaagca agagagagag 600

actgctattg acaaggcaaa attcaataat gtttttgtaa agaatctagc agattcgact 660

agtgatgatg aattgaagac aatttttggt gaatttggaa ctattactag tgctgtagtg 720

atgagggatg gagatgggaa atcaaagtgc tttgggtttg tgaattttga gaatgctgat 780

gatgctgcta gggctgttga ggctctcaat ggcaaaaaat ttgatgataa ggaatggtac 840

gttggaaaag ctcagaagaa atctgaaagg gagaatgaat tgaaacaacg atttgagcag 900

agcatgaaag aagctgctga taaatatcaa ggggcaaact tgtatgtcaa aaatttggat 960

gatagcatta gtgatgataa acttaaggag ctgttctccc cttttggtac catcacctct 1020

tgcaaggtta tgagggaccc aaatggcgtt agtcgtggat ctggatttgt tgcattctca 1080

actcctgagg aggcatctag agcactctct gagatgaatg ggaaaatggt ggtaagtaaa 1140

cctctgtatg tgactctagc ccaaaggaaa gaagatagaa gagctagact gcaggctcag 1200

tttgctcaaa tgcgacctgt tggaatgcca ccatctgttg gtcctcgtgt gccaatgtat 1260

cctccaggtg gtccaggtat tggtcaacaa atattttatg gccaaggccc tcctgctatc 1320

attccttccc aggccggatt tggttaccaa caacaacttg tgcctggtat gaggccaggt 1380

gcagctcctg tgccaaattt ctttgtgcca atggttcagc agggacaaca gggccagcgc 1440

cctggtggaa ggcgtgcagt ccagcagtcc cagcagccag ttccaatgat gccacagcag 1500

atgcttccta g 1511

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacgacaag accctatggc tcaggttcag gttcag 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggagaaga gcccctagga agcatctgct gtggca 36

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgctcggtta cggctatg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttgcgaag gaagggtc 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctcccaca tgctattct 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agagcctcca atccagaca 19